血小板膜糖蛋白Ibα基因多態(tài)性與復(fù)發(fā)性腦梗死的分析研究

徐福平,李湘青

(淄博市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,山東 淄博 255036)

復(fù)發(fā)性腦梗死是遺傳因素、環(huán)境因素與伴發(fā)病相互作用的結(jié)果。常見環(huán)境因素為吸煙、酗酒；常見伴發(fā)病為原發(fā)性高血壓、糖尿病、高脂血癥，特別是代謝綜合征[1]。Liu等[2]根據(jù)我國卒中流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告認(rèn)為，心房顫動(dòng)、短暫性腦缺血發(fā)作、特別是原發(fā)性高血壓合并糖尿病與腦梗死的復(fù)發(fā)有關(guān)。對于遺傳易患性研究不多，有研究發(fā)現(xiàn)血小板膜糖蛋白(platelet glycoprotein,GP)受體基因多態(tài)性與腦梗死發(fā)病有關(guān)[3]。本研究主要分析復(fù)發(fā)性腦梗死與初發(fā)腦梗死患者發(fā)病時(shí)血液中血小板膜糖蛋白Ibα鏈(platelet glycoprotein，GPIbα)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variable number of tandem repeats,VNTR)的多態(tài)性的表現(xiàn)，以期了解GPIbαVNTR在腦梗死復(fù)發(fā)過程中所起的致病作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2010年2月至2011年1月淄博市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的復(fù)發(fā)性腦梗死患者作為復(fù)發(fā)組，初次腦梗死患者為初發(fā)組。復(fù)發(fā)組110例，男57例、女53例，年齡45～80(62±12)歲；初發(fā)組105例，男52例、女53例，年齡47～79(60±12)歲。兩組患者的年齡、性別等一般資料比較具有均衡性。

1.2納入排除標(biāo)準(zhǔn) 腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會第四屆全國腦血管病學(xué)術(shù)會議制訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4],全部經(jīng)頭顱CT/磁共振成像證實(shí)確診有新發(fā)的腦梗死病灶。復(fù)發(fā)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：患者原有初發(fā)癥狀和體征加重，距第一次梗死時(shí)間>1個(gè)月,本次發(fā)病有經(jīng)過影像學(xué)證實(shí)的新病灶。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除青年卒中、炎性血管病變、煙霧病、有心房顫動(dòng)史、頭頸部磁共振血管成像有明顯的大動(dòng)脈狹窄(頸內(nèi)動(dòng)脈、大腦中動(dòng)脈起始段狹窄>50%)者。

1.3研究方法

1.3.1病史、標(biāo)本采集 詳細(xì)詢問受試者心臟病、原發(fā)性高血壓、高脂血癥、糖尿病、腦血管病及吸煙史(每日10支，至少5年)。

記錄血壓、血糖、血脂及磁共振成像結(jié)果。所有受檢者禁食12 h后于清晨7:00抽取靜脈血1 mL置于放有20 μL乙二胺四乙酸抗凝劑管中備用。

1.3.2基因分析 ①提取基因組DNA：應(yīng)用北京賽百盛試劑盒，嚴(yán)格按血液DNA抽提試劑盒說明提取DNA。②DNA純度測定：應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測定DNA純度。③聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaaion，PCR)。

擴(kuò)增：上游引物為5-CAC TAC TGA ACC AAC CCC AAG-3；下游引物為5-TTG TGG CAG ACA CCA GGA TGG-3。④擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)：預(yù)變性95 ℃ 4 min；95 ℃變性45 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，擴(kuò)增38個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。⑤PCR產(chǎn)物的檢測:吸取PCR產(chǎn)物10 μL在封口膜上和上樣緩沖液2 μL充分混勻后，依次加入2%瓊脂糖凝膠的加樣孔中；吸取DNA標(biāo)志物12 μL加入一側(cè)的加樣孔中，在硼酸緩沖液中電泳40 min，放入紫外分析裝置中觀察結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，多因素分析采用Logistic回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者的臨床基本特點(diǎn) 復(fù)發(fā)組原發(fā)性高血壓、糖尿病、高脂血癥的比例較初發(fā)組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 兩組腦梗死患者的臨床基本特點(diǎn) [例(%)]

2.2GPIbα VNTR基因多態(tài)性頻率分布 GPIbα的VNTR多態(tài)性中，各等位基因間依次相差39 bp,在本研究中經(jīng)PCR擴(kuò)增后分別產(chǎn)生273 bp、234 bp、195 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為195 bp含有1個(gè)重復(fù)序列，產(chǎn)物為234 bp含有兩個(gè)重復(fù)序列,產(chǎn)物為273 bp含有3個(gè)重復(fù)序列(圖1)。未發(fā)現(xiàn)A、B等位基因純合子及AB、AC基因型，以CC、CD基因型和C、D等位基因多見?；蛐捅憩F(xiàn)為BC 25例(11.63%)、BD 7例(3.27%)、CC 87例(40.46%)、CD 73例(33.95%)、DD 23例(10.70%)，等位基因?yàn)锽 32例(7.44%)、C 272例(63.26%)、D 126例(29.30%)。

M:Marker；1:DD基因型；2、3:DC基因型；4：CC基因型；5：BC基因型；6：BD基因型

2.3兩組患者基因型分布的比較 復(fù)發(fā)組BC基因型的比例高于初發(fā)組(P<0.05)，兩組間BD、CC、CD、DD基因型比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

表2 兩組各基因型的分布 [例(%)]

2.4兩組等位基因頻率的比較 復(fù)發(fā)組B等位基因頻率高于初發(fā)組(P<0.05)，兩組間C、D基因頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

表3 兩組等位基因頻率的比較 [例(%)]

2.5Logistic回歸分析 以腦梗死復(fù)發(fā)為因變量，以原發(fā)性高血壓、高脂血癥、糖尿病、B等位基因、BC基因型為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示：B等位基因、BC基因型、原發(fā)性高血壓、糖尿病是腦梗死復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表4)。

表4 Logistic回歸分析結(jié)果

3 討 論

腦梗死具有高復(fù)發(fā)性的特點(diǎn)，由于復(fù)發(fā)率高又使其致殘率、致死率進(jìn)一步升高，預(yù)防腦梗死復(fù)發(fā)已經(jīng)引起高度關(guān)注。近十幾年來，應(yīng)用PCR技術(shù)研究血小板膜GPIbα[5]基因多態(tài)性日益成熟。GPIbα是血小板膜表面最突出的唾液酸糖蛋白，N端位于膜外區(qū)，向血流突出，含有假性血管性血友病因子(Von Willebrand factor,vWF)和凝血酶的結(jié)合位點(diǎn)，vWF結(jié)合位點(diǎn)突出于血小板表面，此結(jié)構(gòu)與其功能密切相關(guān)，合適的長度才能保證vWF與GPIb之間適度的親和力，維持正常的生理功能[6]。GPIbα有三種基因多態(tài)性，尚迎輝等[7]研究結(jié)果顯示，GPIbα人類血小板同種異體抗原2(Human platelet antigen-2，HPA-2)基因多態(tài)性與河南地區(qū)動(dòng)脈硬化性腦梗死無關(guān)。李現(xiàn)亮[8]研究顯示，GpIbα Kozak序列和HPA-2的基因多態(tài)性與腦梗死無相關(guān)性,VNTR基因多態(tài)性與腦梗死相關(guān)，認(rèn)為其DD基因型是腦梗死獨(dú)立危險(xiǎn)因素，當(dāng)D等位基因存在時(shí)，人體易于形成血栓。張愛琴等[9]認(rèn)為GpIbα Kozak存在基因多態(tài)性，并通過影響血小板的活化參與腦梗死的發(fā)生，而GpIbαHPA-2未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性。本研究結(jié)果顯示，基因型以CC(37.67%)、DD(33.95%)表達(dá)較高，基因以C(73.02%)表達(dá)較高，未發(fā)現(xiàn)A等位基因表達(dá)，BC、BD基因型和B等位基因在本研究中表達(dá)不高。復(fù)發(fā)性腦梗死組有17例表達(dá)BC基因型，初發(fā)組有4例(P<0.05)；而BD、CC、CD、DD基因型兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明BC基因型是腦梗死復(fù)發(fā)的致病基因型。這一研究結(jié)果與尚迎輝等[10]的結(jié)果一致，認(rèn)為BC基因型是動(dòng)脈硬化性腦梗死發(fā)病的危險(xiǎn)因素。本研究還發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)組B等位基因頻率顯著高于初發(fā)組(P<0.05)，說明B等位基因是腦梗死復(fù)發(fā)的致病因素。Logistic回歸分析結(jié)果顯示，高血壓、糖尿病、B等位基因、BC等位基因是腦梗死復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。

VNTR多態(tài)性與復(fù)發(fā)性腦梗死相關(guān)，其病理機(jī)制可能是BC基因型、B等位基因不同，使GPIbα與vWF結(jié)合位點(diǎn)延伸有關(guān)，因這種結(jié)構(gòu)的改變影響了GPIbα與vWF的親和力，導(dǎo)致血小板的黏附、聚集和活化反應(yīng)，特別是在高血流高切應(yīng)力作用時(shí)(如動(dòng)脈狹窄或痙攣的動(dòng)脈)，GPIbα復(fù)合物與vWF因子結(jié)合使血小板活化聚集形成血栓，血栓的形成使管腔進(jìn)一步狹窄，高切應(yīng)力進(jìn)一步增加，形成惡性循環(huán)，從而不需要其他的激動(dòng)劑就能再次激活血小板，臨床可表現(xiàn)為進(jìn)展性腦卒中，復(fù)發(fā)性腦卒中[11]。Baker等[12]對阿司匹林治療失敗，腦梗死復(fù)發(fā)患者的基因因素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，BC基因型是阿司匹林治療失敗復(fù)發(fā)性腦梗死的獨(dú)立因素。

近年來我國各地區(qū)對血小板膜GPIbαVNTR基因多態(tài)性的研究結(jié)果均確定其與腦梗死相關(guān)，但基因型和等位基因結(jié)果差異較大，有望通過對GPIbα基因多態(tài)性的研究，針對GPIbα及vWF的抗血小板藥物的研制，為預(yù)防腦梗死復(fù)發(fā)提供理論依據(jù)。

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