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    假蜜環(huán)菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化研究

    2014-03-25 07:14:58徐來清張書祥
    生物學(xué)雜志 2014年3期
    關(guān)鍵詞:菌粉甲素發(fā)酵罐

    徐來清, 張書祥

    (安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,安徽 合肥 230601)

    假蜜環(huán)菌 [Armillariellatabescens(Scop.ex Fr.)Sing]是層菌綱口蘑科假蜜環(huán)菌屬真菌,因菌絲體在暗處發(fā)出熒光,故稱為亮菌。該菌具有治療肝炎、膽囊炎、腫瘤以及放療、化療引起的白細(xì)胞減少等藥效,且還具有強筋壯骨、疏風(fēng)活絡(luò)、明目、利肺、醒酒、益腸胃等保健功效[1-3]。現(xiàn)代研究表明,用乙醇、乙酸乙酯提取可得到亮菌甲素、亮菌乙素、亮菌丙素,而亮菌甲素主要用于急慢性肝炎、慢性淺表性胃炎和慢性膽囊炎急性發(fā)作等疾病的對癥治療[3,4]。另據(jù)報道,用水提或堿提法可提取得到亮菌雜多糖ATM3、AT-HW和AT-AC,而亮菌多糖是假蜜環(huán)菌生理生化活性的主要成分之一,具有抑制小鼠S180腫瘤的生長,提高機體免疫機能的功效[5-8]。

    目前, 國內(nèi)亮菌口服液或膠囊制劑多采用固體發(fā)酵工藝生產(chǎn),以廉價易得的玉米粉、紅薯粉等原料按一定比例混合配制固體培養(yǎng)基, 滅菌接種, 然后在室內(nèi)避光培養(yǎng)2個月左右。這種生產(chǎn)方式優(yōu)點是發(fā)酵程度深,有利于多種藥用有效成分的表達(dá)分泌,但明顯存在的問題是生產(chǎn)周期長,污染的概率大,且一旦染菌只能全部丟掉,浪費大。因此,固體發(fā)酵規(guī)模小、周期長、產(chǎn)量低的缺點嚴(yán)重制約了企業(yè)的產(chǎn)能和效益。

    本文在相關(guān)文獻(xiàn)報道的基礎(chǔ)上[9,10],針對合肥誠志生物制藥有限公司提供的假蜜環(huán)菌菌種,在本實驗室前期工作的基礎(chǔ)[11]上,進(jìn)行液體發(fā)酵罐深層發(fā)酵和靜置發(fā)酵兩種發(fā)酵方式的研究,探究其取代傳統(tǒng)固體發(fā)酵方式的可行性,為亮菌口服液的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種

    假蜜環(huán)菌[Armillariellatabescens(Scop.ex Fr.)Sing]菌種由合肥誠志生物制藥有限公司提供。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    1)試管斜面培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基。

    2)液體培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯去皮,200;KH2PO4,2;MgSO4·7H2O,1。

    1.1.3 試劑

    亮菌甲素對照品(中國藥品生物制品檢定所);甲醇為色譜純,其余試劑均為分析純。

    1.1.4 主要儀器

    UV-5200 紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司); SX-700壓力蒸汽滅菌鍋(TOMY);R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI);高效液相色譜儀(HITACHI D-2000 series);色譜柱:Agilent TC-C18(2) (4.6 mm × 250 mm,5 μm);檢測器:L-2420; PiloFD系列中試型凍干機(SIM),GF-1高速勻漿機(海門市麒麟醫(yī)用儀器廠);SNB-2數(shù)字粘度計(上海精科);BIOFLO-410型發(fā)酵罐(NBS)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 液體種子的制備[11]

    試管菌種經(jīng)活化,用接種鏟挑取試管表面菌絲體于盛有無菌水的250 mL三角瓶中,勻漿機打散,按10%接種量接種入250 mL 三角瓶內(nèi),28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)4 d。

    1.2.2 發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵

    待三角瓶內(nèi)形成菌絲球并均勻分散在培養(yǎng)基中時,將液體種子按5%接種量接種于14 L 發(fā)酵罐中。28 ℃,200 r/min,pH值5.5,通氣量1∶ 1 v/v·m,培養(yǎng)7 d,放罐。

    1.2.3 靜置發(fā)酵

    將液體種子按10%接種量接種于500 mL三角瓶中,先28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)4 d,然后避光靜置培養(yǎng)2個星期。用勻漿機將發(fā)酵液攪勻,準(zhǔn)確測定菌絲生物量及各活性成分含量。

    1.3 測定方法

    1.3.1 亮菌干重的測定

    取發(fā)酵罐的發(fā)酵液樣品共9份,每份100 mL,4000 r/min離心20 min,去上清,沉淀用蒸餾水沖洗,重復(fù)操作2次收集沉淀,取9份中的任意3份,80℃烘干至恒重,電子天平稱量菌絲體的干質(zhì)量。另外6份冷凍干燥制成亮菌菌粉,測定菌粉中多糖和蛋白含量。靜置發(fā)酵菌絲體生物量的測定與之相同。

    1.3.2 多糖含量測定[10,12]

    1)熱水浸提法提取亮菌粗多糖。發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵法:稱取制得的1 g菌粉,加入蒸餾水300 mL,80℃下水浴2.5 h,不斷攪動,防止黏壁。浸提完畢后冷卻至室溫,4000 r/min離心20 min,收集上清,沉淀在相同條件下重復(fù)浸提2次,合并濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(65℃)濃縮至原液的1/6,得亮菌粗多糖提取液。

    液體靜置法:取發(fā)酵完畢后的發(fā)酵液100 mL代替1 g菌粉,其余操作與發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵法完全相同。

    2)樣品多糖含量測定。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密量取0.1 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mL分別置于潔凈的具塞試管中,分別加入蒸餾水補充至1 mL,依次加入6%的苯酚1 mL,再迅速加入濃硫酸5 mL,振蕩混勻10 min,冷卻至室溫靜置20 min,490 nm處比色,測定吸光值。測的多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y= 11.41x+0.003(x為多糖濃度,y為OD值),回歸率R2= 0.9993。

    樣品多糖含量測定:向提取的多糖溶液中加入95%乙醇,使含醇量達(dá)到80%,4℃靜置過夜,4000 r/min條件下離心20 min得粗多糖,加入蒸餾水復(fù)溶,定容至1000 mL。苯酚硫酸法測定吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算發(fā)酵液中多糖濃度。

    1.3.3 蛋白質(zhì)含量測定[11]

    1)考馬斯亮藍(lán)G-250染液的配置:取50 mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于25 mL 95%乙醇中,待完全溶解后加入50 mL 85%磷酸,最后用蒸餾水定容至500 mL。

    2)考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密量取100 mg/L的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 mL,分別置于潔凈的具塞試管中,分別加入蒸餾水補充至1 mL,各試管中依次加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑,595 nm處比色,測定吸光值。測的考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=6.9463x+0.0054(x為蛋白濃度,y為OD值),回歸率R2=0.9997。

    3)樣品中蛋白質(zhì)含量測定:稱取1 g菌粉(菌粉用蒸餾水定容至100 mL)或100 mL發(fā)酵液,4000 r/min ,4℃離心20 min,破碎細(xì)胞,收集上清,沉淀相同條件重復(fù)浸提2次,合并濾液,定容至1000 mL,595 nm處比色,測定吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算發(fā)酵液中蛋白濃度。

    1.3.4 亮菌甲素含量的測定[13,14]

    1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密稱取10 mg亮菌甲素標(biāo)準(zhǔn)品置500 mL容量瓶中,以流動相為甲醇和0.1 mol/L乙酸(50∶ 50)溶解定容,超聲20 min后,用流動相梯度稀釋成濃度為0.125、0.25、0.5、1、2和4 mg/L的系列對照品溶液。分別進(jìn)樣16 μL,柱溫30℃,檢測波長為366 nm,測定峰面積積分值。在上述色譜條件下測定,測的亮菌甲素標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=112.57x+2978.8(x為亮菌甲素濃度,y為峰面積積分值),回歸率R2=0.9997。

    2)樣品中亮菌甲素含量的測定:為了進(jìn)一步的分析靜置發(fā)酵液中藥效成分亮菌甲素的含量,稱取經(jīng)勻漿機打散的靜置發(fā)酵的發(fā)酵液100 mL,超聲15 min,4000 r/min ,4℃離心20 min,收集上清,沉淀相同條件重復(fù)浸提2次,合并濾液,定容至1000 mL,取50 mL置分液漏斗中加無水乙醇10 mL,再加50 mL無水乙醚提取,收集有機相,水相繼續(xù)用50 mL無水乙醚提取2次,合并乙醚液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干,用流動相溶解定容至10 mL,進(jìn)樣16 μL,柱溫30℃,檢測波長為366 nm,測定峰面積積分值。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 發(fā)酵罐深層發(fā)酵

    經(jīng)發(fā)酵罐7 d避光培養(yǎng),測得此時的發(fā)酵液粘度為746 mPa·S(測定條件:25.0℃,1#轉(zhuǎn)子,6 r/min),此時發(fā)酵液中菌絲呈白色纖維糊狀,發(fā)酵液呈棕黃色。發(fā)酵液菌絲干重及菌粉中多糖和蛋白含量見表1。

    表1 發(fā)酵罐發(fā)酵液組分

    由表1可知,通過發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵方式所獲得的亮菌生物量平均能達(dá)到16.55 g/L,且周期短。但缺點是發(fā)酵液顏色不深,發(fā)酵程度低,無法像固體發(fā)酵那樣菌絲體表層分泌大量棕褐色液體,這可能是由于液體發(fā)酵環(huán)境無法為亮菌次級代謝產(chǎn)胞外棕褐色漿液創(chuàng)造適宜的環(huán)境。

    2.2 靜置培養(yǎng)發(fā)酵

    靜置發(fā)酵2周后,發(fā)酵液表面形成約5 mm厚的菌絲層,且菌絲分泌大量棕褐色液體,發(fā)酵液中菌索向下延伸粗壯且多分支布滿整個三角瓶,三角瓶中發(fā)酵液呈膠質(zhì)半固體形態(tài)。稱取經(jīng)勻漿機打散的發(fā)酵液100 mL,4000 r/min條件下離心20 min ,沉淀80℃烘干至恒重。發(fā)酵液組分各項指標(biāo)見表2。

    表 2 靜置培養(yǎng)發(fā)酵液組分

    通過表2可知,發(fā)酵液中多糖含量為9.5%,蛋白質(zhì)含量為3.0%。對比表1和表2,雖然靜置發(fā)酵得到的亮菌生物量不及發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵,但其發(fā)酵程度深,培養(yǎng)基利用率高,發(fā)酵液中多糖和蛋白含量明顯優(yōu)于液體深層發(fā)酵的發(fā)酵結(jié)果,同時也優(yōu)于傳統(tǒng)的固體發(fā)酵[11]。

    為了進(jìn)一步的探究靜置發(fā)酵生產(chǎn)工藝能否取代傳統(tǒng)的亮菌固體發(fā)酵生產(chǎn)工藝,本實驗室采用HPLC法檢測靜置發(fā)酵液中亮菌甲素的含量(見圖1和圖2),結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中亮菌甲素含量平均為3.118 mg/L。

    圖 1 亮菌甲素對照品HPLC色譜圖

    圖2 樣品HPLC色譜圖

    由圖1和圖2可以看出,亮菌甲素對照品和供試品中亮菌甲素的保留時間均在6.91 min左右,峰形較好。亮菌甲素屬于香豆素類衍生物,具有親脂性,易溶于乙醚,因此采用乙醚提取純化,結(jié)果顯示純化后的樣品中雜質(zhì)含量較少且對待測物峰無影響[4,14]。

    3 小結(jié)與討論

    1)通過14 L發(fā)酵罐進(jìn)行液體深層發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)盡管能夠?qū)崿F(xiàn)可觀的菌絲生物量和較短的發(fā)酵周期,但發(fā)酵液顏色不是很深,發(fā)酵程度低,發(fā)酵液制得的菌粉中多糖和蛋白含量均較低,無法形成像固體發(fā)酵菌絲體分泌大量棕褐色液體和粗壯多分枝菌索的現(xiàn)象,而能否大量分泌棕褐色液體是合肥誠志生物制藥有限公司在應(yīng)用傳統(tǒng)的固體發(fā)酵工藝生產(chǎn)亮菌口服液制劑中衡量亮菌發(fā)酵質(zhì)量的一項重要指標(biāo),因此本文所采用的發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵工藝尚需進(jìn)一步加以研究和探討。

    2)采用液體靜置發(fā)酵的方法,觀察發(fā)現(xiàn)所有三角瓶都能分泌大量棕褐色液體和形成粗壯多分支的菌索。該方法大大縮短了發(fā)酵周期,且發(fā)酵液質(zhì)量高,雜質(zhì)少,提取濃縮簡單易行,亮菌多糖等活性成分指標(biāo)均優(yōu)于傳統(tǒng)的固體發(fā)酵。

    綜合以上兩種發(fā)酵方法,液體靜置發(fā)酵法結(jié)合了傳統(tǒng)固體發(fā)酵程度深和液體發(fā)酵周期短的雙重優(yōu)點,且在多項技術(shù)指標(biāo)及發(fā)酵成本方面均有優(yōu)越性。此外,靜置發(fā)酵法操作簡便,無需專門設(shè)備,是亮菌制劑工業(yè)生產(chǎn)工藝改進(jìn)與創(chuàng)新的首選。

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