蛋白質(zhì)結(jié)晶研究進(jìn)展

王岸娜，蘇子豪，吳立根，張 曼，孫敬捧

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

0 引言

到目前為止蛋白質(zhì)結(jié)晶問題仍是蛋白質(zhì)研究的一個瓶頸[1].由于生物大分子的物理、化學(xué)及生物性質(zhì)復(fù)雜，使蛋白質(zhì)的晶體培養(yǎng)工作變得相當(dāng)復(fù)雜[2].蛋白質(zhì)晶體內(nèi)部有40%～60%的空間被溶劑分子填充，在晶體內(nèi)形成孔隙和通道，使晶體的韌度、硬度降低，可能加劇晶體排列的不規(guī)則性.蛋白質(zhì)分子間的作用力導(dǎo)致晶格排列上的不規(guī)則情形的增加[3]，這也增加了蛋白質(zhì)結(jié)晶的難度.

盡管高通量結(jié)構(gòu)基因組學(xué)簡化了目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)純化結(jié)晶及數(shù)據(jù)的收集過程，但仍只有少量蛋白質(zhì)能形成滿足衍射要求的單晶[4].研究生物大分子結(jié)晶的一般原理和條件，獲得晶體衍射數(shù)據(jù)，對食品安全、藥物研發(fā)與設(shè)計(jì)等領(lǐng)域有重要推動作用.目前蛋白質(zhì)結(jié)晶學(xué)發(fā)展還不成熟，蛋白質(zhì)結(jié)晶在很大程度上是基于經(jīng)驗(yàn)性的.作者主要討論了影響蛋白質(zhì)結(jié)晶的因素，介紹了常用的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法，并對提高結(jié)晶篩選率的新策略和新技術(shù)作了詳細(xì)介紹.

1 蛋白質(zhì)的結(jié)晶過程

蛋白質(zhì)結(jié)晶是溶液中的蛋白質(zhì)分子經(jīng)一定規(guī)則排列堆積形成有序聚集體的過程，其結(jié)構(gòu)特征是有序的結(jié)構(gòu)框架及溶劑分子共同形成的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[5].蛋白質(zhì)結(jié)晶可分為形核和晶核生長兩個階段.形核包括均相成核和非均相成核.晶核生長是處于亞穩(wěn)區(qū)或不穩(wěn)定區(qū)的蛋白質(zhì)分子與晶核接觸有序結(jié)合到晶格結(jié)構(gòu)上的過程[6].蛋白質(zhì)結(jié)晶只有在蛋白質(zhì)溶液過飽和時才會發(fā)生.根據(jù)過飽和程度的不同，蛋白質(zhì)溶解相圖分為溶解區(qū)、亞穩(wěn)區(qū)、不穩(wěn)定區(qū)及沉淀區(qū)[7].在不穩(wěn)定區(qū)形成少量晶核，使晶核在亞穩(wěn)區(qū)緩慢生長，這是目前比較理想的晶體生長條件[8].

獲得過飽和蛋白質(zhì)溶液的原理一般有4 種：改變蛋白質(zhì)性質(zhì)、改變水的化學(xué)活性、調(diào)整蛋白質(zhì)分子間作用、調(diào)整蛋白質(zhì)分子與溶劑的相互作用.常用的獲得過飽和溶液的方法大部分依據(jù)這4 種原理（表1）.

2 影響蛋白質(zhì)結(jié)晶的因素

影響蛋白質(zhì)結(jié)晶的因素大致可分為物理因素、化學(xué)因素以及生物化學(xué)因素等.物理因素包括溫度、電磁場和壓力等外界條件；化學(xué)因素包括溶液濃度、pH 值、過飽和度以及離子強(qiáng)度等溶液環(huán)境[9]；生物化學(xué)因素包括蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、對稱性、均一性以及等電點(diǎn)等（表2）.

2.1 溫度

溫度能夠通過改變蛋白質(zhì)的溶解度影響結(jié)晶過程[10].蛋白質(zhì)在高溫下的溶解度隨結(jié)晶過程是由焓驅(qū)動或熵驅(qū)動決定.比如溶菌酶隨著溫度的升高而溶解度升高，糜蛋白酶原A 則隨溫度的升高溶解度降低.溫度能夠影響蛋白質(zhì)側(cè)鏈的酸堿平衡常數(shù)，氨基酸殘基側(cè)鏈電離基團(tuán)的pKa 與介質(zhì)的離子強(qiáng)度關(guān)系非常密切.蛋白質(zhì)在低離子強(qiáng)度介質(zhì)中溶解度隨溫度升高而升高，在高離子強(qiáng)度時則降低.溫度因素一般用于篩選優(yōu)化結(jié)晶條件和生長高質(zhì)量晶體.目前的溫度篩選策略有最佳溫度篩選策略、即時控制溫度策略、衡量過飽和度法及循環(huán)溫度策略.最佳溫度篩選系統(tǒng)在結(jié)晶板上可同時監(jiān)測12 個恒溫點(diǎn)下16 個不同的結(jié)晶條件的溫度梯度；即時控制溫度裝置可在一個結(jié)晶板上設(shè)置多個溫度形成溫度梯度，以達(dá)到批量、快速篩選結(jié)晶溫度條件的目的；衡量過飽和度法通過控制結(jié)晶液穩(wěn)定在相圖的某一區(qū)域以生長出高質(zhì)量的晶體[11]；循環(huán)溫度策略通過維持溫度循環(huán)變化以篩選適合結(jié)晶的條件.

表1 獲得過飽和結(jié)晶液的方法

表2 蛋白質(zhì)結(jié)晶的影響因素

熱歷史效應(yīng)也是影響蛋白質(zhì)結(jié)晶性質(zhì)的因素之一.熱歷史效應(yīng)即結(jié)晶前蛋白質(zhì)溶液的保存溫度和保存時間的不同會導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶液最終的結(jié)晶性質(zhì)不同.此外，沉淀劑還可以改變蛋白質(zhì)溶解度對溫度的依賴性.高沉淀劑濃度下，蛋白質(zhì)溶解度受溫度影響較??；較低沉淀劑濃度下，蛋白質(zhì)溶解度強(qiáng)烈依賴溫度.

2.2 樣品純度和均一性

蛋白質(zhì)樣品的純度和均一性是蛋白質(zhì)結(jié)晶非常重要的兩個因素.純度可通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和質(zhì)譜測定.蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)可以使用傅里葉變換紅外分光法和紅外圓二色譜法測定.樣品均一性可通過動態(tài)或靜態(tài)光散射（SLS）測定.SLS 測定均一性時，通過分析透射光強(qiáng)度可獲得蛋白質(zhì)分子的摩爾質(zhì)量[12].SLS 可檢測蛋白質(zhì)樣品的質(zhì)量及溶液聚合狀態(tài).

2.3 光照

光照的作用主要是通過光化學(xué)反應(yīng)和光的空穴效應(yīng)影響蛋白質(zhì)結(jié)晶.光化學(xué)反應(yīng)即物質(zhì)在可見光和紫外光的照射下分子吸收光子所引起的化學(xué)反應(yīng)；光的空穴效應(yīng)即激光照射到蛋白質(zhì)溶液上，蛋白質(zhì)分子和溶劑分子吸收光子產(chǎn)生熱壓，熱壓產(chǎn)生的沖擊波產(chǎn)生空化氣泡[13].蛋白質(zhì)分子能迅速吸附在空化氣泡表面導(dǎo)致蛋白質(zhì)局部濃度快速升高，從而提高了形核的概率.Murai 等[14]在氣泡萎縮的過程中觀察到一個熒光強(qiáng)度為正常情況下3 倍的亮點(diǎn)，可能是蛋白質(zhì)的高濃度區(qū).

2.4 沉淀劑

能夠降低蛋白質(zhì)溶解度的化合物被稱為沉淀劑.沉淀劑通過3 種機(jī)理發(fā)揮作用：改變水分活度、改變?nèi)軇┑慕殡姵?shù)和增強(qiáng)空間排阻.不同作用機(jī)制的沉淀劑之間互換性很小.不同的沉淀劑在結(jié)晶過程中可能會產(chǎn)生協(xié)同作用，最終促進(jìn)蛋白質(zhì)晶體生長.

大分子沉淀劑可以分為4 類：鹽、有機(jī)溶劑、長鏈多聚體、低分子量聚合體和不揮發(fā)有機(jī)物，沉淀劑的種類如表3 所示.

表3 沉淀劑種類

2.5 添加劑

除了結(jié)晶復(fù)合物、緩沖液和沉淀劑以外，添加后有利于產(chǎn)生晶體的任何物質(zhì)被稱為添加劑（表4）.普遍認(rèn)為添加劑的作用機(jī)理是與蛋白質(zhì)分子的某一位點(diǎn)形成了特殊的相互作用.對大多數(shù)蛋白質(zhì)來說，陽離子對其溶解度影響較小，陰離子影響較大.金屬離子能夠穩(wěn)定晶格中蛋白質(zhì)分子間的相互作用.有機(jī)小分子物質(zhì)可降低溶劑的介電常數(shù)，并影響疏水相互作用.向結(jié)晶液中添加配基能夠提高結(jié)晶篩選率.添加配基有兩種方式：直接添加到結(jié)晶母液中；與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后加入到結(jié)晶液中.

表4 添加劑種類

2.6 pH 值

蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基側(cè)鏈含有大量的可電離基團(tuán)，因此體系pH 值的微小改變可導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度的變化.pH 值可改變蛋白質(zhì)大分子間鹽橋和氫鍵的數(shù)目和作用力，這兩種鍵對形核和晶體生長起著至關(guān)重要的作用[15].靜電相互作用在蛋白質(zhì)分子的特異性結(jié)合，蛋白質(zhì)水合作用及與小分子、離子相互作用方面起著重要作用.一般地，能夠保持蛋白質(zhì)天然折疊狀態(tài)的pH 值更有利于促進(jìn)蛋白質(zhì)晶體的形成.

2.7 耐熱性

一直以來蛋白質(zhì)的耐熱性與蛋白質(zhì)結(jié)晶之間的關(guān)系頗具爭議[16].基于耐熱性的預(yù)結(jié)晶篩選可大大提高結(jié)晶成功率.基于熒光的熱遷移分析是一種快速、經(jīng)濟(jì)的檢測蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法，可通過監(jiān)測與疏水核心殘基相互作用的外部熒光探針信號來檢測蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性.

2.8 重力場

晶體周圍溶液濃度隨著晶體的生長逐漸低于整體濃度，形成一系列濃度梯度.濃度梯度與重力作用在晶體周圍引起對流，晶體界面與高濃度的結(jié)晶液接觸不利于形成高質(zhì)量晶體.而在失重條件下不會產(chǎn)生對流，溶液中的溶質(zhì)僅僅受自由擴(kuò)散作用的影響，而且與晶體表面接觸的結(jié)晶液的濃度稍微過飽和，這很有利于生長高質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體.重力的另一個負(fù)面影響是沉降作用，這會導(dǎo)致生長的晶體降落并附著在另一晶體上然后繼續(xù)生長.

2.9 強(qiáng)迫流動

合理控制強(qiáng)迫流動可以生長數(shù)量少、尺寸大、質(zhì)量高的蛋白質(zhì)晶體.目前的強(qiáng)迫對流研究有泵蠕動驅(qū)動、利用電場驅(qū)動、攪拌、搖動及振動等方式[17].攪拌能夠破壞晶體周圍的濃度梯度和抑制過量的自發(fā)形核并增加蛋白質(zhì)分子間觸磁機(jī)會[18]，從而促進(jìn)高衍射質(zhì)量晶體的形成.

2.10 電場

使用高壓電場可以控制晶核的形成和結(jié)晶熱力學(xué)過程[19].通過控制電流、電壓、頻率及電極材料等可以控制晶體形核數(shù)量以有利于產(chǎn)生高衍射質(zhì)量晶體.溶液pH 可導(dǎo)致蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)的不同，因此形核可發(fā)生在陰極或者陽極.電場對形核速率的影響與液相、固相之間的介電常數(shù)差異有關(guān)[12].離子強(qiáng)度越大電場的影響也就越大[20].Koizumi 等[21]在結(jié)晶溶菌酶時發(fā)現(xiàn)，對結(jié)晶液施加不同頻率的交流電場能夠控制晶體的形核速率.

施加在溶液中的電場分為直流電場和交流電場、內(nèi)置電場和外置電場[22].Hou 等[23]采用標(biāo)準(zhǔn)平板印刷技術(shù)，將陽極與陰極交叉排列的電極組對印刷在玻片上形成內(nèi)置電場.電場通過濃度梯度作用、電聚焦效應(yīng)、氧化還原反應(yīng)、pH 值改變、偶極離子反應(yīng)等影響蛋白質(zhì)結(jié)晶過程.

2.11 磁場

均勻磁場和梯度磁場都可用在蛋白質(zhì)結(jié)晶試驗(yàn)中.不均勻磁場能夠通過磁力和抑制對流作用弱化重力影響[24].通過使磁化率不同引起的磁力對流與濃度梯度引起的對流方向相反來抑制結(jié)晶溶液中的對流作用.此外，在高場強(qiáng)磁場條件下形成的結(jié)晶存在定向效應(yīng)有時會導(dǎo)致蛋白質(zhì)性質(zhì)的變化.Gavira 等[25]發(fā)現(xiàn)定向效應(yīng)導(dǎo)致α-螺旋和β-折疊與磁場方向相一致.目前磁場對蛋白質(zhì)結(jié)晶影響的詳細(xì)機(jī)制尚不清楚.

3 蛋白質(zhì)結(jié)晶方法

目前最常用的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法有氣相擴(kuò)散法和批量結(jié)晶法，還有一些比較新穎的結(jié)晶方法，其中包括膜結(jié)晶法、自由界面擴(kuò)散法和微流芯片技術(shù)等.

3.1 氣相擴(kuò)散法

氣相擴(kuò)散法主要包括坐滴法和懸滴法（圖1）.氣相擴(kuò)散法基于水分子從低濃度結(jié)晶液自發(fā)轉(zhuǎn)移到高濃度結(jié)晶液池中，導(dǎo)致溶液中蛋白質(zhì)濃度緩慢升高的原理.坐滴法的結(jié)晶液被放置在帶有凹槽的支架上，一般為2～10 μL.懸滴法的結(jié)晶液懸掛在結(jié)晶室蓋板上.坐滴法制備的晶體可能會附著于玻片表面，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移晶體不便.懸滴法樣品需求量較小，而且準(zhǔn)備起來較困難.Lu 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，降低結(jié)晶液中結(jié)晶劑濃度而保持蛋白質(zhì)濃度不變可以加快蒸汽擴(kuò)散速率并提高結(jié)晶的成功率.

3.2 批量結(jié)晶法

批量結(jié)晶法又稱配液結(jié)晶法，是最早被應(yīng)用在結(jié)晶試驗(yàn)中的方法之一.它是將蛋白質(zhì)溶液和結(jié)晶劑直接混合在密閉的體系中來實(shí)現(xiàn)結(jié)晶.與蒸汽擴(kuò)散結(jié)晶法相比，批量結(jié)晶法操作簡單，但耗樣量較大[27].微配液結(jié)晶法使用低密度石蠟油密封結(jié)晶液池，通過石蠟油預(yù)防結(jié)晶液溶劑快速、大量蒸發(fā)，從而使蛋白質(zhì)溶液緩慢趨于飽和.Merlino 等[28]提出了一種改良的微配液結(jié)晶法，在試驗(yàn)初期，蛋白質(zhì)和結(jié)晶劑混合后的濃度就達(dá)到形核的濃度，從而避免了油滴批量結(jié)晶法的缺點(diǎn)，即水分子的緩慢蒸發(fā)導(dǎo)致鹽類沉淀并最終影響產(chǎn)生的晶體質(zhì)量.

3.3 膜結(jié)晶法（Dialysis method）

膜結(jié)晶法亦稱透析結(jié)晶法，是用半透膜隔開蛋白質(zhì)溶液和結(jié)晶劑，通過膜蒸餾逐漸脫去蛋白質(zhì)溶液中的溶劑分子，使得蛋白結(jié)晶溶液濃度緩慢升高達(dá)到亞穩(wěn)區(qū)狀態(tài)，從而產(chǎn)生蛋白質(zhì)結(jié)晶.常用的透析設(shè)備有透析管和微量透析紐扣（圖2）.該法具有結(jié)晶速度快、起始濃度低、誘導(dǎo)時間短、過程可控[29]及在尋找結(jié)晶的最佳條件過程中透析袋內(nèi)的蛋白質(zhì)可以重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn).另外由于透析結(jié)晶法可以為膜蛋白提供疏水環(huán)境，從而保持膜蛋白的活性，所以平衡透析法較多地應(yīng)用于膜蛋白的結(jié)晶.2010 年，龐鴻宇等[30]采用動態(tài)膜結(jié)晶法成功地獲得了較大尺寸的木瓜蛋白酶結(jié)晶.

圖1 坐滴法和懸滴法

圖2 透析紐扣和透析管

3.4 自由界面擴(kuò)散法

該法是在毛細(xì)管中加入待結(jié)晶的蛋白質(zhì)溶液和結(jié)晶劑溶液，在液-液界面上由于濃度差發(fā)生溶質(zhì)擴(kuò)散，蛋白質(zhì)溶液濃度緩慢升高最終達(dá)到過飽和而產(chǎn)生結(jié)晶.逆向擴(kuò)散法是一種較新穎的改良方法，將容納有蛋白質(zhì)溶液的毛細(xì)管的一段插入凝膠中，再在凝膠中加入沉淀劑溶液，沉淀劑通過毛細(xì)管擴(kuò)散至蛋白質(zhì)溶液中，形成系列濃度梯度.因?yàn)槟z表面的沉淀劑濃度最大，所以較大的晶體通常產(chǎn)生于毛細(xì)管末梢.相比于傳統(tǒng)方法，逆向擴(kuò)散法可以在單個毛細(xì)管中形成沉淀區(qū)、形核區(qū)、亞穩(wěn)定區(qū)和溶解區(qū)一系列不同的濃度梯度，因此僅需一次試驗(yàn)即可篩選不同濃度下的蛋白質(zhì)結(jié)晶條件.

3.5 微流芯片技術(shù)

微流控技術(shù)具有高通量、低能耗、集成化等優(yōu)勢.微流體結(jié)晶的主要優(yōu)點(diǎn)有3 個：樣品量在納升或皮升水平；微體系下的一些特殊物理、化學(xué)反應(yīng)可能對結(jié)晶有良好的促進(jìn)作用；微流體技術(shù)具有集成度高、規(guī)?；葍?yōu)點(diǎn)，可顯著提高試驗(yàn)效率[31].微流體技術(shù)在高通量篩選蛋白質(zhì)結(jié)晶條件、結(jié)晶過程的熱力學(xué)和動力學(xué)數(shù)據(jù)測量、探測和調(diào)控晶型等方面均有廣泛的應(yīng)用[32].如Pinker 等[33]根據(jù)逆向擴(kuò)散法（Counter-diffusion）原理研制了模擬其結(jié)晶過程的“樹形”結(jié)晶芯片.從“樹根”處加入蛋白質(zhì)樣品，從“樹枝”加入各種結(jié)晶劑.蛋白質(zhì)樣品和結(jié)晶劑在“樹干”中擴(kuò)散并相遇，形成了從溶解區(qū)到不穩(wěn)定區(qū)一系列的濃度梯度.Masatoshi 等[34]利用液滴型微流控技術(shù)研究奇異果甜蛋白結(jié)晶特征時發(fā)現(xiàn)，即使在高濃度條件下，只要液滴體積在200 μm 以內(nèi)就能產(chǎn)生晶體.這證明了通過調(diào)整液滴大小也能控制蛋白質(zhì)結(jié)晶.

4 其他提高蛋白結(jié)晶條件篩選率的方法

4.1 蛋白質(zhì)分子改造

常用的蛋白質(zhì)改造方法有定點(diǎn)突變、賴氨酸甲基化、剪切或刪除柔順環(huán)區(qū)、融合蛋白、復(fù)合物共結(jié)晶及原位蛋白水解等[35].這幾種方法都是通過降低分子表面熵、提高溶解度、提高分子在溶液中的均一性來促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的結(jié)晶.

4.1.1 定點(diǎn)突變

定點(diǎn)突變是對目標(biāo)蛋白質(zhì)基因進(jìn)行突變、表達(dá)、純化后得到目標(biāo)蛋白質(zhì)的技術(shù).定點(diǎn)突變也被稱為表面熵降低策略（Surface-entropy reduction，SER），即通過定點(diǎn)突變將較高構(gòu)象熵的氨基酸替換為表面熵較低的氨基酸以促進(jìn)結(jié)晶.常用的突變有賴氨酸到丙胺酸或色氨酸、谷氨酸到丙氨酸或天冬氨酸等[36].通過表面熵降低策略獲得的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)有160 多種[37].

4.1.2 賴氨酸甲基化

賴氨酸甲基化是將一定量的甲基化試劑與蛋白質(zhì)溶液混合反應(yīng)，之后提取、純化進(jìn)而提高結(jié)晶條件篩選率的方法，具有簡單、快速等優(yōu)點(diǎn).Sledz等[38]猜測甲基化促進(jìn)蛋白質(zhì)結(jié)晶的原因是：甲基化基團(tuán)影響了蛋白質(zhì)分子的電子密度，促進(jìn)了有序化堆積；甲基化后更有利于形成非共價鍵.

4.1.3 剪切或刪除柔順環(huán)區(qū)

柔順環(huán)區(qū)包括多肽鏈N 末端和C 末端的柔順區(qū)域、內(nèi)部Ω 環(huán)形柔順區(qū)域及連接結(jié)構(gòu)域的柔順區(qū)域.刪除蛋白質(zhì)分子內(nèi)柔順環(huán)區(qū)可以提高蛋白質(zhì)溶液均一性.此外影響蛋白質(zhì)溶液均一性的因素還有蛋白質(zhì)糖基化，消除蛋白質(zhì)糖基化的主要措施是將易被糖基化的氨基酸如Asn 替換為Glu或Asp[39].

4.1.4 融合蛋白

融合標(biāo)簽技術(shù)通過目標(biāo)蛋白基因與標(biāo)簽蛋白基因重組后植入宿主體內(nèi)表達(dá)來改善目標(biāo)蛋白溶解性、穩(wěn)定性及可結(jié)晶性.融合標(biāo)簽包括兩種：一種是短的寡聚肽，如6-組氨酸；另一種是高度表達(dá)的可溶性蛋白，如谷胱甘肽、麥芽糖結(jié)合蛋白等.融合標(biāo)簽技術(shù)一般應(yīng)用于溶解度較低或較難結(jié)晶的蛋白質(zhì)，采用融合標(biāo)簽技術(shù)后可以提高目標(biāo)蛋白的溶解度和促進(jìn)晶格的形成.

4.2 檢測蛋白質(zhì)分子在溶液中的狀態(tài)

一般來說處于穩(wěn)定和均一狀態(tài)的蛋白質(zhì)溶液更傾向于篩選到晶體.近年來新發(fā)展的一些物理化學(xué)技術(shù)如靜態(tài)光、動態(tài)光散射和熒光各向異性度值分析等可以從溶解曲線和相圖的界定等各方面提供晶體生長早期階段的信息，為選擇合適蛋白質(zhì)溶劑和結(jié)晶試劑等提供參考.動態(tài)光散射技術(shù)可以靈敏地檢測到蛋白溶液中顆粒大小的變化，可用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)樣品的制備.Pusey 等[40]通過熒光分子的轉(zhuǎn)動速度等來判斷晶體生長中聚集體的大小來預(yù)測蛋白質(zhì)的可結(jié)晶性.

4.3 異相形核

4.3.1 物理法

物理法包括晶體晶格特征誘導(dǎo)形核和表面微觀結(jié)構(gòu)特性誘導(dǎo)形核[41].

晶格特征誘導(dǎo)形核分為外延生長及籽晶法.外延生長通過選擇合適的結(jié)晶基底來誘導(dǎo)異相形核.根據(jù)基底材料的不同可分為：礦物基底外延生長、脂質(zhì)單層親水表面外延生長及蛋白質(zhì)聯(lián)合礦物基底外延生長.外延生長要求基底材料的晶格與目標(biāo)蛋白的晶格相匹配.籽晶法通過直接在亞穩(wěn)區(qū)加入已經(jīng)形核的籽晶（或晶核）以保證有限的晶核生長成大的單晶[42].

表面微觀結(jié)構(gòu)特性誘導(dǎo)形核包括多孔表面、粗糙表面誘導(dǎo)形核及添加形核劑誘導(dǎo)異相形核.目前普遍認(rèn)為多孔表面誘導(dǎo)形核通過提供異相形核位點(diǎn)使蛋白質(zhì)分子正確排列，從而促進(jìn)結(jié)晶.蛋白質(zhì)在粗糙表面形核時具有較低的形核勢壘且能夠聚集在粗糙表面上，因此可以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)形核.異相形核劑主要是各種不溶于水的微粒，比如二乙烯聚苯微球等.

4.3.2 化學(xué)法

化學(xué)法包括靜電作用和疏水作用[41].當(dāng)結(jié)晶基底電荷與蛋白電荷相反時，一般會促進(jìn)蛋白質(zhì)的結(jié)晶.蛋白質(zhì)含有大量的非極性氨基酸殘基，蛋白質(zhì)在溶液中的形態(tài)及性質(zhì)必然會受到疏水作用的影響.

4.4 共結(jié)晶

蛋白質(zhì)與底物、核苷酸、協(xié)同因子或者小分子等結(jié)晶伴侶結(jié)合后有利于提高蛋白質(zhì)結(jié)晶的成功率[39].共結(jié)晶通過結(jié)晶輔助因子與目標(biāo)蛋白結(jié)合形成非共價結(jié)合物，增加了目標(biāo)蛋白的溶解度和均一性，促進(jìn)了晶格接觸.Schartman 等[43]利用數(shù)學(xué)計(jì)算推導(dǎo)證明蛋白質(zhì)與結(jié)晶伴侶結(jié)合可以穩(wěn)定自身的熱力學(xué)特性，從而促進(jìn)結(jié)晶.

4.5 原位蛋白水解

原位蛋白水解是在待結(jié)晶的蛋白質(zhì)溶液中加入極微量的蛋白酶（如溶菌酶、糜蛋白酶等），通過酶解改變蛋白質(zhì)的分子性質(zhì)從而提高結(jié)晶的可能性.在原位蛋白水解法已經(jīng)解析的300 種蛋白質(zhì)中[44]，其中有200 種蛋白質(zhì)之前從未獲得晶體，其余100 種雖然獲得晶體但并未達(dá)到足夠的衍射質(zhì)量.Bai 等[45]在測定鼠科亞基CstF-77 的結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)只有加入極少量的枯草桿菌蛋白酶才能獲得衍射質(zhì)量的晶體.

5 展望

隨著基因組學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的快速發(fā)展，獲得蛋白質(zhì)晶體及衍射信息、了解蛋白質(zhì)在生命活動中充當(dāng)生命載體的本質(zhì)變得越來越迫切.實(shí)驗(yàn)室廣泛采用的結(jié)晶研究方法仍然是基于試錯原理的規(guī)模化篩選.隨著動態(tài)光散射技術(shù)的應(yīng)用及蛋白質(zhì)分子改造技術(shù)的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的篩選已經(jīng)越來越具有可控性.近幾年出現(xiàn)了一種非常有發(fā)展?jié)摿Φ男路f的誘導(dǎo)結(jié)晶方法，被稱為高壓結(jié)晶法[46].該方法利用壓力的變化來促進(jìn)蛋白質(zhì)結(jié)晶并能改善晶體的三維結(jié)構(gòu).高壓結(jié)晶法通過控制結(jié)晶系統(tǒng)的壓力來研究大分子空間構(gòu)象及動力學(xué)特征，且能提供其他結(jié)晶方法無法獲得的構(gòu)象子狀態(tài)信息[47].此外，高通量結(jié)晶通道和X 射線結(jié)構(gòu)測定的快速發(fā)展使得越來越多的結(jié)晶學(xué)家開始使用結(jié)晶機(jī)器人，這使得試驗(yàn)效率和可重現(xiàn)性極大提高，從而大大減小獲得蛋白質(zhì)結(jié)晶條件所消耗的時間.

但是，目前蛋白質(zhì)結(jié)晶方法學(xué)仍然是一門經(jīng)驗(yàn)科學(xué)，尚沒有一套完整的理論和方法能夠指導(dǎo)結(jié)晶學(xué)家成功地獲得高衍射質(zhì)量的晶體.在將來的蛋白質(zhì)可結(jié)晶性的研究過程中應(yīng)該把主要精力投入在發(fā)展一套具有普適意義的理論體系上，使得篩選結(jié)晶條件、提高結(jié)晶質(zhì)量更加理性，這應(yīng)該成為未來結(jié)晶學(xué)研究者共同努力的方向.

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