蘋果微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件(MITE)的分離與鑒定

孫海悅，張志宏

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，吉林 長春 130118；2 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，遼寧 沈陽 110866)

轉(zhuǎn)座元件也稱“跳躍基因”，在基因組中能夠從一個(gè)基因位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)位點(diǎn)。根據(jù)其結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)座機(jī)制分為2大類：類型1轉(zhuǎn)座元件稱為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(retrotransposon)，以RNA為中間媒介，采用“copy-and-paste”方式轉(zhuǎn)座；傳統(tǒng)的類型2轉(zhuǎn)座元件稱為DNA轉(zhuǎn)座子(DNA transposon)，采用“cut-and-paste”機(jī)制來實(shí)現(xiàn)，一般不增加基因組的大小。DNA轉(zhuǎn)座子具有短的末端反向重復(fù)(terminal inverted repeat,TIR)序列和編碼轉(zhuǎn)座酶(transposase,TPase)的單一基因，可分為自主元件(autonomous element)、非自主元件(non-autonomous element)和微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件(miniature inverted-repeat transposable element,MITE)3種亞類。此外，還有一類新的類型2轉(zhuǎn)座元件——Helitrons，它以單鏈DNA(single strand DNA,ssDNA)為中間媒介，采用“rolling-circle”的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)座[1]。

MITEs最初發(fā)現(xiàn)于植物中[2]，之后在多種真核生物包括動(dòng)物、人類和真菌中都有發(fā)現(xiàn)[3]。MITEs在結(jié)構(gòu)上與非自主DNA轉(zhuǎn)座子相似[4]，長度短(<500 bp)，具有靶位點(diǎn)重復(fù)(target site duplication,TSD)和TIR序列，缺乏基因編碼能力，一般富含A/T。在某些情況下，TIR可以形成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)[4]。MITE的高拷貝數(shù)、特征靶位點(diǎn)和家族內(nèi)序列的一致性，使其明顯不同于其他非自主DNA轉(zhuǎn)座子。與其他主要的轉(zhuǎn)座元件(TE)家族不同，MITEs更易插入基因或基因附近[5-7]，通過提供新的剪切位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、新的外顯子和poly(A)位點(diǎn)來影響基因表達(dá)[8-10]。此外，MITEs可以產(chǎn)生小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)基因來調(diào)控與其鄰近的非必需基因[7,11-12]。通常，植物基因組含有103到105個(gè)拷貝的MITE[13]，MITEs的高拷貝和經(jīng)常與基因相聯(lián)的特性，使其對基因調(diào)控起重要作用，并可能在基因組進(jìn)化及生物多樣性形成中扮演重要角色[4]。

蘋果(Malus×domestic)是重要的世界性溫帶果樹，目前生產(chǎn)上使用的大多數(shù)品種來自于芽變選種，如富士、元帥、嘎拉等芽變品種系。在蘋果和葡萄上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座元件插入基因可以導(dǎo)致芽變[14-15]，但對芽變產(chǎn)生的分子機(jī)理尚未有深刻解析。因此，本研究從分離蘋果DNA轉(zhuǎn)座子PIF/Harbinger家族的TPase入手，通過尋找TSD和TIR特異位點(diǎn)來分離蘋果MITE，以期闡明MITEs在蘋果基因組進(jìn)化過程中的重要作用，為蘋果優(yōu)異芽變品種的選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 富士蘋果(Malus×domesticacv.Fuji)的新鮮幼嫩葉片取自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)果樹基地，植物組織經(jīng)液氮處理后于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒與試劑 大腸桿菌EscherichiacoliJM109、克隆載體pMD18-T購自寶生物工程(大連)有限公司；TaqDNA聚合酶、LongTaqDNA聚合酶，分別購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司和天根生化科技(北京)有限公司；限制性內(nèi)切酶DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ、StuⅠ購自NEB(北京)有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司；染色體步移試劑盒Genome Walker Universal Kit，購自BD Biosciences Clontech公司。引物合成與測序服務(wù)由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

1.2 方 法

1.2.1 蘋果基因組DNA的提取 用改良CTAB法提取蘋果基因組DNA[16]。

1.2.2 蘋果PIF TPase基因部分序列的擴(kuò)增 使用PIF TPase簡并引物[17]擴(kuò)增蘋果PIF TPase基因的部分序列。引物序列為PIF1：5′-GGIGCHHTIGATGGHACWCA-3′(編碼氨基酸GALDTH)和PIF2：5′-ATGICKMIRRTRAACAAYTC-3′(編碼氨基酸ELFNPRH)。PCR擴(kuò)增體系為50 μL，包括50～100 ng 基因組DNA，7.5 μL 10×PCR Buffer,5 μL 25 mmol/L MgCl2，1 μL 2.5 mmol/L dNTPs(TaKaRa)，15 pmol PIF1和PIF2引物，2.5 UTaqDNA聚合酶(Promega)。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.2.3 蘋果PIF TPase未知側(cè)翼序列的獲得 采用說明書推薦的4種平端限制性內(nèi)切酶DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和StuⅠ，分別對蘋果基因組DNA進(jìn)行酶切并構(gòu)建染色體步移文庫，酶切反應(yīng)體系參照廠家提供的說明。將酶切后的DNA與接頭(Adaptor和Adaptor plus)于16 ℃連接過夜，并將這些與接頭連接的產(chǎn)物標(biāo)記為染色體步移庫(DL1、DL2、DL3和DL4)，作為PCR反應(yīng)的模板。根據(jù)已知的PIF TPase部分序列——PIF-Malus8，使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異引物GSP引物，引物設(shè)計(jì)要求為：2個(gè)巢式引物長度在26～30 bp，Tm值在67～72 ℃，2個(gè)引物不重疊，內(nèi)外巢式引物距離盡量大于50 bp。用于擴(kuò)增PIF TPase未知側(cè)翼序列的GSP引物序列見表1。

表 1 采用染色體步移技術(shù)擴(kuò)增蘋果PIF TPase未知側(cè)翼序列所用的PCR引物

初始PCR(Primary-PCR)是以adapter primer(AP1)和GSP-out為引物，分別從4個(gè)文庫中取 0.5 μL作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系如下：0.5 μL稀釋10倍的連接產(chǎn)物,2.5 μL BufferⅡ,2 μL 2.5 mmol/L dNTP(TaKaRa),0.5 μL 10 μmol/L AP1引物,0.5 μL 10 μmol/L GSP-out引物, 5 U LongTaqDNA聚合酶(天根),總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 25 s，72 ℃ 3 min，7個(gè)循環(huán)；94 ℃ 25 s，67 ℃ 3 min，32個(gè)循環(huán)；67 ℃延伸7 min；4 ℃保溫。初始PCR反應(yīng)結(jié)束后，將初始PCR產(chǎn)物稀釋50倍，取0.5 μL作模板，以AP2和GSP-in為引物進(jìn)行第2輪巢式PCR(nest-PCR)，其他PCR反應(yīng)成分及用量同初始PCR。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 25 s，72 ℃ 3 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 25 s，67 ℃ 3 min，20個(gè)循環(huán)；67 ℃延伸7 min；4 ℃保溫。結(jié)束反應(yīng)后取8 μL在10 g/L瓊脂糖凝膠中檢測，對主要的第2輪產(chǎn)物進(jìn)行回收和測序。

1.2.4 蘋果MITE的擴(kuò)增 根據(jù)染色體步移所獲得的TSD和TIR特征序列設(shè)計(jì)單向特異引物TIRF1，引物序列為：5′-ATTAGGGGGGTGTATTCAATTAGGA-3′。PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性1 min，66.8 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增體系為50 μL，包括50～100 ng 基因組DNA，5 μL 10×PCR Buffer, 3 μL 25 mmol/L MgCl2，1 μL 2.5 mmol/L dNTPs(TaKaRa)，15 pmol TIRF1引物，2.5 UTaqDNA聚合酶(Promega)。

1.3 蘋果相關(guān)基因序列的分析方法

利用NCBI的BLAST程序?qū)y序結(jié)果進(jìn)行基因注釋，使用Contig Express軟件對序列進(jìn)行拼接，使用EMBOSS的Eiverted軟件查找TIR序列，使用Genedoc軟件進(jìn)行序列同源比對，使用NetGene分析選擇性剪切情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果PIF TPase基因部分序列的分離及其特性

利用PIF TPase簡并引物從蘋果基因組中擴(kuò)增出長度約450 bp的片段(圖1)，將目標(biāo)片段進(jìn)行回收、純化、克隆，挑取18個(gè)單克隆進(jìn)行測序。序列分析結(jié)果表明，該片段具有PIF TPase的典型基序5′-GAL(M)DGTH 和3′-ELFNP(S)R(S)H，并與GenBank上的已知PIF TPase具有較高的同源性，因此，將這些序列注釋為蘋果PIF TPase基因的部分序列，命名為PIF-Malus,PIF代表PIF TPase，Malus代表蘋果，GenBank登錄號為KF999492～KF999509。

圖 1 蘋果PIF轉(zhuǎn)座酶部分序列的PCR擴(kuò)增結(jié)果

由表2可知，這些序列長度介于427～482 bp，有較大差異。通過BLASTX和選擇性剪切分析發(fā)現(xiàn)，PIF-Malus1等9條序列(50%)具有終止子和移碼的雙重突變情況；PIF-Malus5等4條序列(22%)的長度為438 bp，具有未打斷的ORF；PIF-Malus3等其余5條序列(28%)的編碼區(qū)存在內(nèi)含子，內(nèi)含子長度很短，平均86 bp，2個(gè)外顯子區(qū)域均有未打斷的開放閱讀框(open reading frame, ORF)。

表 2 蘋果PIF TPases部分序列的特性

為了研究PIF TPase區(qū)域序列的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，對具有未打斷ORF的PIF-Malus序列進(jìn)行進(jìn)一步分析，先去除內(nèi)含子，再翻譯成氨基酸序列，采用距離法(1 000次重復(fù))建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果(圖2)顯示，這9條功能序列存在一定的異質(zhì)性，序列同源性為80.8%，聚類成3個(gè)家族(F1～F3)。F1家族具有完全的開放閱讀框，不含內(nèi)含子，F(xiàn)2家族具有67 bp的內(nèi)含子，F(xiàn)3家族具有98 bp的內(nèi)含子。F1和F2家族的蘋果PIF TPase序列與擬南芥的Transposase_11具有較高的同源性，被聚類在同一小組，F(xiàn)3家族的蘋果PIF TPase序列與葡萄的Transposase_11具有較高的同源性。

圖 2 基于距離鄰接法構(gòu)建的蘋果PIF轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 蘋果PIF非自主DNA轉(zhuǎn)座子的查找

在進(jìn)行染色體步移過程中，通過Eiverted軟件查找到了TIR，發(fā)現(xiàn)其具有TouristMITE的TSD特征序列(TTA和TAA)，含有43 bp的保守TIR(圖3)，中間區(qū)域883～1 642編碼轉(zhuǎn)座酶，與擬南芥Transposase_11(GenBank 登錄號：CAB72466)具有58%的同源性，但這段區(qū)域發(fā)生移碼突變且包含終止子，不具有轉(zhuǎn)座功能，屬于非自主DNA轉(zhuǎn)座子，因此，將這段長2 704 bp的序列命名為PIFdefectiveDNAtransposonMalus(PIFdMalus)，GenBank登錄號為KJ004499。

圖 3 蘋果PIF非自主DNA轉(zhuǎn)座子與MITE的關(guān)系示意圖

2.3 蘋果MITE的特點(diǎn)

在蘋果PIF非自主DNA轉(zhuǎn)座子PIFdMalus的TIR區(qū)域設(shè)計(jì)特異的單向引物(TIRF1)，通過PCR擴(kuò)增獲得了大小為400 bp左右的片段，將目標(biāo)片段進(jìn)行回收、純化、克隆，挑取4個(gè)單克隆進(jìn)行測序。結(jié)果(圖4)顯示：(1)它們具有TouristMITE的TSD特征序列(TTA)；(2)具有21 bp的保守TIR，即5′-GGGGGGTGTATTCAATTAGGA～TCCTAATTGAATACACCCCCCTAA-3′(圖3)；(3)這些序列長度很小，并且富含A+T，其含量在69.2%～72.5%(表3)；(4)它們之間具有較高的同源性，序列同源性在73.6%～99.8%(表4)；(5)它們具有較低的自由能(ΔG)值(-201.9～-216.0 kJ/mol，表3)，容易形成二級結(jié)構(gòu)(圖5)。這些特點(diǎn)表明，這4條序列具有MITE的典型特征，可以認(rèn)定為蘋果基因組中一個(gè)屬于Tourist家族的新MITE，命名為MITEMalus1～4，GenBank登錄號為KJ004500～KJ004503。

圖 4 蘋果MITE的核苷酸序列

表 3 植物中不同MITE家族的特性

表 4 蘋果MITE核苷酸序列的同源性

3 討 論

PIF TPase基因廣泛存在于植物基因組中，Zhang等[17]采用PIF TPase簡并引物，從20種禾本科植物中擴(kuò)增出約360 bp和450 bp的2種片段；Remigereau等[18]從珍珠稷中也擴(kuò)增到約350 bp和450 bp的2種片段。本研究采用相同引物從蘋果基因組中分離出約450 bp 的片段，與前人結(jié)果不同，但測序后發(fā)現(xiàn)這18條蘋果PIF TPase基因的部分序列長度不等，序列之間也有差異。這可能是在基因組長期進(jìn)化中形成的，基因組會在轉(zhuǎn)座激活和轉(zhuǎn)座抑制之間保持動(dòng)態(tài)平衡[19]，一些TPases會不斷地累積突變，最終失去轉(zhuǎn)座功能，如本研究中50%的蘋果PIF TPase是移碼或終止子突變產(chǎn)生的假基因，另一些TPase可能對基因組有利，保留了可翻譯的ORF，可能具有轉(zhuǎn)座活性。因此，推測蘋果PIF TPase仍可能是活躍的，可以通過識別TIR位點(diǎn)來驅(qū)動(dòng)MITE轉(zhuǎn)座。

MITE的起源和形成機(jī)制是自主DNA轉(zhuǎn)座子在基因組進(jìn)化過程中發(fā)生內(nèi)部缺失，產(chǎn)生不同長度的非自主DNA轉(zhuǎn)座子，這些非自主DNA轉(zhuǎn)座子的TPase不具備轉(zhuǎn)座驅(qū)動(dòng)能力，但是，其中一個(gè)或幾個(gè)長度較小的非自主DNA轉(zhuǎn)座子在相應(yīng)的自主DNA轉(zhuǎn)座子的TPase順式驅(qū)動(dòng)下發(fā)生復(fù)制，激增至高拷貝，最終形成MITE[13,20]。研究表明，PIF/Harbinger和Tc1/marineDNA轉(zhuǎn)座子分別調(diào)控MITE的Tourist和Stowaway元件，此后陸續(xù)證明大多數(shù)DNA轉(zhuǎn)座子家族都有相應(yīng)的MITE[3,21-23]。本研究利用蘋果非自主DNA轉(zhuǎn)座子的典型TSD和TIR序列，通過TIR引物成功擴(kuò)增到蘋果MITE，驗(yàn)證了蘋果PIF家族DNA轉(zhuǎn)座子與MITEMalus的相關(guān)性，但蘋果MITEMalus與PIF DNA 轉(zhuǎn)座子的相似關(guān)系僅限于TPase調(diào)控的TIR序列，內(nèi)部不含有相似序列，這一結(jié)果與擬南芥、水稻、玉米、葡萄、酵母等的MITE結(jié)果相似[24-32]。

在植物基因組中，MITEs的長度很小，相對于較大的DNA轉(zhuǎn)座子大部分被沉默的結(jié)果，MITEs更加適應(yīng)于宿主基因組的環(huán)境，在整個(gè)進(jìn)化過程中更容易保持轉(zhuǎn)座活性，MITEs經(jīng)常與基因相連，可以對基因表達(dá)產(chǎn)生較大影響，并且它們的高拷貝數(shù)也對基因組有很大影響[20]。本研究分離得到的蘋果MITEMalus與李的ACC氧化酶基因(ACO)的啟動(dòng)子和5′非翻譯區(qū)(5′-untranslated region，5′UTR)具有較高的相似性，同源性為82%～93%，并且在這個(gè)基因內(nèi)形成了非常顯著的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。MITEs比較傾向于插入基因的啟動(dòng)子、UTRs、內(nèi)含子、外顯子區(qū)域[3-4]，這種插入特異性可能是在基因組的長期進(jìn)化選擇壓力下形成的，這樣MITEs可以采用多種方式來調(diào)解mRNA，包括穩(wěn)定性、進(jìn)程和通過轉(zhuǎn)錄后水平基因沉默(Post-transcriptional gene silencing，PTGS)來降解mRNA[6,10,12,33-35]。目前，已經(jīng)在水稻、馬鈴薯、花生、葡萄中發(fā)現(xiàn)了有轉(zhuǎn)座活性的MITE家族[21,36-39]，為了進(jìn)一步研究蘋果MITEs的轉(zhuǎn)座活性，以這4條蘋果MITE作為比對序列對NCBI的除人類之外的EST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLASTN搜索，結(jié)果顯示，蘋果MITEMalus在EST數(shù)據(jù)庫中的匹配序列高達(dá)50多條植物EST，有一定的表達(dá)量，而且其中大部分EST是來自蘋果基因組的，推測本研究分離的蘋果MITEMalus家族在蘋果基因組中有表達(dá)，可能是一個(gè)活躍的轉(zhuǎn)座元件。

本研究分離得到的蘋果Tourist家族MITE，起源于蘋果PIF轉(zhuǎn)座子，可能具有轉(zhuǎn)座活性，因此將進(jìn)一步研究其在蘋果基因組中的拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)座活性和分布，以揭示MITEMalus在蘋果基因組和基因進(jìn)化中的作用。

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