腦缺血/再灌注神經(jīng)元鈣離子通道的研究進(jìn)展

石詠梅(綜述)，葛金文(審校)

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院解剖教研室，長沙 410208； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西結(jié)合學(xué)院，長沙 410208)

腦缺血一定時間后恢復(fù)血液供應(yīng)，其功能不但不能恢復(fù)，而且出現(xiàn)了更加嚴(yán)重的腦機能障礙，稱之為腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)[1]。目前研究認(rèn)為，CIRI的發(fā)生機制主要與自由基過度形成、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載及細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)，其中Ca2+超載可觸發(fā)一系列下游反應(yīng),包括胱天蛋白酶的激活、ATP合成障礙、鈣依賴性蛋白酶和核酸酸內(nèi)切酶的激活等,而這些事件最終導(dǎo)致CIRI時神經(jīng)元的損傷和死亡[2]。然而，不同種類的細(xì)胞和不同生物膜上存在的鈣離子通道不盡相同。例如，鈣池操縱的Ca2+通道是存在于包括肝細(xì)胞在內(nèi)的非興奮細(xì)胞鈣內(nèi)流的主要通道[3]。因此，該文擬通過探討在CIRI發(fā)生時神經(jīng)元上鈣離子通道的變化揭示CIRI的機制，進(jìn)而為CIRI的預(yù)防提供理論指導(dǎo)。

1 神經(jīng)元胞膜鈣離子通道

1.1鈣離子通道的類型及相關(guān)作用 在神經(jīng)元細(xì)胞膜上有兩類鈣離子通道-電壓依賴性通道(voltage-depent calcium channel，Cav)和配體操控性通道。Cav是由多亞基構(gòu)成的跨膜蛋白復(fù)合體，分布在細(xì)胞膜上控制Ca2+進(jìn)入胞內(nèi)，它們是由α1、α2/δ、β亞單位和鈣調(diào)蛋白(calmodulin,CaM)構(gòu)成的復(fù)合體[4-5]。其中α1亞單位是構(gòu)成通道的主要亞單位，包含離子選擇通道、電壓感受器、門控裝置以及第二信使、藥物和毒物等通道調(diào)節(jié)物質(zhì)的結(jié)合位點[6-7]。α1亞單位包含四個同源跨膜片段，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ，β亞單位即是通過α1亞單位的Ⅰ～Ⅱ片段與之相結(jié)合。這四個同源跨膜片段是1600～2400個氨基酸組成的多肽鏈，它們形成一個四聚體結(jié)構(gòu)，中間是鈣離子的通道[8]。α1亞基每一個跨膜片段含6個α螺旋環(huán)(S1～S6)，在6個α螺旋環(huán)(S1～S6)中，S4是電壓門控鈣離子通道α1亞基的重要組成部分，S5和S6之間存在一個不對稱的環(huán)狀氨基酸序列被稱為P環(huán),P環(huán)與S5和S6一同構(gòu)成了鈣離子通道的選擇性濾孔，為通道特異性的位點[9]。S6與連接S1和S2的結(jié)構(gòu)域以及鈣離子通道細(xì)胞膜內(nèi)的C端一起構(gòu)成了鈣離子通道調(diào)節(jié)物質(zhì)作用的特異位點,鈣拮抗劑即可與此位點結(jié)合,同時該位點也是電壓依賴性失活的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)(圖1：Cav結(jié)構(gòu)示意圖)[10]。

圖1 Cav結(jié)構(gòu)示意圖 1-1：是CaV1或CaV2通道的結(jié)構(gòu)圖，圖中顯示Cavα1有四個同源跨膜片段組成。Cavβ以高親和力結(jié)合在α1亞基的Ⅰ～Ⅱ胞內(nèi)環(huán)(被稱為α-結(jié)合區(qū)段即AID)上。CaM在α1亞基的IQ區(qū)段與其胞質(zhì)內(nèi)的C末端結(jié)合。Cavα2δ也與α1亞基結(jié)合 1-2：是Cav局部結(jié)構(gòu)圖，圖中顯示了CaV1.2 CaVβ/AID復(fù)合體以及Ca2+/CaM-PreIQ和Ca2+/CaM-IQ復(fù)合體的形成部位

Cav對有機鈣阻滯劑敏感，最近Jakubek等[11]發(fā)現(xiàn)用于神經(jīng)組織再生工程的碳微管中的可溶性成分釔也可劑量依賴性地抑制神經(jīng)元上的電壓依賴性的鈣通道。根據(jù)鈣離子通道的結(jié)構(gòu)功能特點和對阻斷劑的敏感性不同，鈣離子通道分為L型、N型、P/Q型、R型和T型5種類型。其L型、N型、P/Q型、R型為高壓激活鈣離子通道，可被較強的除極激活(+30～+50 mV)。T型鈣離子通道為低壓激活鈣離子通道，其活化所需要的膜電位是-55～-20 mV。通過對血管平滑肌的電壓門控鈣通道的研究發(fā)現(xiàn)，L型鈣通道具有強除極激活、大電導(dǎo)以及失活緩慢、開放時間較長等特點[12]。

有研究表明，不同類型的Cavα1亞基的基因編碼不同，目前人們發(fā)現(xiàn)至少10種編碼α1亞基的基因。其中Cav1基因編碼的α1亞單位所構(gòu)成的是L型鈣離子通道，而Cav2.1基因編碼的是P型和Q型通道，Cav2.2基因編碼的是N型鈣離子通道，Cav3基因編碼的是T型鈣離子通道,該通道能夠被二價鎳離子阻斷[13]。在腦區(qū)的電壓依賴性通道以L、N、P為主。P/Q型鈣離子通道和N型鈣離子通道主要分布于神經(jīng)-肌肉的突觸前末端，其開放能夠使鈣離子流入神經(jīng)節(jié)致使神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[14]。

配體操控性鈣離子通道包括谷氨酸依賴性通道即N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid,NMDA)受體通道和非谷氨酸依賴性通道兩大類。NMDA受體是受配基調(diào)節(jié)的離子通道，對Ca2+具有通透性，介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，可被Mg2+電壓依賴性阻斷。而非谷氨酸依賴性通道是近年來研究的熱點,研究表明它們是一些參與控制Ca2+內(nèi)流或外排，負(fù)責(zé)維持Ca2+動態(tài)平衡的整合膜蛋白，其中包括細(xì)胞外酸化時激活的酸感受性離子通道(acid sensing ion channels,ASICs),缺氧缺糖時激活的瞬時受體電位通道(transient receptor potential protein2,TRPM2)、TRPM7以及依賴細(xì)胞膜兩側(cè)電化學(xué)梯度的Na+-Ca2+交換體(Na+-Ca2+Exchanger，NCX)等[15]。激活的瞬時受體電位通道TRPM2和TRPM7以及ASICs均能介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，而激活的鈣泵(Ca2+，Mg2+ATP酶)和NCX則促進(jìn)Ca2+排出細(xì)胞外。最近的研究表明,激活的瞬時受體電位通道產(chǎn)生的瞬時型感受器電位在生長錐延伸和轉(zhuǎn)向上有重要作用[16]。

1.2CIRI發(fā)生時神經(jīng)元胞外鈣離子通道的改變 在早期的研究中，唐瑜[17]使用膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)，L型鈣通道在腦缺血/再灌注損傷的過程中表現(xiàn)出異常的開放活動，在觀察的6個時間點(0、0.5、1、6、12、24)中，再灌注24 h時L型鈣通道開放概率最高，且顯著高于正常組；而0、6、12、24 h通道平均開放時間顯著高于正常組；0.5 h通道電流幅度明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。提示在CIRI后，神經(jīng)元出現(xiàn)的鈣超載可能與L型鈣通道開放時間延長、開放概率增加和通道電流幅度的增大有關(guān)。

隨后的研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血時興奮性氨基酸尤其是谷氨酸的濃度顯著升高，從而過度激活NMDA受體,使該受體調(diào)控的鈣離子通道開放，引起大量的Ca2+內(nèi)流，從而對缺血的神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，有研究表明蛋白激酶CβⅡ亞單位參與了激活NMDA受體引起的鈣胞內(nèi)鈣超載[18]。

然而在臨床試驗中發(fā)現(xiàn)，使用NMDA受體拮抗劑并不能完全阻斷鈣離子內(nèi)流引起的鈣超載，提示還有其他的非谷氨酸依賴的Ca2+通道存在。TRPM2、TRPM7以及ASICs和NCX是近年來發(fā)現(xiàn)的在缺血/缺氧及再灌注損害時能夠引起鈣超載的新角色。

CIRI引起神經(jīng)元缺血缺氧,從而導(dǎo)致ATP產(chǎn)生降低，鈣泵失活，Na+，K+ATP酶功能衰竭，神經(jīng)元胞內(nèi)Na+濃度迅速升高，神經(jīng)元胞膜除極，電壓依賴性鈣通道開放，引起大量的Ca2+內(nèi)流；同時神經(jīng)元胞外Ca2+濃度迅速降低，神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸從突觸部位釋放到突觸間隙，激活NMDA受體，Ca2+內(nèi)流增強；胞外Ca2+濃度降低誘發(fā)更多的Ca2+通過TRPM7和TRPM2通道進(jìn)入細(xì)胞；同時無氧代謝產(chǎn)生的乳酸堆積誘發(fā)ASICs通道的開放，加劇鈣內(nèi)流。而同時被激活的NCX則促進(jìn)Ca2+排出細(xì)胞外，但其作用不足以代償維持Ca2+胞內(nèi)外的平衡，導(dǎo)致胞內(nèi)嚴(yán)重的鈣超載。

2 神經(jīng)元胞內(nèi)的鈣離子通道

2.1鈣離子通道的類型及相關(guān)作用 神經(jīng)元胞內(nèi)的鈣離子通道即內(nèi)鈣釋放的通道，存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和線粒體膜(合稱為肌質(zhì)網(wǎng)膜)上，屬于受體操控性鈣離子通道，包括三磷酸肌醇受體(inositol 1,4,5trisphosphate receptor,IP3R)鈣離子通道和ryanodine敏感的鈣離子通道。兩者的結(jié)構(gòu)和功能有很多共同之處，例如胞內(nèi)鈣濃度從nmol/L到μmol/L的變化就可以同時被兩種受體感知,導(dǎo)致兩者被激活，相反的濃度變化則可以使它們失活；他們在調(diào)節(jié)上也都是雙重的。ryanodine敏感的鈣離子通道可被環(huán)磷酸腺苷核糖磷酸化激活，被蛋白激酶C磷酸化而失活，IP3R可同時被G蛋白偶聯(lián)受體和酪氨酸激酶受體激活。調(diào)節(jié)IP3R的信號通路是胞外信號-磷脂酶C(phospholipase C,PLC)-磷酸(phosphate，P)-IP3-IP3R。ryanodine敏感的鈣通道(RyR通道)分為RyR1、RyR2和RyR3 3個亞型，研究發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)存在的主要是RyR3[19]。激活的IP3R通道和RyR通道可將Ca2+從肌質(zhì)網(wǎng)釋放至胞質(zhì)內(nèi)，而與此同時肌質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶可逆濃度梯度將Ca2+從胞質(zhì)泵回到肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，降低胞質(zhì)Ca2+濃度。

細(xì)胞內(nèi)配體操控性鈣通道大多數(shù)是由若干胞內(nèi)信使物質(zhì)共同調(diào)控的,例如通過研究發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病2(B cell lymphoma/lewkmia-2,Bcl-2)可以抑制Ca2+通過IP3R通道從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的釋放(這種作用可能是因為Bcl-2和IP3R之間存在相互作用并形成IP3R/Bcl-2復(fù)合體從而抑制了IP3通道的開放，進(jìn)而抑制細(xì)胞因鈣超載引起的凋亡)[20],而同時也有實驗表明Bcl-2還可以降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)CaM和肌質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶的表達(dá),從而降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+濃度[21]。

這些細(xì)胞內(nèi)配體操控性鈣通道巨大的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域為多種胞內(nèi)信號調(diào)控其行為提供了作用位點。這些信號包括直接結(jié)合受體的蛋白(如CaM、FK-506結(jié)合蛋白、鈣結(jié)合蛋白、凋亡相關(guān)因子等),磷酸化受體的蛋白激酶以及諸多小分子第二信使[22-24]。

2.2CIRI發(fā)生時神經(jīng)元肌質(zhì)網(wǎng)鈣離子通道的改變 正常情況下，由于鈣泵和NCX等的作用，胞內(nèi)鈣濃度相對穩(wěn)定，達(dá)不到PLC的濃度，不能水解二磷酸肌醇產(chǎn)生IP3。當(dāng)CIRI發(fā)生時缺血缺氧導(dǎo)致胞外鈣離子通道異常開放，胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度迅速升高，激活PLC水解二磷酸肌醇產(chǎn)生IP3，使得IP3R通道開放，大量Ca2+從肌質(zhì)網(wǎng)釋放至胞質(zhì)內(nèi)，引起鈣超載。

細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外鈣通道為不同來源的鈣提供了通路,同時它們之間也存在重要的相互作用。細(xì)胞外進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Ca2+能夠通過激活Ryanodine受體,誘導(dǎo)鈣從細(xì)胞內(nèi)鈣池釋放。而有研究發(fā)現(xiàn)Ryanodine受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣池肌漿網(wǎng)鈣釋放是由L-型電壓門控鈣通道通過與Ryanodine受體變構(gòu)偶聯(lián)激發(fā)的[25]。

細(xì)胞內(nèi)鈣通道受到眾多胞內(nèi)外信使物質(zhì)調(diào)控，同時一種物質(zhì)可調(diào)控多種鈣通道，如CaM不僅可與電壓依賴性鈣通道α1亞基的異亮氨酸-谷氨酸組成的結(jié)構(gòu)域結(jié)合[26]，調(diào)節(jié)電壓依賴性鈣通道的開放，而且Kahl等[27]報道CaM參與了Ca2+對肌漿網(wǎng)上的IP3R的抑制。

3 結(jié) 語

腦組織主要靠葡萄糖有氧氧化供能，故對缺氧十分敏感，腦卒中、腦創(chuàng)傷、頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)等均可引起CIRI。但是其機制還不明確，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是由多因素參與的復(fù)雜的病理生理過程。其中鈣超載被認(rèn)為是啟動CIRI時神經(jīng)元損傷的最后共同通路。而導(dǎo)致神經(jīng)元鈣超載的鈣離子通道在神經(jīng)元的不同部位表達(dá)不同，同時不同的鈣通道之間還存在相互作用。與此同時各個鈣離子通道受到胞內(nèi)外各種調(diào)節(jié)信號的作用，這些構(gòu)成了鈣離子通路復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。因此，要剖析CIRI時神經(jīng)元鈣離子通道通透性改變的機制，還需要更深入的實驗研究。

[1] 王立英,楊世杰.腦缺血再灌注損傷機制及其藥物治療方法的研究進(jìn)展[J].吉林大學(xué)學(xué)報,2012,38(6)：1227-1231.

[2] Szydlowska K,Tymianski M.Calcium,ischemia and excitotoxicity[J].Cell,2010,47(2):122-129.

[3] 劉慧敏.鈣池操縱的Ca2+通道(SOCs)在乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞鈣超載及其相關(guān)肝細(xì)胞損傷中作用的研究[D].濟(jì)南：山東大學(xué)，2012.

[4] Tang ZZ,Zheng S,Nikolic J,etal.Developmental control of Cav1.2 L-type calcium channel splicing by fox protein[J].Mol Cell Biol,2009,29(17):4757-4765.

[5] 楊冠科,叢麗娜,謝三群,等.海刺參(Stichopusjaponicus)電壓依賴性鈣離子通道β亞基基因及其編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特點[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報,2009,25(2):137-145.

[6] Carafoli E,Santella L,Branca D,etal.Generation,control and processing of cellular calcium signals[J].Crit Rev Biochem Mol Biol,2001,36(2):107-260.

[7] 張朝，翟溯瀾.心肌細(xì)胞L型鈣離子通道分子結(jié)構(gòu)與疾病[J].河南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2007,26(3):1-6.

[8] Minor DL,Findeisen F.Progress in the structural-understanding of voltage-gated calcium channel(CaV)function and modulation[J].Channels,2010,4(6):459-474.

[9] Cataldi M,Perez-Reyes E,Tsien RW.Differences in apparent pore sizes of low and high voltage-activated Ca2+channels[J].Biol Chem,2002,277(48):45969-45976.

[10] Koch SE,Bodi I,Schwartz A,etal.Architecture of channel porelining segments revealed by covalent modification of Ca2+substituted cysteines[J].J Biol Chem,2000,275(44):34493-34500.

[11] Jakubek LM,Marangoudakis S,Raingo J,etal.The inhibition of neuronal calcium ion channels by trace levels of yttrium released from carbon nanotubes[J].Biomaterials,2009,30(31):6351-6357.

[12] Gollasch M,Haase H,Ried C,etal.L type calcium channelex pression depends on the differentiated state of vascular smooth muscle cells[J].Faseb J,1998,12(1):593-601.

[13] Perez-Reyes E.Molecular Physiology of low-voltage-activated t-type calcium channels[J].Physiol Rev,2003,83(1):117-161.

[14] Nurullin LF,Mukhitov AR,Tsentsevytsky AN,etal.Voltage-dependent P/Q-type calcium channels at the frog neuromuscular junction[J].Physiol Res,2011,60(5):815-823.

[15] 付于.腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞非谷氨酸依賴性鈣離子通道的研究進(jìn)展[J].中西結(jié)合心腦血管病雜志,2011,8(1):106-107.

[16] 陳景宇,孟輝,馮華.瞬時受體電位通道與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究進(jìn)展[J].創(chuàng)傷外科雜志,2010,11(2):183-185.

[17] 唐瑜.葛根素對腦缺血再灌注損傷神經(jīng)元L-型鈣通道的影響[J].中西結(jié)合心腦血管病雜志,2007,4(1):38-40.

[18] Persiyantseva NA,Birikh KR,Dvoretskova EA,etal.Role of protein kinase C in Ca2+homeostasis disoders in cultured rat neurons during hyperstimulation of glutamate receptors[J].Bull Exp Biol Med,2008,145(5):595-599.

[19] Jude JA,Wylam ME,Walseth TF,etal.Calcium signaling in airway smooth muscle[J].Proc Am Thorac Soc,2008,5(1):15-22.

[20] Akl H,Monaco G,La Rovere R,etal.IP3R2 levels dictate the apoptotic sensitivity of diffuse large B-cell lymphoma cells to an IP3R-derived peptide targeting the BH4 domain of Bcl-2[J].Cell Death Dis,2013,4:e632.

[21] Trebak M,Bird GS,MeKay RR,etal.Comparsion of human TRPC channels in receptor-activity and store-operated modes.Differential sensitivity to channel blockers suggests fundamental differences in channel composition[J].J Biol Chem，2002,277(24):21617-21623.

[22] Meissner G,Pasek DA,Yamaguchi N,etal.Thermodynamics of calmodulin binding to cardiac and skeletal muscle ryanodine receptor ion channels[J].Proteins,2009,74(1):207-211.

[23] Zissimopoulos S,Docrat N,Lai FA.Redox sensitivity of the ryanodine receptor interaction with FK506-binding protein[J].J Biol Chem,2007,282(10):6976-6983.

[24] Petrovic MM,Vales K,Putnikovic B,etal.Ryanodine receptors,voltage-gated calcium channels and their relationship with protein kinase A in the myocardium[J].Physiol Res,2008,57(2):141-149.

[25] Bito V,Heinzel FR,Biesmans L,etal.Crosstalk between L-type Ca2+channels and the sarcopl as micreticulum:alterations during cardiac remodelling[J].Cardiovasc Res,2008,77(2):315-324.

[26] Clapham DE.Calcium signaling[J].Cell,2007,131(6):1047-1058.

[27] Kahl CR,Means AR.Regulation of cell cycle progression by calcium/Calmodulin-dependent pathways[J].Endocr Rev,2003,24(6):719-736.