劉 贊 于 瀅 孫明波 陳文博 戴政寧 鐘 飛 余 洋
1.遼寧省醫(yī)療器械檢驗檢測院,遼寧沈陽 110179;2.沈陽藥科大學,遼寧沈陽 110016
定量蛋白質(zhì)組學在納米銀材料中的研究進展
劉 贊1于 瀅1孫明波1陳文博1戴政寧2鐘 飛2余 洋1
1.遼寧省醫(yī)療器械檢驗檢測院,遼寧沈陽 110179;2.沈陽藥科大學,遼寧沈陽 110016
iTRAQ是2004年開發(fā)的一種新的同位素標記試劑,結合MRM技術已經(jīng)被廣泛的應用于細菌、酵母、體液、微生物、人體組織和細胞等多種樣本的蛋白質(zhì)鑒定、定量以及對目的蛋白的驗證中。目前,由于iTRAQ能同時對2-8組樣品進行標記分析并具有高通量、重復性、敏感性高等特點使其為進行納米銀生物醫(yī)學材料毒性評估提供了有力的技術平臺。
同位素相對與絕對定量技術;多反應監(jiān)測;納米銀;蛋白質(zhì)
近年來研究蛋白質(zhì)相對和絕對定量的常用質(zhì)譜分析技術是同位素標記,如2004年開發(fā)的較新的技術iTRAQ等。采用i-TRAQ進行蛋白質(zhì)的相對和絕對定量,其結果可以得到500~600種蛋白。通過大規(guī)模數(shù)據(jù)分析,采用質(zhì)譜多反應監(jiān)測(MRM)對篩選出來的蛋白進行確證。MRM技術是一種基于已知信息或假定信息有針對性地獲取數(shù)據(jù),進行質(zhì)譜信號采集的技術。目前,它已經(jīng)成為生物標志物大規(guī)模臨床確診的主要手段。未來,iTRAQ結合MRM在探求未知復雜疾病領域中將成為一種有效性和可靠性較高的技術[2]。
納米技術是在0.1~100 nm空間尺度內(nèi)操縱原子和分子,研究物質(zhì)的特性和相互作用,并利用這些特性的多學科交叉的一門綜合性科學技術[3-4]。然而,如何評價納米材料的毒性和安全性還沒有統(tǒng)一的標準。我國食品藥品監(jiān)督管理局報道,到目前為止我國已有188件國產(chǎn)納米醫(yī)療器械和6件進口納米醫(yī)療器械通過了國家局或省級藥監(jiān)局的審批進行臨床應用[5]。迄今,有關納米銀對人體的負效應,尤其是長期頻繁或大量使用時的慢性毒性尚不清楚。因此,建立完善的既符合我國特點又與國際接軌的技術標準體系,保證其安全使用是至關重要的。
綜上,該文就iTRAQ結合MRM技術及其在納米生物醫(yī)學材料毒性評估中的現(xiàn)狀及進展進行綜述。
1.1 iTRAQ技術特點
在一次實驗中可同時標記2~8個樣品,一次實驗實現(xiàn)多達8個樣品的蛋白質(zhì)鑒定和定量,定性與定量同時進行;適用范圍較廣;所需樣品較少,可處理微量樣品;13C,15N,18O在 scx或RP預分離時,不會影響肽段的行為,任意肽段理論上都可能被標記,擁有極高的標記效率;每個蛋白都有多個肽段被標記,提高了鑒定和定量可靠性;平衡集團在質(zhì)譜碎裂時會中性丟失,不爭奪電荷,鑒定時,來源于不同樣品的報告集團會分離得很清楚(113-121Da,skip120),而來源于不同樣品的相同肽段在質(zhì)譜上表現(xiàn)為一同個峰,強度疊加可有效改善圖譜鑒定,有利于鑒定。
1.2 iTRAQ的應用領域
iTRAQ試劑可用于標記不同性質(zhì)的樣品,如微生物(500 mg),動物組織(500 mg)[6],植物組織(500 mg)[7],細胞(106~107),體液(羊水,腦脊液,尿液等),血清/血漿(200~300 μl),細胞器[8]。iTRAQ技術不僅可發(fā)現(xiàn)胞漿蛋白,還有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白,它可以檢測出低豐度蛋白、強堿性蛋白、<10 KD或>200 KD的蛋白;可以進行多個時間點蛋白質(zhì)組動態(tài)變化的監(jiān)測;可以分析詳細分期/型的臨床疾病樣本,并可設計樣本重復;甚至可以進行個體樣本的研究、細胞周期、細胞信號傳導整個過程的蛋白質(zhì)組動態(tài)蛋白質(zhì)組學的研究。在差異蛋白質(zhì)組學研究中,iTRAQ技術可用來尋找生物標志物,進行時間過程樣本分析,不同處理方法樣本差異以及信號通路的研究。
2.1 MRM技術特點
(1)靈敏度高:通過兩級離子選擇,排除大量干擾離子,使質(zhì)譜的化學背景降低,目標檢測物的信噪比顯著提高,從而實現(xiàn)檢測的高靈敏度。(2)重現(xiàn)性好:在MRM技術選擇性的質(zhì)譜信號采集中,避免了待測分子離子化、質(zhì)譜信號的抑制及源內(nèi)碰撞碎裂過程的影響,因此重現(xiàn)性也相應提高。(3)準確度高:利用MRM技術的特異性,進行連續(xù)增強的離子掃描分析,得到高分辨的串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)碎片數(shù)據(jù),與全掃描和中性丟失質(zhì)譜掃描模式相比降低了分析過程中定性結果的假陽性率,保證了分析的準確度。(4)通量高:使用目前最先進的質(zhì)譜系統(tǒng),MRM技術每個工作循環(huán)能處理多達300對母離子-子離子對,這種特點為研究多種蛋白質(zhì)的多種修飾和豐度變化提供了機會,更能滿足蛋白質(zhì)組學的研究需求。
2.2 MRM的應用領域
生物標志物的研究是醫(yī)學領域研究的熱點。目前,標志物發(fā)現(xiàn)-驗證-臨床確證的研究模式已經(jīng)得到廣泛的認可。即在發(fā)現(xiàn)階段從疾病組織中尋找與正常組織的差異蛋白質(zhì)到到驗證階段使用MRM技術進行臨床確證。MRM技術在驗證和確證階段都彌補了經(jīng)典免疫學原理利用抗體進行驗證確證的缺點,充分體現(xiàn)了該技術在生物標志物檢測領域中的價值。
蛋白質(zhì)翻譯后修飾在許多生命活動的調(diào)節(jié)過程中起重要作用,例如,在蛋白質(zhì)磷酸化修飾中,MRM技術在翻譯后修飾的研究領域中顯示了獨特的特點和優(yōu)勢磷酸化蛋白質(zhì)被酶切后,磷酸化多肽的信號淹沒在大量非磷酸化多肽的信號中需要進行磷酸化富集來提高分析靈敏度,改善分析效果。MRM技術在定量蛋白質(zhì)組學應用上也展現(xiàn)了其方法的優(yōu)點。首先,在一定程度上提高了測定的動態(tài)范圍其原因一方面是因為對離子的選擇檢出,降低了復雜組分的背景信號,增加了一些低豐度蛋白質(zhì)的檢測靈敏度;另一方面通過對高豐度、低豐度蛋白質(zhì)MR離子對的選擇來均衡兩者的響應信號差異。例如,對高豐度蛋白質(zhì),選擇響應豐度較低的母離子-子離子對;對低豐度蛋白質(zhì),選擇響應程度較高的母離子-子離子對,從而均衡高、低豐度的信號差異。其次,減少了復雜組分流產(chǎn)物的干擾,增強了檢測的特異性。此外,MRM技術高通量的特點,也為多種蛋白質(zhì)的同時定量提供了條件[9]。
徐麗明等[10]早在2011年就已經(jīng)進行了納米銀離子毒性評估的全基因組進行了研究,該結果表明,與納米銀接觸24 h的Hela細胞中上調(diào)的基因涉及各種初級代謝過程,細胞進程和應激反應,這些基因的上調(diào)可歸因于銀離子的釋放。而納米銀所致的基因下調(diào)也可歸因于銀離子的釋放,但基因下調(diào)中大多數(shù)功能的改變要歸結于納米銀本身。而接觸48 h后基因改變的數(shù)目大幅下降,提示毒性反應是順時的。然而,隨著人類基因組計劃的實施和推進,生命科學的研究已經(jīng)進入了后基因組時代,在這個時代,生命科學的主要研究對象是功能基因組學,包括結構基因組研究和蛋白質(zhì)組研究等。盡管現(xiàn)在已有多個物種的基因組被測序,但在這些基因組中通常有一半以上基因的功能是未知的。目前功能基因組中所采用的策略,如基因芯片、基因表達序列分析(Serial analysis of gene expression,SAGE)等,都是從細胞中mRNA的角度來考慮的,其前提是細胞中mRNA的水平反映了蛋白質(zhì)表達的水平。但事實并不完全如此,從DNA mRNA蛋白質(zhì),存在三個層次的調(diào)控,即轉錄水平調(diào)控(Transcriptional control),翻譯水平調(diào)控(Translational control),翻譯后水平調(diào)控(Post-translational control)。從mRNA角度考慮,實際上僅包括了轉錄水平調(diào)控,并不能全面代表蛋白質(zhì)表達水平。蛋白質(zhì)組與基因組的有許多差別,它隨著組織、甚至環(huán)境狀態(tài)的不同而改變,在轉錄時,一個基因可以有多種mRNA形式剪接,并且,同一蛋白可能以許多形式進行翻譯后的修飾,故一個蛋白質(zhì)組不是一個基因組的直接產(chǎn)物,蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)的數(shù)目有時可以超過基因組的數(shù)目。
目前,在納米銀材料的研究中,Verano-Braga T[11]等人使用定量蛋白質(zhì)組學方法研究納米銀離子引發(fā)的細胞內(nèi)反應,結果表明,一些獨特的細胞進程是由納米顆粒的粒徑大小決定的。如,100 nm粒徑的納米銀粒子是通serine/threonine protein kinase (PAK),mitogen-activated protein kinase(MAPK)和phosphatase 2A pathways信號轉到路徑引發(fā)的直接效應,而20 nm粒徑的納米銀粒子則直接誘導細胞應激反應,包括產(chǎn)生的活性氧和羰基化蛋白。此外,研究者還報道了有相關蛋白在給與20 nm粒徑的納米銀顆粒之后呈明顯上調(diào)并參與相撲化途徑 (SUMOylation pathway).Mirzajani F[12]等人利用蛋白質(zhì)組學方法研究了納米銀顆粒對水稻的毒性,研究表明,已鑒定出的蛋白參與氧化應激耐受、Ca2+信號轉導和轉錄調(diào)控、蛋白質(zhì)降解、細胞壁和DNA/RNA/蛋白質(zhì)的直接損傷,細胞凋亡和細胞分裂。Rainville LC[13]等利用蛋白質(zhì)組學方法對檸檬酸包被的納米銀離子的毒性進行了評估,其結果表明了兩種化合物之間的功能重疊,卵黃蛋白的一個最確定的特性是起應力傳感器的作用。此外,相對于卵黃蛋白而言,當AgNO3誘導14-3-3蛋白發(fā)生羥基化反應時,血紅蛋白水平由于AgNP的暴露升高。該研究證實了以前觀察到的納米銀粒子的急性毒性低,同時表明,銀的兩種形式的毒性隨不同生物的途徑,可能導致與水環(huán)境中的天然化合物或污染物的相互作用。
目前,國內(nèi)外納米銀材料的生物學制品尚無完善的評估體系,如果能夠基于iTRAQ技術結合MRM技術發(fā)現(xiàn)并確證有效的納米銀材料對于人體毒性的生物標志物,將極大程度地推進納米銀醫(yī)用生物材料的評估體系建立。iTRAQ技術可對2~8個不同的樣本同時分析,相比較于目前蛋白質(zhì)組學的其他方法有著不可比擬的優(yōu)勢,通過iTRAQ技術對納米銀材料進行的全面的蛋白質(zhì)組學研究,良好的重復性、可信性以及敏感性,其結合MRM技術進行大規(guī)模的生物標志物的驗證和臨床確證都證明了該兩項技術的結合將會在納米銀生物醫(yī)學材料毒性的評估方面有所作為。當然,iTRAQ技術并非完美,因為,在同位素進行標記的同時就已經(jīng)改變了檢測物質(zhì)的結構,這或多或少的會造成樣本的誤差。但是,我們有理由相信,隨著iTRAQ技術的不斷完善與發(fā)展,它不僅僅只限于在基礎研究中發(fā)揮作用,其與MRM的結合在納米銀生物醫(yī)學材料的毒性評估中極有可能發(fā)揮重要作用,從而實現(xiàn)納米銀材料評估歷史上零的突破及質(zhì)的飛越。
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正文主體部分之“討論”
1.著重討論研究結果的創(chuàng)新之處及從中導出的結論,包括理論意義、實際應用價值、局限性,及其對進一步研究的啟示等。如果不能導出結論,也可通過討論,提出建議、設想、改進意見或待解決的問題等。
2.應將本研究結果與其他有關的研究相比較,并將本研究結論與目的聯(lián)系起來討論。
3.不必重述已在前言部分介紹過的背景和在結果部分詳述過的數(shù)據(jù)或資料。不應列入圖或表。
Advances of Quantitative Proteomics in Nano-silver Material
LIU Zan1YU Ying1SUN Mingbo1CHEN Wenbo1DAI Zhengning2ZHONG Fei2YU Yang1
1.Liaoning Medical Device Test Institute,Shenyang,Liaoning Province,110179,China;2.Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang,Liaoning Province,110016,China
Isobaric tags for relative and absolute quantitation(iTRAQ)is a new isotope labeling reagent developed in 2004,which combined with multiple reactions monitoring (MRM),has been applied to the identification and quantification and verification of the target proteins in a wild range of biological samples,including bacterial,yeasts,body fluid,microorganism,human tissues,and cell.As a new method of quantitative proteomics so far,the technique of iTRAQ allows for the quantitative analysis of 2-8 samples simultaneously and displays its advantages of high throughput,repeatability and high sensitivity.It also provides a potential technology platform for evaluation the toxicity of nano-sliver biomedical materials.
iTRAQ;MRM;Nano-silver;Protein
R341
A
1674-0742(2014)12(b)-0196-03
2014-09-01)
課題名稱:新型及高風險醫(yī)療器械檢測與安全價技術評價(2012BAI22B01)。
劉贊(1976-),女,遼寧沈陽人,博士,助理工程師,主要從事肺腺癌的發(fā)病機制研究及早期血清標志物探測.
余洋,(1976-),女,遼寧沈陽人,碩士,副主任藥師,主要從事醫(yī)療器械的生物學檢測工作。