PF127修飾的石墨烯復(fù)合材料的制備及其載藥系統(tǒng)研究

張龍姣， 張陽德， 申玉璞， 申玉坤, 2

(1.中南大學(xué) 衛(wèi)生計(jì)生委肝膽腸外科研究中心， 長(zhǎng)沙 410008； 2.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院，山西 長(zhǎng)治 046000)

石墨烯是一種集高光學(xué)吸收、高強(qiáng)度、極大比表面積、較低生產(chǎn)成本(相對(duì)于碳納米管)等多種優(yōu)異性質(zhì)于一體的新型二維碳納米材料，由sp2碳原子組成，是研究碳材料各種晶體理論計(jì)算和推導(dǎo)的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，非常適合于開發(fā)高性能的復(fù)合材料[1]；它憑借納米尺寸的結(jié)構(gòu)、優(yōu)異的生物相容性和長(zhǎng)的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間使其在納米藥物載體領(lǐng)域擁有極大的潛能；而氧化石墨烯還能穩(wěn)定地分散于水中，并且表面經(jīng)過良好修飾的氧化石墨烯能夠穩(wěn)定存在于高鹽溶液和生理?xiàng)l件下，這都?xì)w功于氧化石墨烯的表面擁有非常豐富的親水性官能團(tuán)，這些特性為其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)[2]。普朗尼克PF127是一種兩親性高分子聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物，它能對(duì)氧化石墨烯上各種親水性官能團(tuán)進(jìn)行共價(jià)修飾，從而可獲得水溶性良好的功能化石墨烯基底材料；獨(dú)特的兩親性三嵌段微區(qū)結(jié)構(gòu)，使其與石墨烯復(fù)合后，結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定[3]。

目前，全球癌癥患者呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，主要是缺少有效的治療手段，而化學(xué)治療是治療腫瘤的重要手段之一[4]。 化療藥物的細(xì)胞毒性缺乏選擇性，常引起嚴(yán)重不良反應(yīng)，盡管目前的研究已經(jīng)取得重大進(jìn)步，但是化療的副作用還是很大，我們?nèi)匀恍枰獙?duì)傳統(tǒng)的化療藥物進(jìn)行改進(jìn)。于是增強(qiáng)藥物的靶向性運(yùn)輸、提高腫瘤選擇性毒性是提高化療效果并降低藥物的毒副反應(yīng)的有效方法，那么選擇一個(gè)高效的藥物運(yùn)輸載體是至關(guān)重要的[5]。由于氧化石墨烯具有單原子層結(jié)構(gòu)，其比表面積很大，且兩個(gè)基面都可以吸附藥物，因此非常適合用作藥物載體[6, 7]。

阿霉素是一種抗腫瘤抗生素，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有殺滅作用，由于其本身存在強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性，使之無法在臨床醫(yī)學(xué)上得到廣泛應(yīng)用[8]。而如將阿霉素負(fù)載在膠質(zhì)載體上經(jīng)過合成后再進(jìn)行用藥，不僅可以降低其細(xì)胞毒性帶來的不良反應(yīng)，還可有效提高藥物療效。

目前，關(guān)于功能化石墨烯的研究還主要集中在物理學(xué)、化學(xué)等領(lǐng)域，而其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究還相對(duì)較少，如靶向藥物輸運(yùn)、生物檢測(cè)、腫瘤治療以及石墨烯生物安全性等的研究還處于剛剛起步的階段[9, 10]。本研究通過對(duì)負(fù)載阿霉素的PF127修飾的還原態(tài)石墨烯復(fù)合材料(PF127/GN/DOX)進(jìn)行藥物緩釋，細(xì)胞吞噬以及細(xì)胞毒性方面的研究，發(fā)現(xiàn)這種材料質(zhì)量可靠，性能良好，這為中國(guó)發(fā)展更為理想的新型智能型納米藥物載體提供了一個(gè)新的思路和方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

天然鱗片石墨粉(粒徑為40～50 μm)，純度 > 99.9%，青島歐爾石墨有限公司產(chǎn)品；鹽酸阿霉素，上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司，使用前用三乙醇胺脫鹽酸鹽；三嵌段共聚物普朗尼克 PF127(WPMF542B)，上海BASF公司產(chǎn)品；透析袋，寬度 34 mm，容量3.4 mL/cm，截留分子量8000～14000，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氧化石墨烯通過 Hummers 自制；水合肼(88%)，濃硫酸(95%)，雙氧水(30%)，氨水，高錳酸鉀等常規(guī)試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，使用前未經(jīng)進(jìn)一步純化處理。實(shí)驗(yàn)中所有用水均為二次蒸餾水。

水平搖床(北京六一儀器有限公司)；SIGMA超速冷凍離心機(jī)(德國(guó)SIGMA公司)；85-2A 控溫恒速攪拌器(上海德洋意邦儀器有限公司)；JY98-III 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；81-2 型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器廠)； PS-100A 超聲波清洗器(昆山超聲波清洗器有限公司)；拉曼光譜儀(英國(guó)雷尼紹公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；Multimode V 型原子力顯微鏡(美國(guó)Veeco精密儀器有限公司) TCSSP5 激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica儀器公司)； NanoDrop ND-2000C 紫外-可見分光光度儀(美國(guó)Thermo公司)。

1.2 氧化石墨烯(GO)的制備

采用Hummer法制備氧化石墨：移取 200 mL 的濃硫酸，在冰浴條件下放置一段時(shí)間使?jié)饬蛩岬臏囟冉咏囟?，在不斷攪拌的情況下慢慢將 5 g 石墨粉加入濃硫酸當(dāng)中，然后再稱取 18 g的高錳酸鉀也逐漸加入到濃硫酸中，保持冰浴條件下持續(xù)攪拌 3 h 使之混勻。之后，從冰浴中取出在室溫條件下繼續(xù)攪拌反應(yīng) 5 d，回到冰浴條件下，再次加入 18 g高錳酸鉀，持續(xù)攪拌 3 h，重復(fù)上述步驟1次。量筒量取 46 mL 的水，逐滴緩慢滴加，保持混合物溫度不要過高，之后將其放在 90～100℃ 的水浴中，繼續(xù)攪拌反應(yīng) 30 min ，從熱水浴中取出之后再加入 140 mL 水和 10 mL 30wt% 的雙氧水變成亮黃色，混勻之后離心分離，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù) 5% 的鹽酸溶液和無水乙醇分別對(duì)分離出的產(chǎn)物進(jìn)行離心清洗至中性，恒溫干燥箱 50°C 下烘干即得氧化石墨烯。

1.3 氧化石墨烯的剝離及純化

取適量干燥后的氧化石墨烯，加入 50 mL 蒸餾水，在冰浴條件下，使用超聲粉碎機(jī)在 500 W 的功率下對(duì)混合物進(jìn)行超聲震蕩1 h ，氧化石墨片層剝落，獲得棕黃色的分散液，將分散液在 12000 r/min下離心15 min，收集棕黃色上清，將沉淀再次加入蒸餾水，重復(fù)上述步驟，最終得到氧化石墨烯水溶液。

將氧化石墨烯水溶液加入適量蒸餾水后以截留分子量為 8000～14000 的透析袋透析 2 d，獲得濾液即為純化后的氧化石墨烯分散液。此時(shí)的石墨烯尺寸較小且分散完全。

1.4 PF127 修飾還原態(tài)石墨烯(PF127/GN)的制備

取 500 mg PF127，加入到石墨烯分散液中，超聲使其分散均勻，磁力攪拌30 min，然后邊攪拌邊向混合物中加入500 μL的水合肼和2 μL的氨水溶液，保持溫度在90℃的條件下進(jìn)行回流反應(yīng)24 h，進(jìn)行透析操作48 h，然后，將透析液在12000 r/min下離心15 min，去除沉淀，該沉淀物一般為未被PF127修飾的還原態(tài)石墨烯，獲得黑色半透明的離心液，最后得到的黑色上清液即為石墨烯穩(wěn)定分散液，確定濃度后密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 阿霉素(DOX)對(duì)PF127修飾的石墨烯復(fù)合材料(PF127/GN)的負(fù)載

阿霉素的負(fù)載是通過將阿霉素溶液和納米載體PF127/GN簡(jiǎn)單的混合實(shí)現(xiàn)。為了更為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆治霭⒚顾卦赑F127/GN上的負(fù)載效果，我們采用不同濃度的阿霉素溶液對(duì)PF127/GN進(jìn)行混合。本實(shí)驗(yàn)將阿霉素溶液的濃度分別定量為：0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL和1.0 mg/mL 。具體操作步驟如下：首先，取不同濃度的阿霉素溶液緩慢滴入稱有石墨烯分散液(15 mL，0.05 mg/mL)的燒瓶中，均勻攪拌 24 h，攪拌過程中注意避免陽光直射。反應(yīng)完成后，將燒杯中的合成液在 12000 r/min條件下離心1 h ，將沉淀物去除，取得負(fù)載了阿霉素的石墨烯分散液，記為PF127/GN/DOX，利用紫外-可見分光光度計(jì)可計(jì)算出負(fù)載在合成液上的阿霉素量。計(jì)算公式如下：

PF127/GN/DOX上的阿霉素量=初始加入的阿霉素含量-上層清液中阿霉素含量

其中，上層清液中阿霉素的含量可通過使用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)量離心后上層清液在480 nm紫外吸收峰的吸光度，然后對(duì)照阿霉素標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線后計(jì)算獲得。

1.6 不同pH值生理緩沖液條件下 PF127/GN/DOX 中阿霉素的藥物釋放實(shí)驗(yàn)

將3種不同pH值的緩沖液放入燒杯中，取PF127/GN/DOX(2 mL，1 mg/mL) 作為樣品分別裝入3個(gè)透析袋中，然后分別放入3個(gè)燒杯中，將燒杯放在搖床中，在轉(zhuǎn)速為180 r/min，37℃的條件下恒溫震蕩進(jìn)行藥物的體外釋放考察。在此過程中，定時(shí)量取 5 mL 燒杯中的溶液測(cè)量藥物釋放量，注意每次取出溶液后應(yīng)在燒杯中相應(yīng)補(bǔ)充 5 mL 的新鮮介質(zhì)以使杯中總體積保持不變，待釋藥一段時(shí)間后，即可利用UV-Vis分光光度計(jì)和藥物標(biāo)準(zhǔn)濃度計(jì)算出阿霉素的釋放量。

1.7 MTT法檢測(cè)負(fù)載阿霉素的 PF127/GN/DOX 與 PF127/GN 的細(xì)胞毒性

取乳腺癌細(xì)胞 ZR-75-30以5×103cells/well 的密度均勻接種到96孔板內(nèi)，使用每孔 2000 μL 的細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM, 于37°C，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 至細(xì)胞融合度達(dá) 80%～90% 后，去除孔板中的DMEM，將含有不同濃度 PF127/GN/DOX 與 PF127/GN 樣品的細(xì)胞培養(yǎng)基分別放在孔板中，每孔中加入 200 μL 培養(yǎng)液，分別在 37°C、5 % CO2條件下處理細(xì)胞 24 h。吸棄原培養(yǎng)液, 倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。各孔用 DPBS 小心清洗 1 遍, 加入DMEM 培養(yǎng)液 200 μL, 再加入 5 g/LMTT 溶液 10 μL, 繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后中止培養(yǎng), 小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔加入 100 μL 二甲基亞砜, 置搖床上低速振蕩10 min。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組(即無藥物處理的細(xì)胞)在酶標(biāo)儀OD值 570 nm處測(cè)量各孔的吸光值。利用反向相差顯微鏡拍照獲得乳腺癌細(xì)胞的形貌變化。利用SPSS17.0版本軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。群組間的差異通過方差分析試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。按下式計(jì)算細(xì)胞存活率：

細(xì)胞相對(duì)增殖率(%) = 實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組OD均值×100%

細(xì)胞相對(duì)增殖率( RGR) 計(jì)算及細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參考ISO2109932-5細(xì)胞毒性試驗(yàn)采用5分制法進(jìn)行細(xì)胞毒性分級(jí)[11](見表1)。

表1 材料毒性等級(jí)評(píng)價(jià)

1.8 PF127/GN 對(duì) DOX 的細(xì)胞遞送行為實(shí)驗(yàn)

先將乳腺癌細(xì)胞 ZR-75-30 以 1×105cells/well的密度接種在激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入 1 mL DMEM 培養(yǎng)基，在 37°C 恒溫條件下培養(yǎng)。 24 h 后，將濃度為 1 mg/mL 的 PF127/GN/DOX 溶液加入培養(yǎng)板中，每孔加入 1 mL，與 ZR-75-30 細(xì)胞共同培養(yǎng) 6 h。6 h 后，用PBS緩沖液沖洗7次，再向培養(yǎng)板內(nèi)加入新的 1 mL 的DMEM培養(yǎng)基，以備觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 PF127 修飾還原態(tài)石墨烯后形貌與尺寸分析

我們對(duì)氧化石墨烯以及 PF127 功能化修飾的石墨烯進(jìn)行了原子力顯微鏡(AFM)表征，分別從兩種材料的微觀形貌和尺寸大小進(jìn)行分析。隨機(jī)選擇區(qū)域掃描AFM，圖像顯示(圖1)，經(jīng)過PF127修飾的還原氧化石墨烯粒子與未經(jīng)修飾的GO相比，尺寸變化不大，分布相對(duì)均勻，該結(jié)果證明實(shí)驗(yàn)中延長(zhǎng)氧化時(shí)間及增大氧化劑用量等方法的使用可有效減小GO尺寸。單純的氧化石墨烯粒子厚度約為0.7～0.8 nm左右，PF127/GN的粒子厚度大約為 9.646 nm，因此我們認(rèn)為，GO本身為單層，修飾后所增加的厚度為PF127在還原態(tài)氧化石墨烯表面包裹所增加的厚度，并沒有對(duì)石墨烯層數(shù)產(chǎn)生影響。

圖1 PF127/GN(左) 和 GO(右) 的 AFM 圖像

圖 2 氧化石墨烯的透射電鏡圖

圖2是氧化石墨烯的透射電鏡圖。從圖2中可以看出，剝離后的氧化石墨烯薄片襯度不同，大小不均一，片層不規(guī)則。光能部分透過它的片層，說明氧化石墨烯在厚度方向上很薄，但片層各部分襯度不同，導(dǎo)致透光性不盡相同，顏色淺的部分透光性好，表明此處較??；顏色深的部分透光性較差，說明此處片層較厚；這表明制得的氧化石墨烯不全是單片層結(jié)構(gòu)，有些是幾個(gè)片層的疊加。

2.2 PF127/GN 對(duì)阿霉素的藥物負(fù)載研究

將阿霉素作為藥物模型分析阿霉素在PF127/GN上的負(fù)載效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在阿霉素濃度達(dá)到1 mg/mL 時(shí)， PF127/GN 的藥物載藥率達(dá)到 290%，(如圖3所示)，PF127/GN上阿霉素的載藥率隨初始阿霉素濃度的升高而呈線性增長(zhǎng)。研究表明， PF127/GN 納米載體與傳統(tǒng)納米藥物載體相比，對(duì)阿霉素藥物的負(fù)載率更為理想。這主要是因?yàn)槭┚薮蟮谋缺砻娣e為阿霉素的負(fù)載提供了良好的基礎(chǔ)，因此，可通過調(diào)節(jié)阿霉素在 PF127/GN 中的含量來適度安排有效載藥率。

圖3 負(fù)載了DOX 的PF127/GN的載藥率曲線

2.3 PF127/GN/DOX的藥物釋放研究

我們對(duì)PF127/GN上的阿霉素在3種pH值的釋放介質(zhì)中的釋放過程進(jìn)行了觀察，圖4是3種pH值的釋放介質(zhì)中的釋放曲線。結(jié)果圖像顯示，當(dāng)pH值>6.5或者pH值<6.5時(shí)，阿霉素的釋放速率1～7 h間釋放迅速，而7 h后逐漸平緩并停止增加，釋放量分別為24%和57%。而當(dāng)pH值為6.5時(shí)，6 h后阿霉素的釋放速率達(dá)到 15% 后基本不再變化，這說明阿霉素在中性介質(zhì)中的釋放能力不如在堿性或者酸性下強(qiáng)。這是因?yàn)榘⒚顾嘏c石墨烯間的作用力大小受外界pH值環(huán)境的影響，這種作用力在中性條件下比偏酸性或偏堿性下弱，而在酸性條件下，該作用力比在堿性下弱，所以酸性環(huán)境中會(huì)釋放更多阿霉素。這種對(duì)pH值的敏感性對(duì)腫瘤細(xì)胞的消滅具有重要作用。

圖4 3種pH值條件下的藥物釋放曲線

2.4 PF127/GN/DOX 的細(xì)胞毒性研究

采用乳腺癌細(xì)胞 ZR-75-30 作為模型來對(duì)負(fù)載阿霉素的PF127/GN/DOX與未負(fù)載阿霉素的PF127/GN的細(xì)胞毒性進(jìn)行分析比較(如表2)，結(jié)果顯示，當(dāng)PF127/GN/DOX的濃度分別為63 μg/mL、250 μg/mL、500 μg/mL和1000 μg/mL時(shí)，其細(xì)胞相對(duì)增殖率分別為49%、38%、26%和21%，細(xì)胞毒性分級(jí)均為3-4級(jí)，相比較下，PF127/GN在這4種濃度下的細(xì)胞相對(duì)增值率則分別高達(dá)94%、87%、81%和76%，細(xì)胞毒性分級(jí)均為1級(jí)。

表2 MTT法和細(xì)胞毒性分級(jí)結(jié)果

2.5 PF127/GN/DOX 的細(xì)胞遞送研究

納米載體 PF127/GN可將阿霉素藥物輸送到細(xì)胞內(nèi)，該遞送過程在通過激光共聚焦顯微鏡(激發(fā)波長(zhǎng)為 240 nm)拍攝到的細(xì)胞的熒光照片中得到證實(shí)。

以乳腺癌細(xì)胞 ZR-75-30 作為模型來觀察負(fù)載阿霉素的PF127/GN/DOX 的細(xì)胞吞噬過程，結(jié)果如圖5所示。首先在共聚焦顯微鏡下，阿霉素細(xì)胞有明顯紅色熒光(c)，然后我們將乳腺癌細(xì)胞 ZR-75-30 細(xì)胞核用DAPI復(fù)染，可以在顯微鏡下可看到細(xì)胞核具有綠色熒光(b)，最后，我們看到紅色熒光與綠色熒光重疊了的ZR-75-30 的細(xì)胞核(d)，這說明負(fù)載在PF127/GN上的阿霉素進(jìn)入了ZR-75-30細(xì)胞的細(xì)胞核。

圖5 PF127/GN/DOX對(duì)ZR-75-30的激光共聚焦圖像

3 小結(jié)

這種新型的納米載藥體系的載藥量高達(dá)290%，擁有較高的生物利用率。同時(shí)，在引入了阿霉素后，該納米載藥體系具有了pH值敏感性和細(xì)胞毒性。本文研究了其在37°C時(shí)不同pH環(huán)境下的釋藥行為，發(fā)現(xiàn)藥物釋放速度在pH為酸性時(shí)較快，而在堿性和中性時(shí)較慢，這有助于對(duì)酸性腫瘤組織部位的釋放。該納米藥物復(fù)合材料為中國(guó)發(fā)展一類新型的納米載藥體系提供了一個(gè)新的思路和方法，具有廣闊的應(yīng)用前景[12，13]。

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