黃瓜高頻再生體系的建立

萬旭花,陳書霞,申曉青,陳為峰,張然然,成思瓊

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

黃瓜(CucumissativusL.)為葫蘆科黃瓜屬1年生草本植物，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和食療作用，尤其是具有獨(dú)特的清香風(fēng)味，廣受消費(fèi)者喜愛。在長期的定向選擇和育種實(shí)踐中，人們傾向于選擇抗病優(yōu)質(zhì)的黃瓜品種，這造成黃瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄，因此常規(guī)育種的發(fā)展面臨著桎梏。利用基因工程進(jìn)行黃瓜新種質(zhì)創(chuàng)制已成為重要的手段之一[1-2]，其中通過遺傳轉(zhuǎn)化途徑進(jìn)行新種質(zhì)創(chuàng)制的前提是建立黃瓜的高頻再生體系[3-4]。

關(guān)于黃瓜離體再生已有許多報(bào)道。前人從不同外植體類型如子葉[5-6]、子葉節(jié)[7-8]、下胚軸[9]、真葉[10]，不同的激素組合[11-14]和苗齡[15-16]等方面，研究了不同因素對黃瓜再生體系建立的影響，結(jié)果表明，不同基因型黃瓜適宜的激素組合及濃度不同[13-17]，子葉切割及接種方式會對黃瓜再生效率產(chǎn)生重要影響[7-8]，由此可見，不同因素對再生頻率的影響很大[17-20]。在具體實(shí)踐中，仍存在黃瓜再生率較低、重復(fù)性差、培養(yǎng)周期長等問題。因此，在實(shí)際操作中，需要進(jìn)一步對上述影響因素進(jìn)行優(yōu)化和探索。本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，對影響歐洲型黃瓜和華北型黃瓜種質(zhì)再生體系的因素進(jìn)行了優(yōu)化研究，以期為黃瓜種質(zhì)的遺傳轉(zhuǎn)化奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

華北型黃瓜26號種質(zhì)、歐洲型黃瓜14-1種質(zhì)，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組提供。

1.2 方 法

試驗(yàn)在西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.1 黃瓜無菌苗的獲得 挑選顆粒飽滿一致的黃瓜種子，用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇消毒90 s，再用體積分?jǐn)?shù)30%的次氯酸鈉消毒25 min，期間不斷搖動，消毒后用無菌水沖洗4～5次，無菌濾紙吸干水分后，接種于裝有MS 培養(yǎng)基的三角瓶中，每瓶接種8粒種子，遮光培養(yǎng)2～3 d后，置于室溫22～25 ℃、光照時(shí)間16 h/d、光照強(qiáng)度2 000 lx條件下培養(yǎng)5 d，即可獲得無菌苗。

1.2.2 黃瓜芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素配比 芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS附加不同質(zhì)量濃度的6-BA(0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mg/L)和IAA(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/L)，MS附加不同質(zhì)量濃度的6-BA(0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mg/L)和ABA(0.1，0.5，1.0，1.5，2.0 mg/L)，另附加7 g/L瓊脂和30 g/L蔗糖，pH 5.8。在上述添加不同激素配比的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行芽誘導(dǎo)，每處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件同1.2.1。芽誘導(dǎo)10～15 d后，統(tǒng)計(jì)各處理叢生芽誘導(dǎo)及芽生長情況，確定最適宜的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.2.3 AgNO3質(zhì)量濃度對黃瓜芽誘導(dǎo)的影響 為了研究AgNO3質(zhì)量濃度對黃瓜芽誘導(dǎo)及生長的影響，在篩選出的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，分別附加不同質(zhì)量濃度的AgNO3(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/L)，培養(yǎng)條件同1.2.1。每處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)2周后觀察統(tǒng)計(jì)不定芽數(shù)目及生長情況。

1.2.4 苗齡對黃瓜芽誘導(dǎo)的影響 分別以培養(yǎng)4，5，6，7 d的14-1無菌苗為材料，切去子葉端部2/3并附帶1 mm的子葉柄，采用豎直方式插入MS+3.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L ABA+1.0 mg/L AgNO3培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同1.2.1。每處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)2周后觀察統(tǒng)計(jì)不定芽數(shù)目及生長情況。

1.2.6 接種方式對黃瓜芽誘導(dǎo)的影響 以5 d苗齡的14-1無菌苗為材料，切除子葉端部2/3并附帶1 mm的子葉柄，以此為外植體分別以豎直插入(b1)、葉背向下平接(b2)、葉背向下子葉柄微插入(b3)的方式，接種于MS+3.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L ABA+1.0 mg/L AgNO3培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同1.2.1。培養(yǎng)2周后觀察并統(tǒng)計(jì)再生芽。

1.2.7 黃瓜不定芽的伸長及生根培養(yǎng) 芽伸長培養(yǎng)按照金寶燕等[21]的方法進(jìn)行。切取再生芽轉(zhuǎn)入含有0.5 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行芽伸長培養(yǎng)，待芽伸長到1.5 cm左右，從主莖基部切取伸長的芽轉(zhuǎn)入1/2 MS培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。

1.2.8 數(shù)據(jù)調(diào)查與統(tǒng)計(jì) 接種外植體后進(jìn)行出芽率及出芽系數(shù)的統(tǒng)計(jì)[8]。

再生率=出芽外植體數(shù)/接種總外植體數(shù)×100%；

再生系數(shù)=出芽總數(shù)/接種總外植體數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素組合對黃瓜再生的影響

2.1.1 6-BA和IAA不同質(zhì)量濃度組合對黃瓜子葉節(jié)再生的影響 由表1可知，適宜的6-BA和IAA激素配比能夠誘導(dǎo)14-1和26號黃瓜種質(zhì)子葉節(jié)芽的再生，但不同的激素組合對芽的再生效率不同。隨著6-BA質(zhì)量濃度的增大，黃瓜子葉芽再生率和再生系數(shù)呈增大趨勢，但在一定質(zhì)量濃度(≥2.0 mg/L)的6-BA下，芽再生率和再生系數(shù)隨著IAA質(zhì)量濃度的增大先增加后減小。較低的6-BA質(zhì)量濃度(0.5～1.0 mg/L)及較高的IAA質(zhì)量濃度(0.3～0.5 mg/L)組合時(shí),不能有效地誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生。在激素組合為4.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IAA的MS培養(yǎng)基上，14-1的子葉節(jié)不定芽的再生效果較好，再生率可達(dá)76.70%，再生系數(shù)可達(dá)2.08(圖1B)。 26號子葉節(jié)的再生隨激素質(zhì)量濃度的變化趨勢同14-1，但其在激素組合為4.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA的MS培養(yǎng)基上再生效率較高，再生芽的生長狀態(tài)良好，再生率和再生系數(shù)分別可達(dá)78.67%和2.10。

表 1 6-BA和IAA不同質(zhì)量濃度組合對黃瓜子葉節(jié)再生的影響

2.1.2 6-BA和ABA不同質(zhì)量濃度組合對黃瓜子葉節(jié)再生的影響 分別對14-1和26號黃瓜種質(zhì)的子葉節(jié)進(jìn)行6-BA和ABA組合的芽誘導(dǎo)試驗(yàn)，10 d 后可見2份種質(zhì)的子葉節(jié)處都有芽點(diǎn)出現(xiàn)。在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)到15 ～18 d后，子葉節(jié)部位有大量叢生芽點(diǎn)出現(xiàn)，且芽點(diǎn)略有伸長。由表2可知，不同激素組合對不同基因型黃瓜芽再生率的影響不同。較低質(zhì)量濃度的6-BA (0.5～1.0 mg/L)與較高質(zhì)量濃度的ABA(2.0 mg/L)組合時(shí)，14-1種質(zhì)的子葉節(jié)不能誘導(dǎo)出不定芽；而在較低質(zhì)量濃度的6-BA(0.5～1.0 mg/L)下，26號種質(zhì)的子葉節(jié)芽再生率高于14-1。14-1種質(zhì)的子葉節(jié)在3.0 mg/L 6-BA與2.0 mg/L ABA組合時(shí)再生效果較好，再生率為78.30%，再生系數(shù)為2.14(圖1C)；而26號種質(zhì)的子葉節(jié)則在4.0 mg/L 6-BA與1.5 mg/L ABA 組合時(shí)再生效果較好，再生率可達(dá) 73.33%，再生系數(shù)可達(dá)2.08。

黨的十九大報(bào)告指出：中國特色社會主義進(jìn)入新時(shí)代，我國社會的主要矛盾已經(jīng)轉(zhuǎn)化為人民日益增長的美好生活需要和不平衡不充分的發(fā)展之間的矛盾。人民需要什么，需要解決什么，這是黨面臨的主要任務(wù)，是黨的奮斗目標(biāo)，黨的十九大報(bào)告對此指明了方向。生老病死是人生常態(tài)，生而快樂、老有所養(yǎng)、病有所醫(yī)、死而安詳，無疑是人民美好生活的具體體現(xiàn)。上述兩個(gè)案例說明，我國醫(yī)療保障還有不如意的地方，30多年醫(yī)療改革還存在不夠徹底的地方。基于此，對進(jìn)一步完善我國醫(yī)療改革提出如下建議。

表 2 6-BA和ABA不同質(zhì)量濃度組合對黃瓜子葉節(jié)再生的影響

圖 1 黃瓜種質(zhì)14-1子葉節(jié)芽的再生過程

2.2 AgNO3質(zhì)量濃度對黃瓜子葉節(jié)再生的影響

14-1和 26號黃瓜種質(zhì)的子葉節(jié)分別在添加 3.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L ABA、4.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA的MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行不同AgNO3質(zhì)量濃度對黃瓜子葉節(jié)再生的影響試驗(yàn)，結(jié)果見表3。由表3可知，0.5～1.5 mg/L的 AgNO3對黃瓜子葉節(jié)不定芽的生成都有促進(jìn)作用，且與不加AgNO3時(shí)相比差異顯著，其中以AgNO3為1.0 mg/L時(shí)再生效果最好，14-1和26號的再生率分別達(dá)到86.70%和85.00%，再生系數(shù)分別達(dá)到 2.77 和2.51；當(dāng)AgNO3質(zhì)量濃度≥2.0 mg/L時(shí)芽的再生受到抑制，再生率和再生系數(shù)降低。

表 3 AgNO3質(zhì)量濃度對黃瓜子葉節(jié)再生的影響

2.3 苗齡對黃瓜子葉節(jié)再生的影響

在3.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L ABA+1.0 mg/L AgNO3的MS培養(yǎng)基上，進(jìn)行不同苗齡對14-1黃瓜種質(zhì)子葉節(jié)再生的影響試驗(yàn)，結(jié)果見表4。由表4可知，4 d和7 d苗齡黃瓜無菌苗子葉節(jié)的再生率和再生系數(shù)都較低，4 d的無菌苗子葉呈黃綠色，極其幼嫩，子葉節(jié)不能再生；7 d的無菌苗2片子葉已完全展開，呈深綠色且生長點(diǎn)較大，但子葉節(jié)的再生率僅有51.00%；5 d苗齡的子葉節(jié)再生能力最強(qiáng)，再生率可達(dá)87.35%，再生系數(shù)可達(dá)3.38。說明外植體的生理狀態(tài)對子葉節(jié)再生至關(guān)重要。

表 4 苗齡對黃瓜14-1種質(zhì)子葉節(jié)再生的影響

2.4 子葉切割方式對黃瓜子葉節(jié)再生的影響

在MS培養(yǎng)基中附加3.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L ABA+1.0 mg/L AgNO3，對5 d苗齡的14-1黃瓜種質(zhì)進(jìn)行子葉切割方式試驗(yàn)，結(jié)果(表5)表明，黃瓜子葉節(jié)的大小和部位對再生都有影響，以a4再生力最強(qiáng)，即切除子葉端部2/3且?guī)в? mm子葉柄時(shí)，再生率達(dá)81.53%，再生系數(shù)達(dá)2.09。

表 5 子葉切割方式對黃瓜14-1種質(zhì)子葉節(jié)再生的影響

2.5 接種方式對黃瓜子葉節(jié)再生的影響

接種方式對黃瓜子葉節(jié)再生也有一定的影響。接種方式對黃瓜種質(zhì)14-1子葉節(jié)再生的影響見表6。

表 6 接種方式對黃瓜種質(zhì)14-1子葉節(jié)再生的影響

由表6可知，接種方式對黃瓜子葉節(jié)不定芽再生的影響沒有其他因素明顯，不同接種方式下再生率均可達(dá)80%左右，再生系數(shù)可達(dá)2.00以上，但3種接種方式對子葉再生影響仍存在顯著差異，以葉背向下子葉柄微插入的接種方式(b3)較其他2種方式的再生力強(qiáng)，再生率可達(dá)86.13%，再生系數(shù)可達(dá) 2.34；豎直插入方式(b1)再生力強(qiáng)于葉背向下平接方式(b2)。

2.6 黃瓜再生芽的伸長及生根

將再生的不定芽轉(zhuǎn)入加有0.5 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基中，10 d左右芽伸長至1.5 cm(圖1D)，將其從基部切下轉(zhuǎn)入1/2 MS培養(yǎng)基中，5～7 d后有白色的根形成(圖1E)，10 d左右大量根產(chǎn)生，形成生理狀態(tài)良好的再生植株(圖1F)。

3 討 論

黃瓜再生能力弱，且不同基因型、外植體類型對其再生的影響都有很大差異[22]。何曉明等[5]、侯愛菊等[19]研究表明，黃瓜可通過直接分化再生、愈傷組織再生、胚狀體再生和原生質(zhì)體再生等途徑再生植株，而子葉一般作為黃瓜再生較理想的外植體，可直接通過器官分化途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽，縮短培養(yǎng)周期。本研究以歐洲型黃瓜14-1和華北型黃瓜26號為試驗(yàn)材料，以子葉為外植體分析了多個(gè)因素對黃瓜子葉節(jié)再生的影響，建立了黃瓜14-1和26號種質(zhì)材料的高頻再生體系，為外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果表明，對于歐洲水果型黃瓜材料14-1最適的激素配比是3.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L ABA+1.0 mg/L AgNO3，在此誘導(dǎo)條件下再生率可達(dá)86.70%，再生系數(shù)可達(dá)2.77，與其他激素組合有顯著差異。由于是通過器官直接發(fā)生途徑，因此此過程中最好不要產(chǎn)生過多的愈傷組織，而6-BA和ABA組合可抑制愈傷組織的形成，提高芽分化率。王艷蓉等[11]對S05和S06 2個(gè)黃瓜基因型的芽誘導(dǎo)試驗(yàn)也得出了相似的結(jié)論，但其試驗(yàn)中6-BA質(zhì)量濃度是3.0 mg/L，ABA的質(zhì)量濃度為0.5～1.0 mg/L。華北型自交系黃瓜材料26號適宜的芽誘導(dǎo)激素組合是 4.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA+1.0 mg/L AgNO3，在此誘導(dǎo)條件下再生率可達(dá)到85.00%，再生系數(shù)可達(dá)到2.51。薛丹丹等[12]對津研4號芽的誘導(dǎo)試驗(yàn)表明，在激素組合未加AgNO3的條件下，同為華北型的津研4號出芽率和出芽系數(shù)分別為 85.00% 和2.51。此外，趙雋等[7]和趙宇瑛等[13]的研究也表明，華北型黃瓜較適宜的激素組合是6-BA和IAA。14-1和26號黃瓜材料的最適芽誘導(dǎo)激素組合不同，這主要是由于基因型不同所致。

研究表明，AgNO3可有效促進(jìn)器官發(fā)生[23]，在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加一定質(zhì)量濃度的AgNO3，對不定芽的誘導(dǎo)有促進(jìn)作用。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，未加AgNO3時(shí)，6-BA+IAA組合子葉切口處產(chǎn)生的愈傷組織較6-BA+ABA組合多，添加AgNO3后則不易產(chǎn)生愈傷組織，說明AgNO3抑制了愈傷組織的形成。本研究中1.0 mg/L的AgNO3對芽誘導(dǎo)效果最好，這與李建欣等[24]的結(jié)果一致。還有研究表明，促進(jìn)黃瓜不定芽再生的AgNO3質(zhì)量濃度為2.0 mg/L[11-20]，這可能是由于所使用材料的基因型及其生理狀態(tài)等因素不同所致。遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)研究也表明，向黃瓜再生和篩選培養(yǎng)基中添加一定質(zhì)量濃度的AgNO3能夠有效促進(jìn)抗性芽的再生，說明AgNO3在遺傳轉(zhuǎn)化中對于抗性芽的再生具有關(guān)鍵作用[25-27]。

苗齡是影響黃瓜再生的關(guān)鍵因子之一，不同苗齡的子葉再生能力是不同的。Colijn-Hooymans等[15]報(bào)道，再生能力與無菌苗的發(fā)育階段有關(guān)，當(dāng)子葉處于垂直生長階段，其再生頻率較高，而當(dāng)子葉處于水平生長(2片子葉張開)階段時(shí)，其再生能力顯著降低。本研究表明，5 d苗齡的無菌苗，子葉全部轉(zhuǎn)綠，2片子葉呈豎直狀態(tài)且微分開時(shí)芽的再生效果最好，隨著苗齡的增大，其再生率降低。這與韓欣等[16]、薛丹丹等[12]的研究結(jié)果一致；而趙雋等[7]研究認(rèn)為，10 d苗齡的黃瓜子葉再生效果較好，Colijn-Hooymans等[15]發(fā)現(xiàn)苗齡為3～5 d的子葉外植體的不定芽發(fā)生率最高，梅茜等[14]則認(rèn)為1～2 d苗齡的芽再生率較高。上述研究結(jié)果的差異，主要是由基因型、生理狀態(tài)、培養(yǎng)條件等因素造成的。

黃瓜再生可通過子葉、真葉、下胚軸、胚根、胚和子葉節(jié)等外植體進(jìn)行，但較為理想的再生方式是子葉再生，其子葉的大小和部位又是影響再生的關(guān)鍵因素。趙雋等[7]研究表明，保留2片子葉，且各切除子葉的1/3時(shí)外植體出芽最好；范愛麗等[8]認(rèn)為，保留單片子葉，下胚軸縱切，去除頂芽并切除此子葉的2/3是最佳的切割方式。本研究結(jié)果表明，切除子葉端部2/3并帶有1 mm子葉柄時(shí)再生率可達(dá)81.53%，再生系數(shù)可達(dá)2.09，且以葉背向下子葉柄微插入的方式接種，其不定芽的再生最好。

黃瓜再生體系研究中關(guān)于外植體具體的接種方式目前沒有詳細(xì)的闡述，大多數(shù)研究是以平鋪方式進(jìn)行的，范愛麗等[8]認(rèn)為豎直插入為最佳的接種方式，本試驗(yàn)以葉背向下子葉柄微插入培養(yǎng)基的方式接種芽的再生最佳。外植體的接種方式對不定芽再生造成的影響可能與植物體的極性有關(guān)，具體機(jī)理還需進(jìn)一步探究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Liu L Y,Duan L S,Zhang J C,et al.Cucumber (CucumissativusL.) over-expressing cold-induced transcriptome regulator ICE1 exhibits changed morphological characters and enhances chilling tolerance [J].Scientia Horticulturae,2010,124:29-33.

[2] Tabei Y,Kitade S,Nishizawa Y.Transgenic cucumber plants ha-rboring a rice chitinase gene exhibit enhanced resistance to gray mold (Botrytiscinerea) [J].Plant Cell Reports,1998,17:159-164.

[3] Kielkiewicz M,Gajc-Wolska J,Slusarz S,et al.Growth development and yield of transgenic 35S-thaumatin Ⅱ-expressing cucumber plants-open field evaluation [J].Scientia Horticulturae,2012,143:82-91.

[4] 張若緯，顧興芳,王 燁,等.基因型和6-BA對黃瓜子葉節(jié)再生頻率的影響 [J].中國蔬菜,2009(22):45-48.

Zhang R W,Gu X F,Wang Y,et al.Effects of genotypes and 6-BA on regeneration frequency of cotyledonary nodes in cucumber (CucumissativusL.) [J].China Vegetables,2009(22):45-48.(in Chinese)

[5] 何曉明,林毓娥.黃瓜子葉和下胚軸的離體培養(yǎng) [J].植物生理學(xué)通訊,2001,37(5)：423-424.

He X M,Lin Y E.Invitroculture of cotyledon and hypocotyl inCucumissativus[J].Plant Physiology Communications,2001,37(5):423-424.(in Chinese)

[6] 杜勝利,魏惠軍,魏愛民,等.苗齡、基因型和外植體類型對黃瓜離體器官發(fā)生的影響 [J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué),2000,6(4):1-5.

Du S L,Wei H J,Wei A M,et al.Effects of seedling stage, genotype and explant type oninvitrosomatic organogenesis of cucumber [J].Tianjin Agricultural Science,2000,6(4):1-5.(in Chinese)

[7] 趙 雋,王 華,潘俊松,等.黃瓜子葉節(jié)離體再生體系的研究 [J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)科學(xué)版,2004,22(1):43-53.

Zhao J,Wang H,Pan J S,et al.Invitroculture and plantlet regeneration from cotyledonary nodes of cucumber(CucumissativusL.) [J].Journal of Shanghai Jiaotong University:Agricultural Science Edition,2004,22(1):43-53.(in Chinese)

[8] 范愛麗,孫艷麗,徐凌飛,等.黃瓜子葉節(jié)再生體系優(yōu)化研究 [J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2006,34(9):69-73.

Fan A L,Sun Y L,Xu L F,et al.Optimum study ofinvitroculture and plantlet regeneration system from cotyledonary nodes of cucumber (CucumissativusL.) [J].Journal of Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry:Natural Science Edition,2006,34(9):69-73.(in Chinese)

[9] 趙秀娟,吳定華.黃瓜的組織培養(yǎng) [J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1998,19(4):125-126.

Zhao X J,Wu D H.Tissue culture of cucumber [J].Journal of South China Agricultural University,1998,19(4):125-126.(in Chinese)

[10] 董靈迪.黃瓜組織培養(yǎng)研究 [J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,22(1):23.

Dong L D.Studies on tissue culture cucumber [J].Journal of Southwest Agricultural University,2000,22(1):23.(in Chinese)

[11] 王艷蓉,陳麗梅,潘俊松,等.黃瓜子葉高效再生體系的建立與遺傳轉(zhuǎn)化 [J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)科學(xué)版,2006,24(2):152-156.

Wang Y R,Chen L M,Pan J S,et al.Establishment of high effective regeneration system in cucumber(CucumissativusL.) and agrobacterium tumefaciens mediated genetic transformation [J].Journal of Shanghai Jiaotong University:Agricultural Science Edition,2006,24(2):152-156.(in Chinese)

[12] 薛丹丹,張鳳生,王保菊,等.黃瓜再生體系的建立 [J].北方園藝，2010(7):119-121.

Xue D D,Zhang F S,Wang B J,et al.The regeneration system of cucumber [J].Northern Horticulture,2010(7):119-121.(in Chinese)

[13] 趙宇瑛,李永輝,李叢玉,等.6-BA、NAA和IAA對黃瓜子葉離體培養(yǎng)分化的影響 [J].長江大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,4(3):26-28.

Zhao Y Y,Li Y H,Li C Y,et al.Influences of 6-BA,NAA and IAA on cotyledons differentiation of cucumberinvitro[J].Journal of Yangtze University:Natural Science Edition,2007,4(3):26-28.(in Chinese)

[14] 梅 茜,張興國.黃瓜組織培養(yǎng)研究 [J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,24(3):266-267.

Mei Q,Zhang X G.Studies on tissue culture cucumber [J].Journal of Southwest Agricultural University,2002,24(3):266-267.(in Chinese)

[15] Colijn-Hooymans C M,Hakkert J C,Jansen J J.Competence for regeneration of cucumber cotyledons is restricted to specific developmental stages [J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,1994,39:211-217.

[16] 韓 欣,張衛(wèi)華,曹齊衛(wèi),等.黃瓜子葉節(jié)再生體系的建立 [J].吉林蔬菜,2009(2):86-87.

Han X,Zhang W H,Cao Q W,et al.The establishment of regeneration system from cotyledonary nodes ofCucumissativusL. [J].Jilin Vegetables,2009(2):86-87.(in Chinese)

[17] 張衛(wèi)華,朱妍妍,王志峰,等.三個(gè)不同基因型黃瓜再生體系的優(yōu)化研究 [J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2007(6):5-7.

Zhang W H,Zhu Y Y,Wang Z F,et al.Studies on optimizing cucumber regeneration system of three different genotypes [J].Shandong Agricultural Sciences,2007(6):5-7.(in Chinese)

[18] 余陽俊,朱其杰.黃瓜成熟胚離體培養(yǎng)中的胚狀體誘導(dǎo)和植株再生 [J].植物生理學(xué)通訊,1992,28(1):37-39.

Yu Y J,Zhu Q J.Embryoid induction aud plantlet regeneration in mature embryos of cucumberinvitro[J].Plant Physiology Communications,1992,28(1):37-39.(in Chinese)

[19] 侯愛菊,朱延明,楊愛馥,等.誘導(dǎo)黃瓜直接器官發(fā)生主要影響因素的研究 [J].園藝學(xué)報(bào),2003,30(1)：101-103.

Hou A J,Zhu Y M,Yang A F,et al.Main factors influencing the frequency of direct organogenesis of cucumberinvitro[J].Acta Horticulturae Sinica,2003,30(1):101-103.(in Chinese)

[20] 張若緯,顧興芳,王 燁,等.不同黃瓜基因型子葉再生體系的建立 [J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2010,25(增刊):50-54.

Zhang R W,Gu X F,Wang Y,et al.Regeneration system establishment from cotyledons in different cucumber (CucumissativusL.) genotypes [J].Acta Agriculturae Boreali-Sinica,2010,25(Suppl.):50-54.(in Chinese)

[21] 金寶燕,蘇 華,任華中.影響黃瓜直接不定芽誘導(dǎo)的品種等因素研究 [J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2006,22(6):45-48.

Jin B Y,Su H,Ren H Z.Effects of cultivar etc on direct shoot induction from cotyledonary nodes of cucumber [J].Chinese Agricultural Science Bulletin,2006,22(6):45-48.(in Chinese)

[22] Sarmento G S,Alpert K,Tang F A.Factors influencing agro-bacterium tumefaciens-mediated transformation and expression of kanamycin resistance in Pickling cucumber [J].Plant Cell Organ Cult,1992,31:185-193.

[23] 張 鵬,凌定厚.提高菜心離體植株再生頻率的研究 [J].植物學(xué)報(bào),1995,37(11):902-908.

Zhang P,Ling D H.Enhancement of plant regeneration rate ofBrassicaparachinensisculturedinvitro[J].Acta Botanica Sinica,1995,37(11):902-908.(in Chinese)

[24] 李建欣,李建吾,葛桂民.黃瓜子葉離體再生體系研究 [J].長江蔬菜,2008(1):44-46.

Li J X,Li J W,Ge G M.Invitroculture and plantlet regeneration from cotyledon ofCucumissativusL. [J].Journal of Changjiang Vegetables,2008(1):44-46.(in Chinese)

[25] 賴 來,潘俊松,何歡樂,等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的MADS-box基因轉(zhuǎn)化黃瓜初步研究 [J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)科學(xué)版,2007,25(4):374-382.

Lai L,Pan J S,He H L,et al.Agrobacterium-mediated genetic transformation of cucumber(CucumissativusL.) withMADS-boxlike gene [J].Journal of Shanghai Jiaotong University:Agricultural Science Edition,2007,25(4):374-382.(in Chinese)

[26] Perl A,Aviv D,Galun E.Ethylene andinvitroculture of potato:Suppression of ethylene generation vastly improves protoplast yield,planting efficiency and transient expression of an alien gene [J].Plant Cell Rep,1988,7:403-406.

[27] DeBlock M,DeByouwer D,Tenning P.Transformation ofBra-ssicanapusandBrassicaderaceausingAgrobacteriumtumefaciensand the expression of thebarandneogenes in the transgenic plants [J].Plant Physiol,1989,91:694-701.