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    PF127修飾的石墨烯復(fù)合材料的制備及其載藥系統(tǒng)研究

    2014-03-25 07:14:56張龍姣張陽德申玉璞申玉坤
    生物學(xué)雜志 2014年3期
    關(guān)鍵詞:阿霉素毒性石墨

    張龍姣, 張陽德, 申玉璞, 申玉坤, 2

    (1.中南大學(xué) 衛(wèi)生計(jì)生委肝膽腸外科研究中心, 長(zhǎng)沙 410008; 2.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院,山西 長(zhǎng)治 046000)

    石墨烯是一種集高光學(xué)吸收、高強(qiáng)度、極大比表面積、較低生產(chǎn)成本(相對(duì)于碳納米管)等多種優(yōu)異性質(zhì)于一體的新型二維碳納米材料,由sp2碳原子組成,是研究碳材料各種晶體理論計(jì)算和推導(dǎo)的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu),非常適合于開發(fā)高性能的復(fù)合材料[1];它憑借納米尺寸的結(jié)構(gòu)、優(yōu)異的生物相容性和長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間使其在納米藥物載體領(lǐng)域擁有極大的潛能;而氧化石墨烯還能穩(wěn)定地分散于水中,并且表面經(jīng)過良好修飾的氧化石墨烯能夠穩(wěn)定存在于高鹽溶液和生理?xiàng)l件下,這都?xì)w功于氧化石墨烯的表面擁有非常豐富的親水性官能團(tuán),這些特性為其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)[2]。普朗尼克PF127是一種兩親性高分子聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物,它能對(duì)氧化石墨烯上各種親水性官能團(tuán)進(jìn)行共價(jià)修飾,從而可獲得水溶性良好的功能化石墨烯基底材料;獨(dú)特的兩親性三嵌段微區(qū)結(jié)構(gòu),使其與石墨烯復(fù)合后,結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定[3]。

    目前,全球癌癥患者呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì),主要是缺少有效的治療手段,而化學(xué)治療是治療腫瘤的重要手段之一[4]。 化療藥物的細(xì)胞毒性缺乏選擇性,常引起嚴(yán)重不良反應(yīng),盡管目前的研究已經(jīng)取得重大進(jìn)步,但是化療的副作用還是很大,我們?nèi)匀恍枰獙?duì)傳統(tǒng)的化療藥物進(jìn)行改進(jìn)。于是增強(qiáng)藥物的靶向性運(yùn)輸、提高腫瘤選擇性毒性是提高化療效果并降低藥物的毒副反應(yīng)的有效方法,那么選擇一個(gè)高效的藥物運(yùn)輸載體是至關(guān)重要的[5]。由于氧化石墨烯具有單原子層結(jié)構(gòu),其比表面積很大,且兩個(gè)基面都可以吸附藥物,因此非常適合用作藥物載體[6, 7]。

    阿霉素是一種抗腫瘤抗生素,對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有殺滅作用,由于其本身存在強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性,使之無法在臨床醫(yī)學(xué)上得到廣泛應(yīng)用[8]。而如將阿霉素負(fù)載在膠質(zhì)載體上經(jīng)過合成后再進(jìn)行用藥,不僅可以降低其細(xì)胞毒性帶來的不良反應(yīng),還可有效提高藥物療效。

    目前,關(guān)于功能化石墨烯的研究還主要集中在物理學(xué)、化學(xué)等領(lǐng)域,而其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究還相對(duì)較少,如靶向藥物輸運(yùn)、生物檢測(cè)、腫瘤治療以及石墨烯生物安全性等的研究還處于剛剛起步的階段[9, 10]。本研究通過對(duì)負(fù)載阿霉素的PF127修飾的還原態(tài)石墨烯復(fù)合材料(PF127/GN/DOX)進(jìn)行藥物緩釋,細(xì)胞吞噬以及細(xì)胞毒性方面的研究,發(fā)現(xiàn)這種材料質(zhì)量可靠,性能良好,這為中國(guó)發(fā)展更為理想的新型智能型納米藥物載體提供了一個(gè)新的思路和方法。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 試劑與儀器

    天然鱗片石墨粉(粒徑為40~50 μm),純度 > 99.9%,青島歐爾石墨有限公司產(chǎn)品;鹽酸阿霉素,上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司,使用前用三乙醇胺脫鹽酸鹽;三嵌段共聚物普朗尼克 PF127(WPMF542B),上海BASF公司產(chǎn)品;透析袋,寬度 34 mm,容量3.4 mL/cm,截留分子量8000~14000,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;氧化石墨烯通過 Hummers 自制;水合肼(88%),濃硫酸(95%),雙氧水(30%),氨水,高錳酸鉀等常規(guī)試劑均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品,使用前未經(jīng)進(jìn)一步純化處理。實(shí)驗(yàn)中所有用水均為二次蒸餾水。

    水平搖床(北京六一儀器有限公司);SIGMA超速冷凍離心機(jī)(德國(guó)SIGMA公司);85-2A 控溫恒速攪拌器(上海德洋意邦儀器有限公司);JY98-III 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);81-2 型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器廠); PS-100A 超聲波清洗器(昆山超聲波清洗器有限公司);拉曼光譜儀(英國(guó)雷尼紹公司);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);Multimode V 型原子力顯微鏡(美國(guó)Veeco精密儀器有限公司) TCSSP5 激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica儀器公司); NanoDrop ND-2000C 紫外-可見分光光度儀(美國(guó)Thermo公司)。

    1.2 氧化石墨烯(GO)的制備

    采用Hummer法制備氧化石墨:移取 200 mL 的濃硫酸,在冰浴條件下放置一段時(shí)間使?jié)饬蛩岬臏囟冉咏囟?,在不斷攪拌的情況下慢慢將 5 g 石墨粉加入濃硫酸當(dāng)中,然后再稱取 18 g的高錳酸鉀也逐漸加入到濃硫酸中,保持冰浴條件下持續(xù)攪拌 3 h 使之混勻。之后,從冰浴中取出在室溫條件下繼續(xù)攪拌反應(yīng) 5 d,回到冰浴條件下,再次加入 18 g高錳酸鉀,持續(xù)攪拌 3 h,重復(fù)上述步驟1次。量筒量取 46 mL 的水,逐滴緩慢滴加,保持混合物溫度不要過高,之后將其放在 90~100℃ 的水浴中,繼續(xù)攪拌反應(yīng) 30 min ,從熱水浴中取出之后再加入 140 mL 水和 10 mL 30wt% 的雙氧水變成亮黃色,混勻之后離心分離,配制質(zhì)量分?jǐn)?shù) 5% 的鹽酸溶液和無水乙醇分別對(duì)分離出的產(chǎn)物進(jìn)行離心清洗至中性,恒溫干燥箱 50°C 下烘干即得氧化石墨烯。

    1.3 氧化石墨烯的剝離及純化

    取適量干燥后的氧化石墨烯,加入 50 mL 蒸餾水,在冰浴條件下,使用超聲粉碎機(jī)在 500 W 的功率下對(duì)混合物進(jìn)行超聲震蕩1 h ,氧化石墨片層剝落,獲得棕黃色的分散液,將分散液在 12000 r/min下離心15 min,收集棕黃色上清,將沉淀再次加入蒸餾水,重復(fù)上述步驟,最終得到氧化石墨烯水溶液。

    將氧化石墨烯水溶液加入適量蒸餾水后以截留分子量為 8000~14000 的透析袋透析 2 d,獲得濾液即為純化后的氧化石墨烯分散液。此時(shí)的石墨烯尺寸較小且分散完全。

    1.4 PF127 修飾還原態(tài)石墨烯(PF127/GN)的制備

    取 500 mg PF127,加入到石墨烯分散液中,超聲使其分散均勻,磁力攪拌30 min,然后邊攪拌邊向混合物中加入500 μL的水合肼和2 μL的氨水溶液,保持溫度在90℃的條件下進(jìn)行回流反應(yīng)24 h,進(jìn)行透析操作48 h,然后,將透析液在12000 r/min下離心15 min,去除沉淀,該沉淀物一般為未被PF127修飾的還原態(tài)石墨烯,獲得黑色半透明的離心液,最后得到的黑色上清液即為石墨烯穩(wěn)定分散液,確定濃度后密封保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.5 阿霉素(DOX)對(duì)PF127修飾的石墨烯復(fù)合材料(PF127/GN)的負(fù)載

    阿霉素的負(fù)載是通過將阿霉素溶液和納米載體PF127/GN簡(jiǎn)單的混合實(shí)現(xiàn)。為了更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆治霭⒚顾卦赑F127/GN上的負(fù)載效果,我們采用不同濃度的阿霉素溶液對(duì)PF127/GN進(jìn)行混合。本實(shí)驗(yàn)將阿霉素溶液的濃度分別定量為:0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL和1.0 mg/mL 。具體操作步驟如下:首先,取不同濃度的阿霉素溶液緩慢滴入稱有石墨烯分散液(15 mL,0.05 mg/mL)的燒瓶中,均勻攪拌 24 h,攪拌過程中注意避免陽光直射。反應(yīng)完成后,將燒杯中的合成液在 12000 r/min條件下離心1 h ,將沉淀物去除,取得負(fù)載了阿霉素的石墨烯分散液,記為PF127/GN/DOX,利用紫外-可見分光光度計(jì)可計(jì)算出負(fù)載在合成液上的阿霉素量。計(jì)算公式如下:

    PF127/GN/DOX上的阿霉素量=初始加入的阿霉素含量-上層清液中阿霉素含量

    其中,上層清液中阿霉素的含量可通過使用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)量離心后上層清液在480 nm紫外吸收峰的吸光度,然后對(duì)照阿霉素標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線后計(jì)算獲得。

    1.6 不同pH值生理緩沖液條件下 PF127/GN/DOX 中阿霉素的藥物釋放實(shí)驗(yàn)

    將3種不同pH值的緩沖液放入燒杯中,取PF127/GN/DOX(2 mL,1 mg/mL) 作為樣品分別裝入3個(gè)透析袋中,然后分別放入3個(gè)燒杯中,將燒杯放在搖床中,在轉(zhuǎn)速為180 r/min,37℃的條件下恒溫震蕩進(jìn)行藥物的體外釋放考察。在此過程中,定時(shí)量取 5 mL 燒杯中的溶液測(cè)量藥物釋放量,注意每次取出溶液后應(yīng)在燒杯中相應(yīng)補(bǔ)充 5 mL 的新鮮介質(zhì)以使杯中總體積保持不變,待釋藥一段時(shí)間后,即可利用UV-Vis分光光度計(jì)和藥物標(biāo)準(zhǔn)濃度計(jì)算出阿霉素的釋放量。

    1.7 MTT法檢測(cè)負(fù)載阿霉素的 PF127/GN/DOX 與 PF127/GN 的細(xì)胞毒性

    取乳腺癌細(xì)胞 ZR-75-30以5×103cells/well 的密度均勻接種到96孔板內(nèi),使用每孔 2000 μL 的細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM, 于37°C,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 至細(xì)胞融合度達(dá) 80%~90% 后,去除孔板中的DMEM,將含有不同濃度 PF127/GN/DOX 與 PF127/GN 樣品的細(xì)胞培養(yǎng)基分別放在孔板中,每孔中加入 200 μL 培養(yǎng)液,分別在 37°C、5 % CO2條件下處理細(xì)胞 24 h。吸棄原培養(yǎng)液, 倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。各孔用 DPBS 小心清洗 1 遍, 加入DMEM 培養(yǎng)液 200 μL, 再加入 5 g/LMTT 溶液 10 μL, 繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后中止培養(yǎng), 小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔加入 100 μL 二甲基亞砜, 置搖床上低速振蕩10 min。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組(即無藥物處理的細(xì)胞)在酶標(biāo)儀OD值 570 nm處測(cè)量各孔的吸光值。利用反向相差顯微鏡拍照獲得乳腺癌細(xì)胞的形貌變化。利用SPSS17.0版本軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。群組間的差異通過方差分析試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。按下式計(jì)算細(xì)胞存活率:

    細(xì)胞相對(duì)增殖率(%) = 實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組OD均值×100%

    細(xì)胞相對(duì)增殖率( RGR) 計(jì)算及細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考ISO2109932-5細(xì)胞毒性試驗(yàn)采用5分制法進(jìn)行細(xì)胞毒性分級(jí)[11](見表1)。

    表1 材料毒性等級(jí)評(píng)價(jià)

    1.8 PF127/GN 對(duì) DOX 的細(xì)胞遞送行為實(shí)驗(yàn)

    先將乳腺癌細(xì)胞 ZR-75-30 以 1×105cells/well的密度接種在激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)板內(nèi),每孔加入 1 mL DMEM 培養(yǎng)基,在 37°C 恒溫條件下培養(yǎng)。 24 h 后,將濃度為 1 mg/mL 的 PF127/GN/DOX 溶液加入培養(yǎng)板中,每孔加入 1 mL,與 ZR-75-30 細(xì)胞共同培養(yǎng) 6 h。6 h 后,用PBS緩沖液沖洗7次,再向培養(yǎng)板內(nèi)加入新的 1 mL 的DMEM培養(yǎng)基,以備觀察。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 PF127 修飾還原態(tài)石墨烯后形貌與尺寸分析

    我們對(duì)氧化石墨烯以及 PF127 功能化修飾的石墨烯進(jìn)行了原子力顯微鏡(AFM)表征,分別從兩種材料的微觀形貌和尺寸大小進(jìn)行分析。隨機(jī)選擇區(qū)域掃描AFM,圖像顯示(圖1),經(jīng)過PF127修飾的還原氧化石墨烯粒子與未經(jīng)修飾的GO相比,尺寸變化不大,分布相對(duì)均勻,該結(jié)果證明實(shí)驗(yàn)中延長(zhǎng)氧化時(shí)間及增大氧化劑用量等方法的使用可有效減小GO尺寸。單純的氧化石墨烯粒子厚度約為0.7~0.8 nm左右,PF127/GN的粒子厚度大約為 9.646 nm,因此我們認(rèn)為,GO本身為單層,修飾后所增加的厚度為PF127在還原態(tài)氧化石墨烯表面包裹所增加的厚度,并沒有對(duì)石墨烯層數(shù)產(chǎn)生影響。

    圖1 PF127/GN(左) 和 GO(右) 的 AFM 圖像

    圖 2 氧化石墨烯的透射電鏡圖

    圖2是氧化石墨烯的透射電鏡圖。從圖2中可以看出,剝離后的氧化石墨烯薄片襯度不同,大小不均一,片層不規(guī)則。光能部分透過它的片層,說明氧化石墨烯在厚度方向上很薄,但片層各部分襯度不同,導(dǎo)致透光性不盡相同,顏色淺的部分透光性好,表明此處較??;顏色深的部分透光性較差,說明此處片層較厚;這表明制得的氧化石墨烯不全是單片層結(jié)構(gòu),有些是幾個(gè)片層的疊加。

    2.2 PF127/GN 對(duì)阿霉素的藥物負(fù)載研究

    將阿霉素作為藥物模型分析阿霉素在PF127/GN上的負(fù)載效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在阿霉素濃度達(dá)到1 mg/mL 時(shí), PF127/GN 的藥物載藥率達(dá)到 290%,(如圖3所示),PF127/GN上阿霉素的載藥率隨初始阿霉素濃度的升高而呈線性增長(zhǎng)。研究表明, PF127/GN 納米載體與傳統(tǒng)納米藥物載體相比,對(duì)阿霉素藥物的負(fù)載率更為理想。這主要是因?yàn)槭┚薮蟮谋缺砻娣e為阿霉素的負(fù)載提供了良好的基礎(chǔ),因此,可通過調(diào)節(jié)阿霉素在 PF127/GN 中的含量來適度安排有效載藥率。

    圖3 負(fù)載了DOX 的PF127/GN的載藥率曲線

    2.3 PF127/GN/DOX的藥物釋放研究

    我們對(duì)PF127/GN上的阿霉素在3種pH值的釋放介質(zhì)中的釋放過程進(jìn)行了觀察,圖4是3種pH值的釋放介質(zhì)中的釋放曲線。結(jié)果圖像顯示,當(dāng)pH值>6.5或者pH值<6.5時(shí),阿霉素的釋放速率1~7 h間釋放迅速,而7 h后逐漸平緩并停止增加,釋放量分別為24%和57%。而當(dāng)pH值為6.5時(shí),6 h后阿霉素的釋放速率達(dá)到 15% 后基本不再變化,這說明阿霉素在中性介質(zhì)中的釋放能力不如在堿性或者酸性下強(qiáng)。這是因?yàn)榘⒚顾嘏c石墨烯間的作用力大小受外界pH值環(huán)境的影響,這種作用力在中性條件下比偏酸性或偏堿性下弱,而在酸性條件下,該作用力比在堿性下弱,所以酸性環(huán)境中會(huì)釋放更多阿霉素。這種對(duì)pH值的敏感性對(duì)腫瘤細(xì)胞的消滅具有重要作用。

    圖4 3種pH值條件下的藥物釋放曲線

    2.4 PF127/GN/DOX 的細(xì)胞毒性研究

    采用乳腺癌細(xì)胞 ZR-75-30 作為模型來對(duì)負(fù)載阿霉素的PF127/GN/DOX與未負(fù)載阿霉素的PF127/GN的細(xì)胞毒性進(jìn)行分析比較(如表2),結(jié)果顯示,當(dāng)PF127/GN/DOX的濃度分別為63 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL和1000 μg/mL時(shí),其細(xì)胞相對(duì)增殖率分別為49%、38%、26%和21%,細(xì)胞毒性分級(jí)均為3-4級(jí),相比較下,PF127/GN在這4種濃度下的細(xì)胞相對(duì)增值率則分別高達(dá)94%、87%、81%和76%,細(xì)胞毒性分級(jí)均為1級(jí)。

    表2 MTT法和細(xì)胞毒性分級(jí)結(jié)果

    2.5 PF127/GN/DOX 的細(xì)胞遞送研究

    納米載體 PF127/GN可將阿霉素藥物輸送到細(xì)胞內(nèi),該遞送過程在通過激光共聚焦顯微鏡(激發(fā)波長(zhǎng)為 240 nm)拍攝到的細(xì)胞的熒光照片中得到證實(shí)。

    以乳腺癌細(xì)胞 ZR-75-30 作為模型來觀察負(fù)載阿霉素的PF127/GN/DOX 的細(xì)胞吞噬過程,結(jié)果如圖5所示。首先在共聚焦顯微鏡下,阿霉素細(xì)胞有明顯紅色熒光(c),然后我們將乳腺癌細(xì)胞 ZR-75-30 細(xì)胞核用DAPI復(fù)染,可以在顯微鏡下可看到細(xì)胞核具有綠色熒光(b),最后,我們看到紅色熒光與綠色熒光重疊了的ZR-75-30 的細(xì)胞核(d),這說明負(fù)載在PF127/GN上的阿霉素進(jìn)入了ZR-75-30細(xì)胞的細(xì)胞核。

    圖5 PF127/GN/DOX對(duì)ZR-75-30的激光共聚焦圖像

    3 小結(jié)

    這種新型的納米載藥體系的載藥量高達(dá)290%,擁有較高的生物利用率。同時(shí),在引入了阿霉素后,該納米載藥體系具有了pH值敏感性和細(xì)胞毒性。本文研究了其在37°C時(shí)不同pH環(huán)境下的釋藥行為,發(fā)現(xiàn)藥物釋放速度在pH為酸性時(shí)較快,而在堿性和中性時(shí)較慢,這有助于對(duì)酸性腫瘤組織部位的釋放。該納米藥物復(fù)合材料為中國(guó)發(fā)展一類新型的納米載藥體系提供了一個(gè)新的思路和方法,具有廣闊的應(yīng)用前景[12,13]。

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