• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    定量蛋白質(zhì)組學在納米銀材料中的研究進展

    2014-03-26 00:41:19孫明波陳文博戴政寧
    中外醫(yī)療 2014年35期
    關鍵詞:納米銀組學質(zhì)譜

    劉 贊 于 瀅 孫明波 陳文博 戴政寧 鐘 飛 余 洋

    1.遼寧省醫(yī)療器械檢驗檢測院,遼寧沈陽 110179;2.沈陽藥科大學,遼寧沈陽 110016

    定量蛋白質(zhì)組學在納米銀材料中的研究進展

    劉 贊1于 瀅1孫明波1陳文博1戴政寧2鐘 飛2余 洋1

    1.遼寧省醫(yī)療器械檢驗檢測院,遼寧沈陽 110179;2.沈陽藥科大學,遼寧沈陽 110016

    iTRAQ是2004年開發(fā)的一種新的同位素標記試劑,結合MRM技術已經(jīng)被廣泛的應用于細菌、酵母、體液、微生物、人體組織和細胞等多種樣本的蛋白質(zhì)鑒定、定量以及對目的蛋白的驗證中。目前,由于iTRAQ能同時對2-8組樣品進行標記分析并具有高通量、重復性、敏感性高等特點使其為進行納米銀生物醫(yī)學材料毒性評估提供了有力的技術平臺。

    同位素相對與絕對定量技術;多反應監(jiān)測;納米銀;蛋白質(zhì)

    近年來研究蛋白質(zhì)相對和絕對定量的常用質(zhì)譜分析技術是同位素標記,如2004年開發(fā)的較新的技術iTRAQ等。采用i-TRAQ進行蛋白質(zhì)的相對和絕對定量,其結果可以得到500~600種蛋白。通過大規(guī)模數(shù)據(jù)分析,采用質(zhì)譜多反應監(jiān)測(MRM)對篩選出來的蛋白進行確證。MRM技術是一種基于已知信息或假定信息有針對性地獲取數(shù)據(jù),進行質(zhì)譜信號采集的技術。目前,它已經(jīng)成為生物標志物大規(guī)模臨床確診的主要手段。未來,iTRAQ結合MRM在探求未知復雜疾病領域中將成為一種有效性和可靠性較高的技術[2]。

    納米技術是在0.1~100 nm空間尺度內(nèi)操縱原子和分子,研究物質(zhì)的特性和相互作用,并利用這些特性的多學科交叉的一門綜合性科學技術[3-4]。然而,如何評價納米材料的毒性和安全性還沒有統(tǒng)一的標準。我國食品藥品監(jiān)督管理局報道,到目前為止我國已有188件國產(chǎn)納米醫(yī)療器械和6件進口納米醫(yī)療器械通過了國家局或省級藥監(jiān)局的審批進行臨床應用[5]。迄今,有關納米銀對人體的負效應,尤其是長期頻繁或大量使用時的慢性毒性尚不清楚。因此,建立完善的既符合我國特點又與國際接軌的技術標準體系,保證其安全使用是至關重要的。

    綜上,該文就iTRAQ結合MRM技術及其在納米生物醫(yī)學材料毒性評估中的現(xiàn)狀及進展進行綜述。

    1 iTRAQ技術特點和應用領域

    1.1 iTRAQ技術特點

    在一次實驗中可同時標記2~8個樣品,一次實驗實現(xiàn)多達8個樣品的蛋白質(zhì)鑒定和定量,定性與定量同時進行;適用范圍較廣;所需樣品較少,可處理微量樣品;13C,15N,18O在 scx或RP預分離時,不會影響肽段的行為,任意肽段理論上都可能被標記,擁有極高的標記效率;每個蛋白都有多個肽段被標記,提高了鑒定和定量可靠性;平衡集團在質(zhì)譜碎裂時會中性丟失,不爭奪電荷,鑒定時,來源于不同樣品的報告集團會分離得很清楚(113-121Da,skip120),而來源于不同樣品的相同肽段在質(zhì)譜上表現(xiàn)為一同個峰,強度疊加可有效改善圖譜鑒定,有利于鑒定。

    1.2 iTRAQ的應用領域

    iTRAQ試劑可用于標記不同性質(zhì)的樣品,如微生物(500 mg),動物組織(500 mg)[6],植物組織(500 mg)[7],細胞(106~107),體液(羊水,腦脊液,尿液等),血清/血漿(200~300 μl),細胞器[8]。iTRAQ技術不僅可發(fā)現(xiàn)胞漿蛋白,還有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白,它可以檢測出低豐度蛋白、強堿性蛋白、<10 KD或>200 KD的蛋白;可以進行多個時間點蛋白質(zhì)組動態(tài)變化的監(jiān)測;可以分析詳細分期/型的臨床疾病樣本,并可設計樣本重復;甚至可以進行個體樣本的研究、細胞周期、細胞信號傳導整個過程的蛋白質(zhì)組動態(tài)蛋白質(zhì)組學的研究。在差異蛋白質(zhì)組學研究中,iTRAQ技術可用來尋找生物標志物,進行時間過程樣本分析,不同處理方法樣本差異以及信號通路的研究。

    2 MRM技術特點和應用領域

    2.1 MRM技術特點

    (1)靈敏度高:通過兩級離子選擇,排除大量干擾離子,使質(zhì)譜的化學背景降低,目標檢測物的信噪比顯著提高,從而實現(xiàn)檢測的高靈敏度。(2)重現(xiàn)性好:在MRM技術選擇性的質(zhì)譜信號采集中,避免了待測分子離子化、質(zhì)譜信號的抑制及源內(nèi)碰撞碎裂過程的影響,因此重現(xiàn)性也相應提高。(3)準確度高:利用MRM技術的特異性,進行連續(xù)增強的離子掃描分析,得到高分辨的串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)碎片數(shù)據(jù),與全掃描和中性丟失質(zhì)譜掃描模式相比降低了分析過程中定性結果的假陽性率,保證了分析的準確度。(4)通量高:使用目前最先進的質(zhì)譜系統(tǒng),MRM技術每個工作循環(huán)能處理多達300對母離子-子離子對,這種特點為研究多種蛋白質(zhì)的多種修飾和豐度變化提供了機會,更能滿足蛋白質(zhì)組學的研究需求。

    2.2 MRM的應用領域

    生物標志物的研究是醫(yī)學領域研究的熱點。目前,標志物發(fā)現(xiàn)-驗證-臨床確證的研究模式已經(jīng)得到廣泛的認可。即在發(fā)現(xiàn)階段從疾病組織中尋找與正常組織的差異蛋白質(zhì)到到驗證階段使用MRM技術進行臨床確證。MRM技術在驗證和確證階段都彌補了經(jīng)典免疫學原理利用抗體進行驗證確證的缺點,充分體現(xiàn)了該技術在生物標志物檢測領域中的價值。

    蛋白質(zhì)翻譯后修飾在許多生命活動的調(diào)節(jié)過程中起重要作用,例如,在蛋白質(zhì)磷酸化修飾中,MRM技術在翻譯后修飾的研究領域中顯示了獨特的特點和優(yōu)勢磷酸化蛋白質(zhì)被酶切后,磷酸化多肽的信號淹沒在大量非磷酸化多肽的信號中需要進行磷酸化富集來提高分析靈敏度,改善分析效果。MRM技術在定量蛋白質(zhì)組學應用上也展現(xiàn)了其方法的優(yōu)點。首先,在一定程度上提高了測定的動態(tài)范圍其原因一方面是因為對離子的選擇檢出,降低了復雜組分的背景信號,增加了一些低豐度蛋白質(zhì)的檢測靈敏度;另一方面通過對高豐度、低豐度蛋白質(zhì)MR離子對的選擇來均衡兩者的響應信號差異。例如,對高豐度蛋白質(zhì),選擇響應豐度較低的母離子-子離子對;對低豐度蛋白質(zhì),選擇響應程度較高的母離子-子離子對,從而均衡高、低豐度的信號差異。其次,減少了復雜組分流產(chǎn)物的干擾,增強了檢測的特異性。此外,MRM技術高通量的特點,也為多種蛋白質(zhì)的同時定量提供了條件[9]。

    3 蛋白質(zhì)組學在的納米銀材料中的研究進展

    徐麗明等[10]早在2011年就已經(jīng)進行了納米銀離子毒性評估的全基因組進行了研究,該結果表明,與納米銀接觸24 h的Hela細胞中上調(diào)的基因涉及各種初級代謝過程,細胞進程和應激反應,這些基因的上調(diào)可歸因于銀離子的釋放。而納米銀所致的基因下調(diào)也可歸因于銀離子的釋放,但基因下調(diào)中大多數(shù)功能的改變要歸結于納米銀本身。而接觸48 h后基因改變的數(shù)目大幅下降,提示毒性反應是順時的。然而,隨著人類基因組計劃的實施和推進,生命科學的研究已經(jīng)進入了后基因組時代,在這個時代,生命科學的主要研究對象是功能基因組學,包括結構基因組研究和蛋白質(zhì)組研究等。盡管現(xiàn)在已有多個物種的基因組被測序,但在這些基因組中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因組中所采用的策略,如基因芯片、基因表達序列分析(Serial analysis of gene expression,SAGE)等,都是從細胞中mRNA的角度來考慮的,其前提是細胞中mRNA的水平反映了蛋白質(zhì)表達的水平。但事實并不完全如此,從DNA mRNA蛋白質(zhì),存在三個層次的調(diào)控,即轉錄水平調(diào)控(Transcriptional control),翻譯水平調(diào)控(Translational control),翻譯后水平調(diào)控(Post-translational control)。從mRNA角度考慮,實際上僅包括了轉錄水平調(diào)控,并不能全面代表蛋白質(zhì)表達水平。蛋白質(zhì)組與基因組的有許多差別,它隨著組織、甚至環(huán)境狀態(tài)的不同而改變,在轉錄時,一個基因可以有多種mRNA形式剪接,并且,同一蛋白可能以許多形式進行翻譯后的修飾,故一個蛋白質(zhì)組不是一個基因組的直接產(chǎn)物,蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)的數(shù)目有時可以超過基因組的數(shù)目。

    目前,在納米銀材料的研究中,Verano-Braga T[11]等人使用定量蛋白質(zhì)組學方法研究納米銀離子引發(fā)的細胞內(nèi)反應,結果表明,一些獨特的細胞進程是由納米顆粒的粒徑大小決定的。如,100 nm粒徑的納米銀粒子是通serine/threonine protein kinase (PAK),mitogen-activated protein kinase(MAPK)和phosphatase 2A pathways信號轉到路徑引發(fā)的直接效應,而20 nm粒徑的納米銀粒子則直接誘導細胞應激反應,包括產(chǎn)生的活性氧和羰基化蛋白。此外,研究者還報道了有相關蛋白在給與20 nm粒徑的納米銀顆粒之后呈明顯上調(diào)并參與相撲化途徑 (SUMOylation pathway).Mirzajani F[12]等人利用蛋白質(zhì)組學方法研究了納米銀顆粒對水稻的毒性,研究表明,已鑒定出的蛋白參與氧化應激耐受、Ca2+信號轉導和轉錄調(diào)控、蛋白質(zhì)降解、細胞壁和DNA/RNA/蛋白質(zhì)的直接損傷,細胞凋亡和細胞分裂。Rainville LC[13]等利用蛋白質(zhì)組學方法對檸檬酸包被的納米銀離子的毒性進行了評估,其結果表明了兩種化合物之間的功能重疊,卵黃蛋白的一個最確定的特性是起應力傳感器的作用。此外,相對于卵黃蛋白而言,當AgNO3誘導14-3-3蛋白發(fā)生羥基化反應時,血紅蛋白水平由于AgNP的暴露升高。該研究證實了以前觀察到的納米銀粒子的急性毒性低,同時表明,銀的兩種形式的毒性隨不同生物的途徑,可能導致與水環(huán)境中的天然化合物或污染物的相互作用。

    4 結語

    目前,國內(nèi)外納米銀材料的生物學制品尚無完善的評估體系,如果能夠基于iTRAQ技術結合MRM技術發(fā)現(xiàn)并確證有效的納米銀材料對于人體毒性的生物標志物,將極大程度地推進納米銀醫(yī)用生物材料的評估體系建立。iTRAQ技術可對2~8個不同的樣本同時分析,相比較于目前蛋白質(zhì)組學的其他方法有著不可比擬的優(yōu)勢,通過iTRAQ技術對納米銀材料進行的全面的蛋白質(zhì)組學研究,良好的重復性、可信性以及敏感性,其結合MRM技術進行大規(guī)模的生物標志物的驗證和臨床確證都證明了該兩項技術的結合將會在納米銀生物醫(yī)學材料毒性的評估方面有所作為。當然,iTRAQ技術并非完美,因為,在同位素進行標記的同時就已經(jīng)改變了檢測物質(zhì)的結構,這或多或少的會造成樣本的誤差。但是,我們有理由相信,隨著iTRAQ技術的不斷完善與發(fā)展,它不僅僅只限于在基礎研究中發(fā)揮作用,其與MRM的結合在納米銀生物醫(yī)學材料的毒性評估中極有可能發(fā)揮重要作用,從而實現(xiàn)納米銀材料評估歷史上零的突破及質(zhì)的飛越。

    [1]Zhang XP,Yin XF,Yu HH,et al.Quantitative proteomic analysis of serum proteins in patients with parkinson's disease using an isobaric tag for relative and absolute quantification labeling,two-dimensional liquid chromatography,and tandem mass spectrometry[J].ANALYST,2012,137(2):490-495.

    [2]Lu Q,Bai J,Zhang L,et al.Two-dimensional liquid chromatographytandem mass spectrometry coupled with isobaric tags for relative and absolute quantification (itraq)labeling approach revealed first proteome profiles of pul monary alveolar macrophages infected with porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].J Proteome Res,2012,11 (5):2890-2903.

    [3]胡承恩,黃廠建,張延嶺.納米技術在腫瘤治療中的應用[J].國際外科學雜志,2007,34(4):235-238.

    [4]孫曉靜,劉彬彬.納米銀在癌癥診療中的應用[J].醫(yī)學綜述,2012,18 (7):1017-1019.

    [5]徐麗明,陳亮,董喆,等.納米銀凝膠在家兔體內(nèi)的生殖器官毒性及體外細胞毒性研究[J].藥物分析雜志,2012,32(2):194-201.

    [6]Xiaoli Chen,Huabin Zhu.Identi cation of differentially expressed pro teins in fresh and frozen-thawed boar spermatozoa by iTRAQ-coupled 2D LC-MS/MS[J].Reproduction,2014,147:321-330.

    [7]Jin Zi,Jiyuan Zhang,Quanhai Wang,et al.Stress Responsive Proteins Are Actively Regulated during Rice (Oryza sativa)Embryogenesis as Indicated by Quantitative Proteomics Analysis[J].PLoS ONE,2013,8 (9):e74229.doi:10.1371/journal.pone.0074229.

    [8]Songyue Yin,Jin Xue,Haidan Sun,et al.Quantitative Evaluation of the Mitochondrial Proteomes of Drosophila melanogaster Adapted to Extreme Oxygen Conditions[J].PLoS ONE,2013,8(9):e74011.doi:10.1371/journal. pone.0074011.

    [9]趙焱,應萬濤,錢小紅.質(zhì)譜MRM技術在蛋白質(zhì)組學研究中的應用[J]. CHEMISTR Y OF LIFE,2008,28(4):210-213.

    [10]Xu,Liming,Takemura,Taro,et al.Toxicity of Silver Nanoparticles as Assessed by Global Gene Expression Analysis[J].Materials Express,2011:74-79(6).

    [11]Verano-Braga T,Miethling-Graff R,Wojdyla K,et al.Insights into the cellular response triggered by silver nanoparticles using quantitative proteomics[J].Acs Nano,2014,25,8(3):2161-75.

    [12]Mirzajani F,Askari H,Hamzelou S,et al.Proteomics study of nanoparticles toxicity on Oryza sativa L[J].Ecotoxicol Environ Saf,2014,108:335-9.

    [13]Rainville LC,Carolan D,Varela AC,et al.Proteomic evaluation of citrate-coated silver nanoparticles toxicity in Daphnia magna[J]. Analyst,2014,139(7):1678-86.

    正文主體部分之“討論”

    1.著重討論研究結果的創(chuàng)新之處及從中導出的結論,包括理論意義、實際應用價值、局限性,及其對進一步研究的啟示等。如果不能導出結論,也可通過討論,提出建議、設想、改進意見或待解決的問題等。

    2.應將本研究結果與其他有關的研究相比較,并將本研究結論與目的聯(lián)系起來討論。

    3.不必重述已在前言部分介紹過的背景和在結果部分詳述過的數(shù)據(jù)或資料。不應列入圖或表。

    Advances of Quantitative Proteomics in Nano-silver Material

    LIU Zan1YU Ying1SUN Mingbo1CHEN Wenbo1DAI Zhengning2ZHONG Fei2YU Yang1
    1.Liaoning Medical Device Test Institute,Shenyang,Liaoning Province,110179,China;2.Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang,Liaoning Province,110016,China

    Isobaric tags for relative and absolute quantitation(iTRAQ)is a new isotope labeling reagent developed in 2004,which combined with multiple reactions monitoring (MRM),has been applied to the identification and quantification and verification of the target proteins in a wild range of biological samples,including bacterial,yeasts,body fluid,microorganism,human tissues,and cell.As a new method of quantitative proteomics so far,the technique of iTRAQ allows for the quantitative analysis of 2-8 samples simultaneously and displays its advantages of high throughput,repeatability and high sensitivity.It also provides a potential technology platform for evaluation the toxicity of nano-sliver biomedical materials.

    iTRAQ;MRM;Nano-silver;Protein

    R341

    A

    1674-0742(2014)12(b)-0196-03

    2014-09-01)

    課題名稱:新型及高風險醫(yī)療器械檢測與安全價技術評價(2012BAI22B01)。

    劉贊(1976-),女,遼寧沈陽人,博士,助理工程師,主要從事肺腺癌的發(fā)病機制研究及早期血清標志物探測.

    余洋,(1976-),女,遼寧沈陽人,碩士,副主任藥師,主要從事醫(yī)療器械的生物學檢測工作。

    猜你喜歡
    納米銀組學質(zhì)譜
    納米銀和1-MCP處理對月季切花的保鮮作用
    氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀在農(nóng)殘檢測中的應用及維護
    口腔代謝組學研究
    基于UHPLC-Q-TOF/MS的歸身和歸尾補血機制的代謝組學初步研究
    納米銀改性正畸粘接劑的研究
    rhGM-CSF與納米銀對深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合影響的對比研究
    吹掃捕集-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測定水中18種揮發(fā)性有機物
    代謝組學在多囊卵巢綜合征中的應用
    棗霜化學成分的色譜質(zhì)譜分析
    Modeled response of talik development under thermokarst lakes to permafrost thickness on the Qinghai-Tibet Plateau
    久久久久久久久免费视频了| 国产精品一区二区免费欧美| 国产精品久久电影中文字幕| e午夜精品久久久久久久| 久久久久久久精品吃奶| 午夜福利在线观看吧| 女警被强在线播放| 1024手机看黄色片| 成人无遮挡网站| 欧美日韩乱码在线| 久久久久久久久久黄片| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲专区国产一区二区| 天天一区二区日本电影三级| 看免费av毛片| 国产久久久一区二区三区| av片东京热男人的天堂| 两性夫妻黄色片| 久久亚洲真实| 国产黄色小视频在线观看| 国产成人影院久久av| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲欧美日韩东京热| 久久久久亚洲av毛片大全| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲精品久久国产高清桃花| svipshipincom国产片| 国产免费男女视频| 91av网一区二区| 亚洲中文av在线| 男人的好看免费观看在线视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 欧美不卡视频在线免费观看| 日韩欧美精品v在线| 视频区欧美日本亚洲| 国产亚洲精品久久久com| 国产激情久久老熟女| 亚洲av成人一区二区三| 日本免费一区二区三区高清不卡| 欧美最黄视频在线播放免费| 日韩精品中文字幕看吧| 一区福利在线观看| 嫩草影院入口| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 国产亚洲欧美98| 丁香六月欧美| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产私拍福利视频在线观看| a级毛片在线看网站| 欧美一级毛片孕妇| 激情在线观看视频在线高清| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 欧美日韩乱码在线| 亚洲一区高清亚洲精品| 日本熟妇午夜| 男人舔女人下体高潮全视频| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 99久久综合精品五月天人人| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲激情在线av| 色播亚洲综合网| 精品久久蜜臀av无| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产精品av视频在线免费观看| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲人成伊人成综合网2020| 色综合婷婷激情| www.自偷自拍.com| 观看美女的网站| 免费在线观看亚洲国产| 国产午夜精品论理片| 久久欧美精品欧美久久欧美| 偷拍熟女少妇极品色| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 国产极品精品免费视频能看的| 免费av毛片视频| 中亚洲国语对白在线视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品不卡国产一区二区三区| 在线永久观看黄色视频| 精品欧美国产一区二区三| 精品久久久久久久久久免费视频| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产成人福利小说| aaaaa片日本免费| 午夜日韩欧美国产| 亚洲国产精品sss在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 在线看三级毛片| 9191精品国产免费久久| 日本与韩国留学比较| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲一区高清亚洲精品| www日本在线高清视频| 无遮挡黄片免费观看| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 在线免费观看不下载黄p国产 | 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产亚洲欧美98| 欧美乱色亚洲激情| 日本 av在线| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产精品亚洲av一区麻豆| 一本综合久久免费| 国产主播在线观看一区二区| 国产精华一区二区三区| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 精品久久久久久,| 国产伦人伦偷精品视频| www.精华液| 婷婷精品国产亚洲av| 婷婷六月久久综合丁香| 毛片女人毛片| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 久久这里只有精品19| 国产av麻豆久久久久久久| 老汉色∧v一级毛片| 日本精品一区二区三区蜜桃| 1024手机看黄色片| 国产亚洲精品一区二区www| 亚洲成人精品中文字幕电影| 观看美女的网站| 欧美极品一区二区三区四区| 女同久久另类99精品国产91| 欧美一区二区国产精品久久精品| 婷婷丁香在线五月| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 最近最新免费中文字幕在线| 精品久久久久久久久久免费视频| 午夜福利18| 51午夜福利影视在线观看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 99精品在免费线老司机午夜| 亚洲色图av天堂| 老司机在亚洲福利影院| 黄色 视频免费看| 久久人人精品亚洲av| 午夜福利欧美成人| 美女午夜性视频免费| 国产欧美日韩精品亚洲av| 神马国产精品三级电影在线观看| 久久久成人免费电影| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 99久久精品热视频| 一级a爱片免费观看的视频| 99热只有精品国产| 国产精品一区二区三区四区久久| 90打野战视频偷拍视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 日本一二三区视频观看| 天堂影院成人在线观看| 两个人的视频大全免费| a级毛片a级免费在线| 成年免费大片在线观看| 精品福利观看| 亚洲国产欧美人成| 色综合欧美亚洲国产小说| 网址你懂的国产日韩在线| www.自偷自拍.com| 国模一区二区三区四区视频 | 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲人与动物交配视频| 成人永久免费在线观看视频| 黄色女人牲交| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产伦在线观看视频一区| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲精品色激情综合| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 成在线人永久免费视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 黄色 视频免费看| 我要搜黄色片| 久久人妻av系列| 999久久久国产精品视频| 国产精品精品国产色婷婷| 国产成人欧美在线观看| 欧美日韩黄片免| 久久久久久久午夜电影| 色尼玛亚洲综合影院| 三级国产精品欧美在线观看 | 精品福利观看| 欧美性猛交黑人性爽| 国产成人欧美在线观看| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美激情久久久久久爽电影| 欧美午夜高清在线| 国产亚洲欧美98| 麻豆成人av在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 麻豆成人av在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 97碰自拍视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 成人欧美大片| 国产不卡一卡二| 亚洲成av人片免费观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 九九久久精品国产亚洲av麻豆 | 色老头精品视频在线观看| 久久久成人免费电影| 国产美女午夜福利| 小说图片视频综合网站| 一夜夜www| 国产人伦9x9x在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 成人无遮挡网站| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 免费av毛片视频| 99热6这里只有精品| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 国产成年人精品一区二区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| www.999成人在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 黄色日韩在线| 久久中文字幕一级| 亚洲在线自拍视频| 亚洲片人在线观看| 三级毛片av免费| 亚洲av五月六月丁香网| 天天添夜夜摸| 高潮久久久久久久久久久不卡| 日本五十路高清| 国产精品 国内视频| 真人做人爱边吃奶动态| 国产私拍福利视频在线观看| 色综合欧美亚洲国产小说| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 极品教师在线免费播放| 窝窝影院91人妻| 亚洲国产看品久久| 国产97色在线日韩免费| 色哟哟哟哟哟哟| 国产黄色小视频在线观看| 日本一本二区三区精品| 国产主播在线观看一区二区| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲中文av在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 噜噜噜噜噜久久久久久91| www.熟女人妻精品国产| 国产三级在线视频| 黄片大片在线免费观看| 成人国产综合亚洲| 久久久水蜜桃国产精品网| 欧美极品一区二区三区四区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 亚洲成人久久爱视频| 又黄又爽又免费观看的视频| 香蕉丝袜av| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 成人国产一区最新在线观看| 国产精品久久视频播放| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 黄色丝袜av网址大全| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产精品 国内视频| 人人妻人人看人人澡| 宅男免费午夜| 老司机午夜十八禁免费视频| av福利片在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 级片在线观看| 久久亚洲精品不卡| 在线免费观看不下载黄p国产 | 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产伦一二天堂av在线观看| 久久精品影院6| 91麻豆av在线| 此物有八面人人有两片| 亚洲成av人片免费观看| 午夜两性在线视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 久久久精品大字幕| 午夜免费观看网址| 欧美一级毛片孕妇| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 深夜精品福利| 欧美色视频一区免费| 麻豆一二三区av精品| 日韩免费av在线播放| 免费高清视频大片| 性欧美人与动物交配| 日本熟妇午夜| 欧美在线黄色| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| xxxwww97欧美| 国产伦一二天堂av在线观看| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产私拍福利视频在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲国产欧美网| 色在线成人网| 亚洲片人在线观看| 国产高清视频在线播放一区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 精品日产1卡2卡| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产精华一区二区三区| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产精品98久久久久久宅男小说| 人人妻人人看人人澡| 国产精品乱码一区二三区的特点| 欧美在线黄色| 亚洲五月天丁香| 精品国内亚洲2022精品成人| 色在线成人网| 中亚洲国语对白在线视频| 国产精品永久免费网站| 动漫黄色视频在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| a级毛片在线看网站| 精品久久蜜臀av无| 在线观看舔阴道视频| 动漫黄色视频在线观看| 国产一区二区在线av高清观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 免费看光身美女| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 午夜亚洲福利在线播放| 性欧美人与动物交配| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产一区二区在线观看日韩 | 中文字幕人妻丝袜一区二区| xxx96com| 色综合亚洲欧美另类图片| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 最好的美女福利视频网| 色视频www国产| 日韩人妻高清精品专区| 无人区码免费观看不卡| 两个人的视频大全免费| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 99riav亚洲国产免费| 又黄又爽又免费观看的视频| 亚洲黑人精品在线| 国产精品乱码一区二三区的特点| 岛国在线免费视频观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 岛国在线免费视频观看| 亚洲色图av天堂| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 成人永久免费在线观看视频| 日韩欧美免费精品| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产亚洲欧美在线一区二区| 人人妻人人看人人澡| 麻豆国产97在线/欧美| 精品国产乱子伦一区二区三区| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 精品久久久久久久久久久久久| 最新中文字幕久久久久 | 又粗又爽又猛毛片免费看| 99在线视频只有这里精品首页| 国产一级毛片七仙女欲春2| 久久精品91无色码中文字幕| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 免费看十八禁软件| 精品国产亚洲在线| 欧美乱妇无乱码| 亚洲精品在线美女| 欧美乱妇无乱码| 国产午夜福利久久久久久| 俺也久久电影网| 久久国产精品影院| 亚洲国产欧美一区二区综合| 一二三四在线观看免费中文在| 日韩av在线大香蕉| 激情在线观看视频在线高清| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产乱人伦免费视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲专区字幕在线| 51午夜福利影视在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 免费看美女性在线毛片视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 757午夜福利合集在线观看| 日韩欧美免费精品| 日韩精品中文字幕看吧| 天天躁日日操中文字幕| 国产精品亚洲一级av第二区| 1024手机看黄色片| 18禁观看日本| 美女高潮的动态| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久久国产成人精品二区| 村上凉子中文字幕在线| 成人鲁丝片一二三区免费| 丁香欧美五月| 国产精品久久电影中文字幕| 国产精品,欧美在线| 高清在线国产一区| 久久中文看片网| 日韩欧美国产在线观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 日韩欧美在线乱码| 亚洲国产欧美人成| 99热这里只有是精品50| 精品国产三级普通话版| 国内精品久久久久久久电影| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 日本 欧美在线| 亚洲无线观看免费| 长腿黑丝高跟| av黄色大香蕉| avwww免费| 国内精品久久久久久久电影| 悠悠久久av| 亚洲国产欧美一区二区综合| 超碰成人久久| 色综合站精品国产| 精品国产乱子伦一区二区三区| av欧美777| 午夜激情欧美在线| 欧美一区二区精品小视频在线| 精品久久久久久久末码| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 90打野战视频偷拍视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 最新在线观看一区二区三区| 日韩欧美国产一区二区入口| 成人性生交大片免费视频hd| 成人特级黄色片久久久久久久| 最近最新中文字幕大全免费视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 成年女人永久免费观看视频| 国产精品电影一区二区三区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 757午夜福利合集在线观看| 久久久国产精品麻豆| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 99热这里只有精品一区 | 色噜噜av男人的天堂激情| 国产亚洲欧美98| 国产精品日韩av在线免费观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 人人妻人人看人人澡| 黄色女人牲交| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 午夜免费成人在线视频| 欧美色视频一区免费| 亚洲精品在线美女| 91久久精品国产一区二区成人 | 亚洲 欧美一区二区三区| 88av欧美| 精品久久久久久,| 老司机午夜十八禁免费视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 最近视频中文字幕2019在线8| 怎么达到女性高潮| 精品国产美女av久久久久小说| 亚洲精品456在线播放app | 精品国产超薄肉色丝袜足j| 成人无遮挡网站| 国产精品亚洲一级av第二区| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 免费大片18禁| 啦啦啦韩国在线观看视频| 十八禁网站免费在线| 国产激情久久老熟女| 国产男靠女视频免费网站| 日韩有码中文字幕| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲精品久久国产高清桃花| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲黑人精品在线| 婷婷亚洲欧美| 亚洲av电影在线进入| 免费在线观看日本一区| 久久精品国产清高在天天线| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 国产精品一及| 国产美女午夜福利| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久性视频一级片| 国产亚洲av高清不卡| 国产精品 国内视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 欧美乱色亚洲激情| 黄色视频,在线免费观看| 在线观看舔阴道视频| 色综合站精品国产| 国产成人精品久久二区二区免费| 床上黄色一级片| 国产欧美日韩精品一区二区| 免费高清视频大片| 日日夜夜操网爽| 老汉色av国产亚洲站长工具| 中文资源天堂在线| 久久久久国内视频| 国产av在哪里看| 午夜成年电影在线免费观看| 色综合站精品国产| 亚洲色图av天堂| 在线观看免费午夜福利视频| av欧美777| 日本一本二区三区精品| 91av网站免费观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产日本99.免费观看| 亚洲美女视频黄频| 国产精品野战在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 天天一区二区日本电影三级| 午夜福利在线观看吧| 午夜两性在线视频| 日本一二三区视频观看| 成年女人看的毛片在线观看| 国产私拍福利视频在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 国产视频一区二区在线看| 久久中文字幕一级| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 欧美乱码精品一区二区三区| 舔av片在线| 无限看片的www在线观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 日韩精品中文字幕看吧| 免费看十八禁软件| 免费av不卡在线播放| 一边摸一边抽搐一进一小说| 黄色成人免费大全| 久久久色成人| 午夜视频精品福利| 99精品久久久久人妻精品| 亚洲色图av天堂| a在线观看视频网站| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲国产色片| 精品电影一区二区在线| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 色视频www国产| 一区福利在线观看| 国产高清videossex| 男女床上黄色一级片免费看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产精品九九99| 真人做人爱边吃奶动态| 精品国产乱码久久久久久男人| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲国产欧美一区二区综合| 一区二区三区激情视频| 男插女下体视频免费在线播放| 动漫黄色视频在线观看| 成人性生交大片免费视频hd| av天堂在线播放| 午夜久久久久精精品| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产精品亚洲一级av第二区| 色视频www国产| 一二三四社区在线视频社区8| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 日韩有码中文字幕| 久久天堂一区二区三区四区| 国产熟女xx| 中国美女看黄片| 国产三级在线视频| 国产成人av激情在线播放| 国产高清有码在线观看视频| 大型黄色视频在线免费观看| 国产成人啪精品午夜网站| 成在线人永久免费视频| 亚洲电影在线观看av| 成人三级做爰电影| or卡值多少钱| 久久精品91蜜桃| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 在线观看免费视频日本深夜| 国产日本99.免费观看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产精品国产高清国产av| 99久久国产精品久久久| 亚洲,欧美精品.| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 午夜激情欧美在线| 国产91精品成人一区二区三区| 天天一区二区日本电影三级| 日韩有码中文字幕| 黄片小视频在线播放| 国产精品国产高清国产av| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 色吧在线观看| 在线十欧美十亚洲十日本专区|