河蜆蛋白酶解液制備熱反應(yīng)型醬香調(diào)味基料的研究

林 孌，楊 婷

（泉州師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，福建 泉州 362000）

0 引言

河蜆（Corbicula fluminea）又稱黃蜆、金蚶、扁螺等，廣泛分布在我國(guó)湖泊、江河中，天然資源豐富[1].河蜆軟體部分干樣中，粗蛋白、粗脂肪、灰分含量分別為63.33%、10.91%、6.29%，必需氨基酸占氨基酸總量的39.10%，并富含鈣、鈉、鉀、鐵等無機(jī)元素[2].河蜆不僅具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且具有開胃、通乳、明目、利尿、去濕毒、治療肝病、麻疹、退熱、止咳化痰、解酒等功效[1].文獻(xiàn)[3-4]報(bào)道以河蜆為原料，添加不同種類的蛋白酶進(jìn)行水解，制得水解度較高、氣味較好的河蜆蛋白酶解液.作者也嘗試先后添加Neutrase/Alcalase（中性/堿性）和Flavourzyme（風(fēng)味）蛋白酶對(duì)河蜆軟體部分進(jìn)行水解，獲得的蛋白酶解液鮮味濃郁、無明顯腥苦味，但聞香時(shí)發(fā)現(xiàn)酶解液的香氣微弱或基本沒有.

食品熱反應(yīng)增香技術(shù)，包括氨基酸和還原糖之間的美拉德反應(yīng)、各氨基酸之間的斯特克雷爾反應(yīng)以及脂質(zhì)的降解反應(yīng)等，其中最主要的是美拉德反應(yīng)[5].近年來，一些研究者利用美拉德反應(yīng)，即用蛋白酶水解價(jià)廉物美的動(dòng)植物蛋白、酵母浸膏，將得到的蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物再與氨基酸、還原糖等共熱，生產(chǎn)風(fēng)味逼真的高檔天然營(yíng)養(yǎng)風(fēng)味料[6-8].其實(shí)質(zhì)是模擬物質(zhì)在加熱過程中產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的反應(yīng)系統(tǒng)，此仿生系統(tǒng)與實(shí)際產(chǎn)香系統(tǒng)近似程度越高則反應(yīng)所產(chǎn)生的香味就越逼真[9].目前國(guó)內(nèi)風(fēng)味料仿生模型的研究尚屬起步階段，純粹通過現(xiàn)代生物技術(shù)和食品熱加工技術(shù)生產(chǎn)風(fēng)味料的成熟技術(shù)還未見報(bào)道.因此，作者在前期獲得的河蜆蛋白酶解液基礎(chǔ)上，以風(fēng)味評(píng)分值為指標(biāo)，探討初始pH值、還原糖添加量、反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)熱反應(yīng)效果的影響，優(yōu)化熱增香反應(yīng)條件，為進(jìn)一步開發(fā)以河蜆蛋白酶解液為前體的復(fù)合調(diào)味料提供研究基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

鮮活河蜆：泉州永輝超市（泉秀店），暫養(yǎng)，吐沙清洗后，置于沸水浴中熱燙約10 s 至微開殼，取蜆肉，用組織搗碎機(jī)搗碎，制得蜆肉泥，備用.

蛋白酶Neutrase（1.5 AU-N/g）、Alcalase（2.4 AU-A/g）、Flavourzyme（500 LAPU/g）：諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司；葡萄糖（AR）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

DK-42OS 型三用恒溫水箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PHS-3C 微型機(jī)pH 計(jì)：上海康儀儀器有限公司；TDL-40B 飛鴿離心機(jī)：上?？低た茖W(xué)儀器廠；YXQ-LS-30 SLL 立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；L-8900 日立氨基酸分析儀：天美（中國(guó)）科學(xué)儀器有限公司.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 河蜆蛋白酶解液的制備

稱取蜆肉泥10 g，加入蒸餾水30 mL，用Neutrase/Alcalase 混合酶在其較優(yōu)酶解條件（反應(yīng)溫度55 ℃，pH 7.0，加酶量1.5%）下于恒溫水箱中酶解2.0 h，冷卻至50 ℃，調(diào)pH 6.0，添加Flavourzyme（加酶量1.6%）繼續(xù)水解.3 h 后滅酶（100 ℃，10 min）、在4 000 r/min 下離心10 min，取上清液，制得河蜆蛋白酶解液.

1.3.2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物制備

量取20 mL 河蜆蛋白酶解液于試管中，加入葡萄糖，放入恒溫水箱（反應(yīng)溫度低于100 ℃時(shí)）或壓力蒸汽滅菌器（反應(yīng)溫度高于100 ℃時(shí)），設(shè)置一定溫度和時(shí)間進(jìn)行熱反應(yīng).結(jié)束后取出，置于冰浴中冷卻獲得.

1.3.3 單因素試驗(yàn)

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物與糖和氨基酸種類、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間及環(huán)境pH 值等密切相關(guān)[10].由于葡萄糖廉價(jià)易得，反應(yīng)性能好，所以本試驗(yàn)選用葡萄糖作為美拉德反應(yīng)原料.

（1）葡萄糖添加量分別為10%、15%、20%、25%、30%、35%，反應(yīng)溫度100 ℃，反應(yīng)時(shí)間60 min，初始pH 6.5；

（2）反應(yīng)溫度分別為80 ℃、90 ℃、100 ℃、110℃、120 ℃，葡萄糖添加量30%，反應(yīng)時(shí)間60 min，初始pH 6.5；

（3）反應(yīng)時(shí)間分別為20、40、60、80、100 min，葡萄糖添加量30%，反應(yīng)溫度110 ℃，初始pH 6.5；

（4）初始pH 值（用小蘇打或檸檬酸調(diào)節(jié)）分別為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，葡萄糖添加量30%，反應(yīng)溫度110 ℃，反應(yīng)時(shí)間80 min.

1.3.4 二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)[11]

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定各個(gè)因素的水平范圍.為保持河蜆天然風(fēng)味，試驗(yàn)采用河蜆蛋白酶解液的自然pH 6.43 作為美拉德反應(yīng)的初始pH 值，以葡萄糖添加量（X1）、反應(yīng)溫度（X2）、反應(yīng)時(shí)間（X3）為決策變量，風(fēng)味評(píng)分值為目標(biāo)函數(shù)，各因素水平編碼見表1.

表1 因素水平編碼

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 美拉德反應(yīng)感官風(fēng)味的評(píng)定

氣味判定方法：采用聞香紙浸入樣品中1～2 cm，然后在離聞香紙2～3 cm 處通過鼻孔吸氣，每次2～3 s，根據(jù)產(chǎn)品氣味打分，最高得分為50.滋味判定方法:準(zhǔn)確量取樣品10 mL，加80 ℃水10 mL，充分混合后冷卻至20～25 ℃后進(jìn)行品嘗，根據(jù)產(chǎn)品滋味打分，最高分為50[8].

由10 名感官評(píng)定員組成風(fēng)味評(píng)定小組，采用先嗅后嘗分別對(duì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的氣味和滋味打分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2，然后將氣味和滋味評(píng)分值相加即為樣品的風(fēng)味評(píng)分值.以10 名感官評(píng)定員評(píng)分的算術(shù)平均值作為最終風(fēng)味評(píng)分值.

表2 風(fēng)味評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4.2 游離氨基酸組成分析

準(zhǔn)確稱取1 g 樣品，加入15 mL 0.1 mol/L 鹽酸超聲提取20 min，加15 mL 磺基水楊酸（80 g/L）沉淀蛋白，加入少許EDTA 絡(luò)合金屬離子，然后加純水稀釋定容至刻度線，混勻.在16 000 r/min 下離心10 min，取上清液，過0.22 μm 濾膜，參照GB/T 5009.124—2003 上氨基酸分析儀測(cè)試.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)（圖1）

2.1.1 葡萄糖添加量的影響

隨著葡萄糖添加量的增加，反應(yīng)產(chǎn)物的褐變程度持續(xù)加深.由圖1-A 可知，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味評(píng)分值在葡萄糖添加量10%～30%之間逐漸升高，在葡萄糖添加量30%時(shí)達(dá)到最大值，之后風(fēng)味評(píng)分值略有下降，這可能是由于隨著反應(yīng)的進(jìn)行，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物與添加的葡萄糖繼續(xù)反應(yīng)，生成感官不佳的物質(zhì)，因此確定最佳葡萄糖添加量為30%.

圖1 葡萄糖添加量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、初始pH 值對(duì)風(fēng)味評(píng)分值的影響

2.1.2 反應(yīng)溫度的影響

美拉德反應(yīng)受溫度的影響很大，溫度每相差10 ℃，其褐變速度相差3～5 倍[12]，特別是超過100℃以后，褐變速度明顯加快.一般來講，模式反應(yīng)溫度不能超過180 ℃，溫度過高，會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)烈的異味；溫度過低，反應(yīng)程度不夠，產(chǎn)生的香氣同樣不夠濃郁[13].由圖1-B 可知，在80～110 ℃范圍內(nèi)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味評(píng)分值逐漸升高，在反應(yīng)溫度110 ℃時(shí)達(dá)到最大值，之后風(fēng)味評(píng)分值明顯下降，這可能是由于溫度過高產(chǎn)生異味所致，因此確定反應(yīng)溫度110 ℃為宜.

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間的影響

隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，氨基酸與還原糖不斷反應(yīng)，褐變程度持續(xù)加深.由圖1-C 可知，在20～80 min 范圍內(nèi)，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味評(píng)分值逐漸升高，在反應(yīng)時(shí)間80 min 時(shí)達(dá)到最大值，之后風(fēng)味評(píng)分值明顯下降，這可能是由于反應(yīng)末期，除了產(chǎn)物進(jìn)一步縮合、聚合形成復(fù)雜的類黑精物質(zhì)外，還生成了其他感官不佳的物質(zhì)，因此確定反應(yīng)時(shí)間80 min 為宜.

2.1.4 初始pH 值的影響

美拉德反應(yīng)在酸堿環(huán)境中均可發(fā)生，但在pH值大于3 時(shí)，其反應(yīng)速度隨著pH 值的升高而加快[12]，偏堿性的環(huán)境有利于美拉德反應(yīng)的進(jìn)行.由圖1-D 可知，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味評(píng)分值在pH值6.5 時(shí)最高，此時(shí)產(chǎn)生明顯的醬香味，之后風(fēng)味評(píng)分值開始下降；在pH 7.5 時(shí)，產(chǎn)生麥香氣味；而在pH 8.5 時(shí)，褐變程度最大，卻產(chǎn)生不愉快氣味.因此確定初始pH 6.5 最佳，恰與河蜆蛋白酶解液自然pH 6.43 接近.

2.2 熱反應(yīng)條件優(yōu)化

2.2.1 回歸方程的建立與檢驗(yàn)

熱反應(yīng)試驗(yàn)方案與結(jié)果見表3.采用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[14]對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，建立風(fēng)味評(píng)分值Y 與葡萄糖添加量（X1），反應(yīng)溫度（X2）、反應(yīng)時(shí)間（X3）的數(shù)學(xué)回歸模型，得到回歸模型方程.

通過方差分析（表4），可見該模型方程的回歸項(xiàng)在α=0.01 水平上顯著，失擬項(xiàng)不顯著，模型可用.通過回歸系數(shù)顯著性分析（表5），剔除α=0.05顯著水平的不顯著系數(shù)項(xiàng)后，得到簡(jiǎn)化的回歸方程:

另外，表5 的結(jié)果還表明，影響風(fēng)味評(píng)分值各因素的主次順序?yàn)椋悍磻?yīng)溫度＞葡萄糖添加量＞反應(yīng)時(shí)間.反應(yīng)溫度和葡萄糖添加量的影響均達(dá)到水平顯著P＜0.01，反應(yīng)時(shí)間的影響達(dá)到水平顯著P＜0.05.反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間之間的交互作用顯著（P＜0.05），其他因素之間的交互作用不顯著.

2.2.2 單因子效應(yīng)與邊際效應(yīng)分析

將其他因子固定在零水平，描述單個(gè)因子變動(dòng)時(shí)對(duì)風(fēng)味評(píng)分值的影響，3 個(gè)因子的單因子效應(yīng)方程分別為：

表3 熱反應(yīng)試驗(yàn)方案與結(jié)果

表4 方差分析

表5 回歸系數(shù)顯著性分析

根據(jù)這些方程，得到單因子效應(yīng)曲線如圖2所示.

圖2 單因子效應(yīng)曲線

由圖2 可知，風(fēng)味評(píng)分值隨著葡萄糖添加量的增加而逐漸上升；隨著反應(yīng)溫度的升高呈先上升后下降趨勢(shì)；隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢上升.

對(duì)單因子效應(yīng)方程求一階偏導(dǎo)數(shù)，得到單因子邊際效應(yīng)方程.單因子的邊際效應(yīng)反映風(fēng)味評(píng)分值隨各因素變化的速率.單因子邊際效應(yīng)方程分別為：

對(duì)邊際效應(yīng)方程作曲線可得到邊際效應(yīng)曲線如圖3 所示.

圖3 邊際效應(yīng)曲線

由圖3 可以看出，反應(yīng)溫度的斜率絕對(duì)值最大，這表明隨反應(yīng)溫度的變化，風(fēng)味評(píng)分值的變化速率最快，其次是葡萄糖添加量，最后是反應(yīng)時(shí)間變化速度最慢.

2.2.3 交互效應(yīng)分析

反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間之間對(duì)風(fēng)味評(píng)分值的影響有交互作用（P＜0.05），如圖4 所示.由圖4 可知，當(dāng)葡萄糖添加量為零水平時(shí)，反應(yīng)溫度X2在小于上水平（114 ℃）的范圍內(nèi)，風(fēng)味評(píng)分值與反應(yīng)時(shí)間X3有正相關(guān)交互作用，即隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，風(fēng)味評(píng)分值逐漸上升；若反應(yīng)溫度X2大于上水平（114 ℃）時(shí)，風(fēng)味評(píng)分值與反應(yīng)時(shí)間X3有負(fù)相關(guān)交互作用，即隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，風(fēng)味評(píng)分值呈下降趨勢(shì).當(dāng)反應(yīng)溫度為零水平時(shí)，葡萄糖添加量與反應(yīng)時(shí)間交互作用不顯著；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為零水平時(shí)，葡萄糖添加量與反應(yīng)溫度交互作用也不顯著.

圖4 風(fēng)味評(píng)分值隨X2、X3變化趨勢(shì)

2.2.4 最優(yōu)工藝條件的確定

采用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)[14]對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出最優(yōu)熱反應(yīng)條件為：葡萄糖添加量30%，反應(yīng)溫度102 ℃，反應(yīng)時(shí)間80 min，在此條件下風(fēng)味評(píng)分值擬合值為89.3 分.優(yōu)化后的反應(yīng)溫度接近100 ℃，考慮到實(shí)際生產(chǎn)操作與節(jié)能，驗(yàn)證試驗(yàn)時(shí)采用反應(yīng)溫度100 ℃，在上述最優(yōu)工藝條件下制備熱反應(yīng)型醬香調(diào)味基料，風(fēng)味評(píng)分值達(dá)90.1 分.制備獲得的調(diào)味基料鮮甜適口、醬香味濃.

2.3 熱反應(yīng)前后游離氨基酸組成的變化

根據(jù)前面最優(yōu)熱反應(yīng)條件進(jìn)行美拉德反應(yīng)，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行游離氨基酸組成分析，并與熱反應(yīng)前河蜆蛋白酶解液進(jìn)行比較（表6）.結(jié)果表明，熱反應(yīng)后產(chǎn)物中17 種游離氨基酸的含量均有不同程度損失，其中組氨酸、賴氨酸、精氨酸的損失率較大（均超過50%），說明這3 種氨基酸是參與該美拉德反應(yīng)產(chǎn)生醬香味的主要氨基酸.另外，根據(jù)各種氨基酸的呈味特性[15]，發(fā)現(xiàn)損失率較大的這3 種氨基酸均為苦味氨基酸，而呈鮮味的天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸和甘氨酸等損失率都較?。ň陀?5%），這說明該美拉德反應(yīng)不僅能形成愉快的醬香風(fēng)味，還能較好地保留原酶解液的鮮味.童彥等[13，16]在研究中也發(fā)現(xiàn)類似規(guī)律.熱反應(yīng)產(chǎn)物中，必需氨基酸含量占游離氨基酸總量的比例達(dá)58.2%，說明作為一種添加劑，它還是一種具有較好營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的蛋白源.

3 結(jié)論

采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，建立風(fēng)味評(píng)分值與葡萄糖添加量、反應(yīng)溫度及反應(yīng)時(shí)間的數(shù)學(xué)回歸模型：Y=81.1+1.73X1+2.74X2+1.40X3-1.39X22-2.00X2X3.該回歸模型與實(shí)際情況擬合，可以用來反映實(shí)際生產(chǎn)中各因素對(duì)風(fēng)味評(píng)分值的影響規(guī)律.

確定河蜆蛋白酶解液制備熱反應(yīng)型醬香調(diào)味基料的最優(yōu)工藝條件為：葡萄糖添加量30%，反應(yīng)溫度100 ℃，反應(yīng)時(shí)間80 min，該條件下風(fēng)味評(píng)分值90.1 分.本試驗(yàn)制備的熱反應(yīng)型醬香調(diào)味基料鮮甜適口、醬香味濃.

表6 熱反應(yīng)前后游離氨基酸組成的變化

比較熱反應(yīng)前后17 種游離氨基酸組成的變化情況，發(fā)現(xiàn)組氨酸、賴氨酸、精氨酸的損失率較大（均超過50%），說明這3 種氨基酸是參與該美拉德反應(yīng)產(chǎn)生醬香味的主要氨基酸.熱反應(yīng)產(chǎn)物中，必需氨基酸含量占游離氨基酸總量的比例達(dá)58.2%，是一種具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的蛋白源.

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