高效液相色譜法測定硝苯地平片含量的方法學(xué)研究

趙靈芝，劉春葉，王海洋，苗延青，張雪嬌

(西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

硝苯地平是第一代鈣拮抗劑，為抗高血壓、防治心絞痛藥物，是20世紀(jì)80年代中期的暢銷藥物之一。該藥的特點是起效快、峰/谷比值高，導(dǎo)致了神經(jīng)體液活化，經(jīng)多年臨床使用，療效得到了肯定[1-4]。中國藥典二部(2005年版)中收載的硝苯地平片含量測定方法為紫外可見分光光度法[5-7]，該法較繁瑣，并且分次定量轉(zhuǎn)移時容易造成損失;此外，硝苯地平遇光極不穩(wěn)定，分子內(nèi)部易發(fā)生光化學(xué)歧化作用而降解為硝基苯吡啶衍生物及亞硝基苯吡啶衍生物，因此，用紫外可見分光光度法測定硝苯地平的含量可導(dǎo)致測定結(jié)果偏高。為客觀、準(zhǔn)確地反映硝苯地平片的實際含量，作者參照已報道硝苯地平的測定方法[8-12]，建立測定硝苯地平片含量的HPLC法，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，擬為進(jìn)一步完善硝苯地平片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和合理利用提供理論依據(jù)。

1 實驗

1.1 試藥、試劑與儀器

硝苯地平標(biāo)準(zhǔn)對照品，中國藥品生物制品檢定所；硝苯地平片：(1)江蘇制藥股份有限公司，揚(yáng)子江藥業(yè)，批號：12031501、12072701、12083001，規(guī)格：每片10 mg；(2)南京白敬宇制藥有限責(zé)任公司，利煥藥業(yè)，批號：110911、120307、120601，規(guī)格：每片10 mg；(3)浙江泰利森制藥有限公司，納欣同藥業(yè)，批號：120302、120406、121008，規(guī)格：每片20 mg。

甲醇，色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；純凈水，娃哈哈食品有限公司。

Agilent 1260型高效液相色譜儀，安捷倫科學(xué)儀器有限公司；UV-2102 Pcs型紫外可見分光光度計，上海優(yōu)尼科儀器有限公司；YP50001型電子分析天平，上海越平科學(xué)儀器有限公司；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵，鞏義予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 色譜條件[8-12]

色譜柱：Agilent C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫25 ℃；流動相：甲醇-水(60∶40，體積比)，流速0.8 mL·min-1；檢測波長235 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.3 方法

1.3.1 硝苯地平對照品儲備液的制備

精密稱取硝苯地平對照品0.0050 g，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，搖勻，得0.5 mg·mL-1硝苯地平對照品儲備液，在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 硝苯地平供試品溶液的制備

取硝苯地平10片，除去糖衣，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量置于燒杯中，加甲醇適量超聲溶解，過濾，取續(xù)濾液定容于10 mL容量瓶中，得供試品溶液。

1.3.3 定量限實驗

將硝苯地平對照品儲備液分別稀釋5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍，得濃度為100 μg·mL-1、50 μg·mL-1、25 μg·mL-1、17 μg·mL-1、12.5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、8.3 μg·mL-1的對照品溶液，在1.2色譜條件下進(jìn)行檢測。

1.3.4 檢測限實驗

將硝苯地平的對照品儲備液分別稀釋40倍、60倍、80倍、100倍，得濃度為12.5 μg·mL-1、8.3 μg·mL-1、6.25 μg·mL-1、5 μg·mL-1的對照品溶液，在1.2色譜條件下進(jìn)行檢測。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用移液管精密移取硝苯地平對照品儲備液(c=0.5 mg·mL-1)250 μL、500 μL、1 mL、2 mL、4 mL、8 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成濃度分別為12.5 μg·mL-1、25 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1、200 μg·mL-1、400 μg·mL-1的硝苯地平標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.2色譜條件下進(jìn)行檢測。

1.3.6 精密度實驗

精密移取硝苯地平對照品儲備液1 mL，用甲醇定容到10 mL容量瓶中，得50 μg·mL-1硝苯地平對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算RSD值。

精密移取硝苯地平對照品儲備液250 μL，用甲醇定容到10 mL容量瓶中，得12.5 μg·mL-1硝苯地平對照品溶液，在1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h進(jìn)樣測定，計算RSD值。

精密移取硝苯地平對照品儲備液2 mL，用甲醇定容到10 mL容量瓶中，得100 μg·mL-1硝苯地平對照品溶液，在1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d進(jìn)樣測定，計算RSD值。

1.3.7 穩(wěn)定性實驗

取供試品溶液于室溫下放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h后進(jìn)樣測定，計算RSD值。

1.3.8 回收率實驗

取已知含量的超聲提取液樣品3份，精密加入濃度為80 μg·mL-1的硝苯地平對照品溶液1 mL、2 mL、3 mL，用甲醇重新配制到標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，在1.2色譜條件下進(jìn)行檢測，計算回收率。

1.3.9 硝苯地平含量測定

取3個不同廠家、9個不同批次的硝苯地平供試品溶液在1.2色譜條件下進(jìn)行檢測，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的確定

以甲醇作參比，將濃度為0.5 mg·mL-1的硝苯地平對照品甲醇溶液在紫外可見分光光度計上進(jìn)行紫外吸收光譜掃描。結(jié)果顯示硝苯地平在235～240 nm處有較大吸收，且235 nm處干擾較小，峰型對稱，基線平穩(wěn)。因此，確定測定波長為235 nm。

2.2 流動相的確定

本實驗流動相采用中國藥典二部(2010年版)中測定硝苯地平片含量所用的甲醇-水(60∶40，體積比，下同)[7]，以0.5 mg·mL-1的對照品儲備液進(jìn)樣得色譜圖，見圖1。

圖1 以甲醇-水(60∶40，體積比)為流動相的色譜

由圖1可知，以甲醇-水為流動相時，硝苯地平峰的保留時間為6～10 min，理論塔板數(shù)(以硝苯地平峰計)不低于4 000，其對稱因子為1.05，與雜質(zhì)峰的分離度不小于2.0。硝苯地平基線穩(wěn)定、峰型好、對稱性好、柱效高。因此，確定流動相為甲醇-水(60∶40)。

2.3 定量限和檢測限

定量限實驗結(jié)果表明，硝苯地平濃度為10 μg·mL-1時，信噪比(S/N)≥10，確定定量限為10 μg·mL-1。

檢測限實驗結(jié)果表明，硝苯地平濃度為6.25 μg·mL-1時，信噪比(S/N)≥3，確定檢測限為6.25 μg·mL-1。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以硝苯地平質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。進(jìn)行擬合回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=62533x-137.65，R=0.9999。表明硝苯地平在12.5～400 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，而其它文獻(xiàn)報道的硝苯地平線性范圍為40～140 μg·mL-1，所以，本實驗中HPLC法測定硝苯地平的定量限更低。

圖2 HPLC法測定硝苯地平的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 精密度

精密度實驗結(jié)果表明：峰面積的RSD值為1.08%(n=6)，說明該方法的精密度高；日內(nèi)精密度測定的峰面積的RSD值為1.56%(n=6)，說明該方法的日內(nèi)精密度較好。日間精密度測定的峰面積的RSD值為0.79%(n=7)，說明該方法的日間精密度較好。

2.6 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，峰面積的RSD值為2.72%(n=8)，說明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 回收率(表1)

表1硝苯地平回收率實驗結(jié)果

Tab.1Results of nifedipine recovery experiment

由表1可知，在低、中、高3個濃度下的平均回收率分別為99.23%、99.99%、101.66%，符合要求。

2.8 硝苯地平含量測定

對9種供試品溶液按照1.2色譜條件進(jìn)行檢測，結(jié)果見表2。

由表2可知，不同廠家、不同批次硝苯地平片中硝苯地平含量均符合標(biāo)注規(guī)格，揚(yáng)子江藥業(yè)、利煥藥業(yè)、納欣同藥業(yè)硝苯地平含量分別為標(biāo)注規(guī)格量的114.03%、113.40%、123.13%。

表2硝苯地平片的含量測定結(jié)果

Tab.2Nifedipine tablets assay results

3 結(jié)論

建立了一種快速測定硝苯地平片含量的HPLC 方法，對其進(jìn)行方法學(xué)考察。色譜條件如下：采用Agilent C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)，以甲醇-水(60∶40，體積比)為流動相，流速0.8 mL·min-1，檢測波長235 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL。結(jié)果表明，硝苯地平在12.5～400 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量限更低，精密度和穩(wěn)定性也較好，而且加樣回收率符合要求。用此HPLC法對3個不同廠家、9個不同批次的硝苯地平片進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，各廠家不同批次硝苯地平片中硝苯地平含量均符合標(biāo)注規(guī)格，揚(yáng)子江藥業(yè)、利煥藥業(yè)、納欣同藥業(yè)硝苯地平含量分別為標(biāo)注規(guī)格量的114.03%、113.40%、123.13%。該法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確、快速簡便、穩(wěn)定性好，是測定硝苯地平含量的有效方法，可為控制硝苯地平片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和合理利用提供依據(jù)。

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