• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    假蜜環(huán)菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化研究

    2014-03-25 07:14:58徐來清張書祥
    生物學(xué)雜志 2014年3期
    關(guān)鍵詞:菌粉甲素發(fā)酵罐

    徐來清, 張書祥

    (安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,安徽 合肥 230601)

    假蜜環(huán)菌 [Armillariellatabescens(Scop.ex Fr.)Sing]是層菌綱口蘑科假蜜環(huán)菌屬真菌,因菌絲體在暗處發(fā)出熒光,故稱為亮菌。該菌具有治療肝炎、膽囊炎、腫瘤以及放療、化療引起的白細(xì)胞減少等藥效,且還具有強筋壯骨、疏風(fēng)活絡(luò)、明目、利肺、醒酒、益腸胃等保健功效[1-3]。現(xiàn)代研究表明,用乙醇、乙酸乙酯提取可得到亮菌甲素、亮菌乙素、亮菌丙素,而亮菌甲素主要用于急慢性肝炎、慢性淺表性胃炎和慢性膽囊炎急性發(fā)作等疾病的對癥治療[3,4]。另據(jù)報道,用水提或堿提法可提取得到亮菌雜多糖ATM3、AT-HW和AT-AC,而亮菌多糖是假蜜環(huán)菌生理生化活性的主要成分之一,具有抑制小鼠S180腫瘤的生長,提高機體免疫機能的功效[5-8]。

    目前, 國內(nèi)亮菌口服液或膠囊制劑多采用固體發(fā)酵工藝生產(chǎn),以廉價易得的玉米粉、紅薯粉等原料按一定比例混合配制固體培養(yǎng)基, 滅菌接種, 然后在室內(nèi)避光培養(yǎng)2個月左右。這種生產(chǎn)方式優(yōu)點是發(fā)酵程度深,有利于多種藥用有效成分的表達(dá)分泌,但明顯存在的問題是生產(chǎn)周期長,污染的概率大,且一旦染菌只能全部丟掉,浪費大。因此,固體發(fā)酵規(guī)模小、周期長、產(chǎn)量低的缺點嚴(yán)重制約了企業(yè)的產(chǎn)能和效益。

    本文在相關(guān)文獻(xiàn)報道的基礎(chǔ)上[9,10],針對合肥誠志生物制藥有限公司提供的假蜜環(huán)菌菌種,在本實驗室前期工作的基礎(chǔ)[11]上,進(jìn)行液體發(fā)酵罐深層發(fā)酵和靜置發(fā)酵兩種發(fā)酵方式的研究,探究其取代傳統(tǒng)固體發(fā)酵方式的可行性,為亮菌口服液的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種

    假蜜環(huán)菌[Armillariellatabescens(Scop.ex Fr.)Sing]菌種由合肥誠志生物制藥有限公司提供。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    1)試管斜面培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基。

    2)液體培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯去皮,200;KH2PO4,2;MgSO4·7H2O,1。

    1.1.3 試劑

    亮菌甲素對照品(中國藥品生物制品檢定所);甲醇為色譜純,其余試劑均為分析純。

    1.1.4 主要儀器

    UV-5200 紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司); SX-700壓力蒸汽滅菌鍋(TOMY);R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI);高效液相色譜儀(HITACHI D-2000 series);色譜柱:Agilent TC-C18(2) (4.6 mm × 250 mm,5 μm);檢測器:L-2420; PiloFD系列中試型凍干機(SIM),GF-1高速勻漿機(海門市麒麟醫(yī)用儀器廠);SNB-2數(shù)字粘度計(上海精科);BIOFLO-410型發(fā)酵罐(NBS)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 液體種子的制備[11]

    試管菌種經(jīng)活化,用接種鏟挑取試管表面菌絲體于盛有無菌水的250 mL三角瓶中,勻漿機打散,按10%接種量接種入250 mL 三角瓶內(nèi),28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)4 d。

    1.2.2 發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵

    待三角瓶內(nèi)形成菌絲球并均勻分散在培養(yǎng)基中時,將液體種子按5%接種量接種于14 L 發(fā)酵罐中。28 ℃,200 r/min,pH值5.5,通氣量1∶ 1 v/v·m,培養(yǎng)7 d,放罐。

    1.2.3 靜置發(fā)酵

    將液體種子按10%接種量接種于500 mL三角瓶中,先28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)4 d,然后避光靜置培養(yǎng)2個星期。用勻漿機將發(fā)酵液攪勻,準(zhǔn)確測定菌絲生物量及各活性成分含量。

    1.3 測定方法

    1.3.1 亮菌干重的測定

    取發(fā)酵罐的發(fā)酵液樣品共9份,每份100 mL,4000 r/min離心20 min,去上清,沉淀用蒸餾水沖洗,重復(fù)操作2次收集沉淀,取9份中的任意3份,80℃烘干至恒重,電子天平稱量菌絲體的干質(zhì)量。另外6份冷凍干燥制成亮菌菌粉,測定菌粉中多糖和蛋白含量。靜置發(fā)酵菌絲體生物量的測定與之相同。

    1.3.2 多糖含量測定[10,12]

    1)熱水浸提法提取亮菌粗多糖。發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵法:稱取制得的1 g菌粉,加入蒸餾水300 mL,80℃下水浴2.5 h,不斷攪動,防止黏壁。浸提完畢后冷卻至室溫,4000 r/min離心20 min,收集上清,沉淀在相同條件下重復(fù)浸提2次,合并濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(65℃)濃縮至原液的1/6,得亮菌粗多糖提取液。

    液體靜置法:取發(fā)酵完畢后的發(fā)酵液100 mL代替1 g菌粉,其余操作與發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵法完全相同。

    2)樣品多糖含量測定。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密量取0.1 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mL分別置于潔凈的具塞試管中,分別加入蒸餾水補充至1 mL,依次加入6%的苯酚1 mL,再迅速加入濃硫酸5 mL,振蕩混勻10 min,冷卻至室溫靜置20 min,490 nm處比色,測定吸光值。測的多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y= 11.41x+0.003(x為多糖濃度,y為OD值),回歸率R2= 0.9993。

    樣品多糖含量測定:向提取的多糖溶液中加入95%乙醇,使含醇量達(dá)到80%,4℃靜置過夜,4000 r/min條件下離心20 min得粗多糖,加入蒸餾水復(fù)溶,定容至1000 mL。苯酚硫酸法測定吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算發(fā)酵液中多糖濃度。

    1.3.3 蛋白質(zhì)含量測定[11]

    1)考馬斯亮藍(lán)G-250染液的配置:取50 mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于25 mL 95%乙醇中,待完全溶解后加入50 mL 85%磷酸,最后用蒸餾水定容至500 mL。

    2)考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密量取100 mg/L的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 mL,分別置于潔凈的具塞試管中,分別加入蒸餾水補充至1 mL,各試管中依次加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑,595 nm處比色,測定吸光值。測的考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=6.9463x+0.0054(x為蛋白濃度,y為OD值),回歸率R2=0.9997。

    3)樣品中蛋白質(zhì)含量測定:稱取1 g菌粉(菌粉用蒸餾水定容至100 mL)或100 mL發(fā)酵液,4000 r/min ,4℃離心20 min,破碎細(xì)胞,收集上清,沉淀相同條件重復(fù)浸提2次,合并濾液,定容至1000 mL,595 nm處比色,測定吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算發(fā)酵液中蛋白濃度。

    1.3.4 亮菌甲素含量的測定[13,14]

    1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密稱取10 mg亮菌甲素標(biāo)準(zhǔn)品置500 mL容量瓶中,以流動相為甲醇和0.1 mol/L乙酸(50∶ 50)溶解定容,超聲20 min后,用流動相梯度稀釋成濃度為0.125、0.25、0.5、1、2和4 mg/L的系列對照品溶液。分別進(jìn)樣16 μL,柱溫30℃,檢測波長為366 nm,測定峰面積積分值。在上述色譜條件下測定,測的亮菌甲素標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=112.57x+2978.8(x為亮菌甲素濃度,y為峰面積積分值),回歸率R2=0.9997。

    2)樣品中亮菌甲素含量的測定:為了進(jìn)一步的分析靜置發(fā)酵液中藥效成分亮菌甲素的含量,稱取經(jīng)勻漿機打散的靜置發(fā)酵的發(fā)酵液100 mL,超聲15 min,4000 r/min ,4℃離心20 min,收集上清,沉淀相同條件重復(fù)浸提2次,合并濾液,定容至1000 mL,取50 mL置分液漏斗中加無水乙醇10 mL,再加50 mL無水乙醚提取,收集有機相,水相繼續(xù)用50 mL無水乙醚提取2次,合并乙醚液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干,用流動相溶解定容至10 mL,進(jìn)樣16 μL,柱溫30℃,檢測波長為366 nm,測定峰面積積分值。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 發(fā)酵罐深層發(fā)酵

    經(jīng)發(fā)酵罐7 d避光培養(yǎng),測得此時的發(fā)酵液粘度為746 mPa·S(測定條件:25.0℃,1#轉(zhuǎn)子,6 r/min),此時發(fā)酵液中菌絲呈白色纖維糊狀,發(fā)酵液呈棕黃色。發(fā)酵液菌絲干重及菌粉中多糖和蛋白含量見表1。

    表1 發(fā)酵罐發(fā)酵液組分

    由表1可知,通過發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵方式所獲得的亮菌生物量平均能達(dá)到16.55 g/L,且周期短。但缺點是發(fā)酵液顏色不深,發(fā)酵程度低,無法像固體發(fā)酵那樣菌絲體表層分泌大量棕褐色液體,這可能是由于液體發(fā)酵環(huán)境無法為亮菌次級代謝產(chǎn)胞外棕褐色漿液創(chuàng)造適宜的環(huán)境。

    2.2 靜置培養(yǎng)發(fā)酵

    靜置發(fā)酵2周后,發(fā)酵液表面形成約5 mm厚的菌絲層,且菌絲分泌大量棕褐色液體,發(fā)酵液中菌索向下延伸粗壯且多分支布滿整個三角瓶,三角瓶中發(fā)酵液呈膠質(zhì)半固體形態(tài)。稱取經(jīng)勻漿機打散的發(fā)酵液100 mL,4000 r/min條件下離心20 min ,沉淀80℃烘干至恒重。發(fā)酵液組分各項指標(biāo)見表2。

    表 2 靜置培養(yǎng)發(fā)酵液組分

    通過表2可知,發(fā)酵液中多糖含量為9.5%,蛋白質(zhì)含量為3.0%。對比表1和表2,雖然靜置發(fā)酵得到的亮菌生物量不及發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵,但其發(fā)酵程度深,培養(yǎng)基利用率高,發(fā)酵液中多糖和蛋白含量明顯優(yōu)于液體深層發(fā)酵的發(fā)酵結(jié)果,同時也優(yōu)于傳統(tǒng)的固體發(fā)酵[11]。

    為了進(jìn)一步的探究靜置發(fā)酵生產(chǎn)工藝能否取代傳統(tǒng)的亮菌固體發(fā)酵生產(chǎn)工藝,本實驗室采用HPLC法檢測靜置發(fā)酵液中亮菌甲素的含量(見圖1和圖2),結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中亮菌甲素含量平均為3.118 mg/L。

    圖 1 亮菌甲素對照品HPLC色譜圖

    圖2 樣品HPLC色譜圖

    由圖1和圖2可以看出,亮菌甲素對照品和供試品中亮菌甲素的保留時間均在6.91 min左右,峰形較好。亮菌甲素屬于香豆素類衍生物,具有親脂性,易溶于乙醚,因此采用乙醚提取純化,結(jié)果顯示純化后的樣品中雜質(zhì)含量較少且對待測物峰無影響[4,14]。

    3 小結(jié)與討論

    1)通過14 L發(fā)酵罐進(jìn)行液體深層發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)盡管能夠?qū)崿F(xiàn)可觀的菌絲生物量和較短的發(fā)酵周期,但發(fā)酵液顏色不是很深,發(fā)酵程度低,發(fā)酵液制得的菌粉中多糖和蛋白含量均較低,無法形成像固體發(fā)酵菌絲體分泌大量棕褐色液體和粗壯多分枝菌索的現(xiàn)象,而能否大量分泌棕褐色液體是合肥誠志生物制藥有限公司在應(yīng)用傳統(tǒng)的固體發(fā)酵工藝生產(chǎn)亮菌口服液制劑中衡量亮菌發(fā)酵質(zhì)量的一項重要指標(biāo),因此本文所采用的發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵工藝尚需進(jìn)一步加以研究和探討。

    2)采用液體靜置發(fā)酵的方法,觀察發(fā)現(xiàn)所有三角瓶都能分泌大量棕褐色液體和形成粗壯多分支的菌索。該方法大大縮短了發(fā)酵周期,且發(fā)酵液質(zhì)量高,雜質(zhì)少,提取濃縮簡單易行,亮菌多糖等活性成分指標(biāo)均優(yōu)于傳統(tǒng)的固體發(fā)酵。

    綜合以上兩種發(fā)酵方法,液體靜置發(fā)酵法結(jié)合了傳統(tǒng)固體發(fā)酵程度深和液體發(fā)酵周期短的雙重優(yōu)點,且在多項技術(shù)指標(biāo)及發(fā)酵成本方面均有優(yōu)越性。此外,靜置發(fā)酵法操作簡便,無需專門設(shè)備,是亮菌制劑工業(yè)生產(chǎn)工藝改進(jìn)與創(chuàng)新的首選。

    參考文獻(xiàn):

    [1]卯曉嵐.中國大型真菌[M].鄭州:河南科學(xué)技術(shù)出版社,2000,187.

    [2]凌慶枝,袁懷波,王妮娜,等.亮菌固態(tài)和液體發(fā)酵多糖及其醒酒作用研究[J].食品科學(xué),2008,29(5):324-326.

    [3]沈業(yè)壽,馬金寶.亮菌研究的現(xiàn)狀與展望[J].安徽大學(xué)學(xué)報,2007,31(1):82-86.

    [4]王 巖.香豆素類利膽藥物亮菌甲素的藥代動力學(xué)研究[D].長春,吉林大學(xué),2008.

    [5]Nagai K, Tanaka J, Kiho T, et al. Synthesis and antitumor activities of mitomycin C (1-3)-beta-D-glucan conjugate[J].Chem Pharm Bull(Tokyo), 1992, 40(4): 986-989.

    [6]趙戈清,羅 霞,劉高陽,等.亮菌多糖對S180荷瘤小鼠免疫功能的研究[J].免疫學(xué)雜志,2006,22(3):146-148.

    [7]Kiho T.Polysaccharides in fungi. XXIX. structural features of two antitumor polysaccharides from the fruiting bodies ofArmillariellatabescens[J].Chemical and Pharmaceutical Bulletin,1992,40(8):2212-2214.

    [8]高 婷,白家峰,羅 霞,等.亮菌粗多糖對小鼠免疫功能的影響[J].四川大學(xué)學(xué)報,2005,42(2):395-398.

    [9]敖宗華, 符慧子, 鄒錫良. 大規(guī)模液體深層發(fā)酵生產(chǎn)亮菌菌絲體菌粉及其多糖工藝[P]. CN: 1596585, 2005-03-23.

    [10]敖宗華,陸震鳴,孫軍恩,等.亮菌菌粉和亮菌糖漿品質(zhì)分析比較[J].生物技術(shù)通報,2008,4:188-190.

    [11]宋 淼,王 清,張書祥.假蜜環(huán)菌液體種子培養(yǎng)條件的優(yōu)化及其應(yīng)用研究[J].生物學(xué)雜志,2012,29(5):64-67.

    [12]董麗輝,范三微,黃貝貝.亮菌液體發(fā)酵多糖提取工藝研究[J].食品工業(yè),2012,33(10):4-6.

    [13]黃趙剛,李紹平,張 平,等.高效液相色譜法測定亮菌糖漿中亮菌甲素的含量[J].藥物分析雜志,2003, 23(3):229-231.

    [14]任惠霞,張 平,程 剛,等.高效液相色譜法測定亮菌水提液中亮菌甲素的含量[J].安徽醫(yī)藥,2012,16(6):759-760.

    猜你喜歡
    菌粉甲素發(fā)酵罐
    餐廚廢水和固渣厭氧發(fā)酵試驗研究
    冷凍干燥乳雙歧桿菌A04菌粉的貯藏活性研究
    發(fā)酵罐不銹鋼換熱盤管泄漏失效分析
    一株耐Cd羅爾斯通氏菌的分離、鑒定及其對Cd2+的吸附特性研究
    燈盞甲素在大鼠腦缺血再灌注損傷模型的PK-PD結(jié)合模型研究
    利用計算流體力學(xué)技術(shù)分析啤酒發(fā)酵罐構(gòu)型對溫度和流動的影響
    優(yōu)良益生菌高效篩選與應(yīng)用關(guān)鍵技術(shù)2014年度報告
    科技資訊(2016年7期)2016-05-14 14:38:11
    30L發(fā)酵罐培養(yǎng)枯草芽孢桿菌產(chǎn)高密度芽孢的研究
    分析漢防己甲素治療塵肺的療效及對免疫功能的影響
    連續(xù)4周口服雷公藤甲素對大鼠血紅素加氧酶的影響
    美女主播在线视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| a级毛片在线看网站| 男人添女人高潮全过程视频| 狂野欧美激情性bbbbbb| 国产男女内射视频| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲专区中文字幕在线| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲熟女精品中文字幕| 99国产综合亚洲精品| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲国产欧美网| 色婷婷av一区二区三区视频| 视频区欧美日本亚洲| 少妇粗大呻吟视频| 男女高潮啪啪啪动态图| av超薄肉色丝袜交足视频| 亚洲国产精品999| 成年av动漫网址| 亚洲欧美清纯卡通| 99九九在线精品视频| 欧美乱码精品一区二区三区| av电影中文网址| 午夜91福利影院| 一二三四在线观看免费中文在| 啦啦啦啦在线视频资源| 99久久人妻综合| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 深夜精品福利| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 18禁国产床啪视频网站| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 最新的欧美精品一区二区| 成人三级做爰电影| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产真人三级小视频在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 五月天丁香电影| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲人成77777在线视频| 99久久国产精品久久久| 99国产精品99久久久久| 在线观看人妻少妇| 69av精品久久久久久 | 老司机影院成人| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 国产高清国产精品国产三级| 飞空精品影院首页| 99精国产麻豆久久婷婷| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲欧美清纯卡通| 免费少妇av软件| 91av网站免费观看| svipshipincom国产片| 欧美日韩精品网址| 欧美黄色片欧美黄色片| 99热国产这里只有精品6| 丁香六月欧美| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲av电影在线进入| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 美女福利国产在线| 波多野结衣av一区二区av| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 蜜桃国产av成人99| 大陆偷拍与自拍| 性少妇av在线| 一本综合久久免费| av视频免费观看在线观看| 又大又爽又粗| 精品高清国产在线一区| 国产日韩欧美在线精品| 在线看a的网站| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美日韩精品网址| 国产91精品成人一区二区三区 | 青春草亚洲视频在线观看| 午夜两性在线视频| 女人久久www免费人成看片| 99热国产这里只有精品6| 亚洲国产欧美网| 一个人免费看片子| 久久久久国内视频| 国产免费视频播放在线视频| videos熟女内射| 狠狠狠狠99中文字幕| 大片电影免费在线观看免费| 亚洲欧美激情在线| 国产在线免费精品| 精品欧美一区二区三区在线| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 亚洲av男天堂| 五月天丁香电影| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 亚洲男人天堂网一区| 制服诱惑二区| 中文字幕精品免费在线观看视频| 欧美97在线视频| 午夜福利在线观看吧| 欧美久久黑人一区二区| 在线观看人妻少妇| 免费人妻精品一区二区三区视频| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 69av精品久久久久久 | 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 99久久国产精品久久久| 真人做人爱边吃奶动态| 久久精品国产a三级三级三级| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 91大片在线观看| 五月天丁香电影| 午夜视频精品福利| 久久久欧美国产精品| 久久免费观看电影| 高清在线国产一区| 一二三四在线观看免费中文在| 在线观看免费视频网站a站| 香蕉丝袜av| 久久性视频一级片| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 男男h啪啪无遮挡| 丁香六月天网| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 一区二区三区精品91| 窝窝影院91人妻| 丝袜喷水一区| 两性夫妻黄色片| 在线观看免费高清a一片| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产精品成人在线| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 午夜福利在线观看吧| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 欧美成人午夜精品| 国产av精品麻豆| 亚洲精品乱久久久久久| 妹子高潮喷水视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 久久国产精品人妻蜜桃| 丝袜喷水一区| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 美国免费a级毛片| 青春草视频在线免费观看| 18在线观看网站| 人人澡人人妻人| 久久精品国产a三级三级三级| 69av精品久久久久久 | 欧美日韩黄片免| 日韩视频一区二区在线观看| 国产高清videossex| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲精品久久午夜乱码| 精品视频人人做人人爽| 在线观看免费午夜福利视频| 国产精品免费视频内射| 最近中文字幕2019免费版| 黑人猛操日本美女一级片| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲精品自拍成人| 国产在视频线精品| 亚洲国产日韩一区二区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产亚洲欧美在线一区二区| 伦理电影免费视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美日韩av久久| 日本黄色日本黄色录像| www.熟女人妻精品国产| 新久久久久国产一级毛片| 久久精品成人免费网站| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产伦理片在线播放av一区| 91麻豆av在线| 丝瓜视频免费看黄片| 国产成人精品无人区| 免费在线观看日本一区| 他把我摸到了高潮在线观看 | 午夜91福利影院| 亚洲视频免费观看视频| 91麻豆av在线| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲天堂av无毛| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 两个人免费观看高清视频| 欧美日韩一级在线毛片| 午夜两性在线视频| 天天操日日干夜夜撸| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲成人免费av在线播放| 久久久久国内视频| 色老头精品视频在线观看| 91精品三级在线观看| 777米奇影视久久| 免费在线观看影片大全网站| 中国美女看黄片| 午夜91福利影院| 久久av网站| 欧美黄色淫秽网站| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 免费人妻精品一区二区三区视频| 下体分泌物呈黄色| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 丰满迷人的少妇在线观看| tube8黄色片| 亚洲美女黄色视频免费看| 我要看黄色一级片免费的| 免费在线观看完整版高清| 在线av久久热| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久久久久久久久久久大奶| av不卡在线播放| 在线天堂中文资源库| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲全国av大片| 丝袜人妻中文字幕| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 久久久久久久精品精品| 另类亚洲欧美激情| 日韩中文字幕视频在线看片| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 成人黄色视频免费在线看| 欧美激情久久久久久爽电影 | 色婷婷av一区二区三区视频| 欧美 日韩 精品 国产| 日韩人妻精品一区2区三区| 午夜91福利影院| 99精品欧美一区二区三区四区| 婷婷丁香在线五月| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲伊人久久精品综合| 中文字幕制服av| 色精品久久人妻99蜜桃| 成年人午夜在线观看视频| 90打野战视频偷拍视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 在线精品无人区一区二区三| 欧美大码av| 午夜影院在线不卡| 日韩大片免费观看网站| 国产在线一区二区三区精| 国产黄频视频在线观看| a级毛片黄视频| 天天添夜夜摸| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 热99久久久久精品小说推荐| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 啦啦啦免费观看视频1| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产一级毛片在线| 国产色视频综合| 黄色视频在线播放观看不卡| 男女免费视频国产| 亚洲欧美清纯卡通| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲色图综合在线观看| 在线精品无人区一区二区三| 亚洲情色 制服丝袜| 国产真人三级小视频在线观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 欧美 日韩 精品 国产| 日韩大码丰满熟妇| 九色亚洲精品在线播放| 国产成人精品无人区| 丰满少妇做爰视频| 午夜福利在线免费观看网站| 在线观看免费高清a一片| 高清视频免费观看一区二区| 两个人看的免费小视频| 免费在线观看完整版高清| 午夜成年电影在线免费观看| avwww免费| 夜夜夜夜夜久久久久| 黄色 视频免费看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 热99国产精品久久久久久7| 老司机影院毛片| 一级毛片精品| 国产欧美亚洲国产| 中文字幕av电影在线播放| 欧美激情 高清一区二区三区| 精品久久蜜臀av无| 老汉色∧v一级毛片| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 乱人伦中国视频| 视频区欧美日本亚洲| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲国产欧美一区二区综合| 正在播放国产对白刺激| 欧美日韩黄片免| 在线精品无人区一区二区三| 在线观看免费日韩欧美大片| 9色porny在线观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久av网站| 波多野结衣一区麻豆| netflix在线观看网站| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲五月婷婷丁香| 在线观看免费高清a一片| 精品一区二区三卡| 国产一区二区三区av在线| 91九色精品人成在线观看| 人妻 亚洲 视频| 一进一出抽搐动态| 咕卡用的链子| 欧美午夜高清在线| 一区二区av电影网| 水蜜桃什么品种好| 国产一区二区激情短视频 | 精品久久久精品久久久| 国产又爽黄色视频| 十八禁人妻一区二区| 国产成人啪精品午夜网站| 免费日韩欧美在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 一个人免费看片子| 国产亚洲精品久久久久5区| 黄色片一级片一级黄色片| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 亚洲中文av在线| 久久久国产一区二区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 狠狠狠狠99中文字幕| 免费在线观看日本一区| 日韩视频在线欧美| 国产欧美日韩一区二区精品| 老司机深夜福利视频在线观看 | 黄色毛片三级朝国网站| 女人久久www免费人成看片| 丁香六月欧美| 一个人免费在线观看的高清视频 | 精品人妻熟女毛片av久久网站| 久久久久久久久免费视频了| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 制服人妻中文乱码| www.999成人在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 成年人免费黄色播放视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 黄色a级毛片大全视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 亚洲情色 制服丝袜| 人妻一区二区av| 精品一区二区三区av网在线观看 | 黄频高清免费视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 永久免费av网站大全| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 国产福利在线免费观看视频| a 毛片基地| 亚洲精华国产精华精| 狂野欧美激情性bbbbbb| 91国产中文字幕| 婷婷色av中文字幕| 99久久国产精品久久久| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 各种免费的搞黄视频| 免费少妇av软件| 女警被强在线播放| 亚洲精品第二区| 女性生殖器流出的白浆| 在线av久久热| 久久国产精品影院| 国产成人精品在线电影| 亚洲综合色网址| 少妇粗大呻吟视频| a级毛片在线看网站| 搡老熟女国产l中国老女人| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 少妇的丰满在线观看| 少妇粗大呻吟视频| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 黄片小视频在线播放| 777米奇影视久久| 久久人人97超碰香蕉20202| 18在线观看网站| 99国产精品一区二区三区| 国产在线免费精品| 久久久久精品国产欧美久久久 | 亚洲精华国产精华精| 美国免费a级毛片| 五月开心婷婷网| 欧美精品av麻豆av| 久久亚洲精品不卡| 国产成人欧美在线观看 | 欧美日韩精品网址| 丝袜人妻中文字幕| 久久久久网色| 91成年电影在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 欧美性长视频在线观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| www.熟女人妻精品国产| 免费黄频网站在线观看国产| 操美女的视频在线观看| 99国产极品粉嫩在线观看| 最黄视频免费看| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲熟女毛片儿| 91成年电影在线观看| 高清av免费在线| 91字幕亚洲| 亚洲精品美女久久av网站| 99久久精品国产亚洲精品| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 精品少妇黑人巨大在线播放| 两人在一起打扑克的视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产精品久久久久成人av| 国产精品一区二区在线观看99| 午夜免费鲁丝| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 午夜久久久在线观看| 天天影视国产精品| 热99re8久久精品国产| 国产视频一区二区在线看| 国产免费福利视频在线观看| 色播在线永久视频| 国产三级黄色录像| 色视频在线一区二区三区| 新久久久久国产一级毛片| 国产黄色免费在线视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲,欧美精品.| 各种免费的搞黄视频| 欧美成人午夜精品| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 日韩一区二区三区影片| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲综合色网址| videos熟女内射| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲精品在线美女| 精品免费久久久久久久清纯 | 欧美黄色淫秽网站| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲性夜色夜夜综合| 黄片播放在线免费| 欧美97在线视频| 亚洲国产av影院在线观看| 亚洲精品第二区| 在线看a的网站| 一本大道久久a久久精品| 日韩视频一区二区在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久久水蜜桃国产精品网| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲,欧美精品.| 91大片在线观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 午夜日韩欧美国产| 亚洲国产欧美一区二区综合| 少妇粗大呻吟视频| 欧美一级毛片孕妇| 欧美黑人欧美精品刺激| 一本久久精品| 丝袜人妻中文字幕| 久久精品国产a三级三级三级| 2018国产大陆天天弄谢| 高清视频免费观看一区二区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久久久久久久久久久大奶| 久久久久久人人人人人| 久久久久视频综合| 亚洲av美国av| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲国产欧美一区二区综合| 纯流量卡能插随身wifi吗| 少妇的丰满在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 99久久99久久久精品蜜桃| 电影成人av| 美女视频免费永久观看网站| 中文字幕色久视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 中文字幕制服av| 人妻久久中文字幕网| 亚洲av美国av| 高清欧美精品videossex| 超色免费av| 精品人妻1区二区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产在线观看jvid| 婷婷丁香在线五月| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久人人97超碰香蕉20202| 日本vs欧美在线观看视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 视频区图区小说| 成年av动漫网址| 99香蕉大伊视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 中国美女看黄片| 欧美精品亚洲一区二区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 人成视频在线观看免费观看| av不卡在线播放| 欧美在线一区亚洲| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 免费看十八禁软件| 性色av一级| 美女主播在线视频| 自线自在国产av| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| videos熟女内射| 国产男人的电影天堂91| 午夜福利乱码中文字幕| 亚洲精品国产色婷婷电影| 精品乱码久久久久久99久播| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 国产一区二区三区综合在线观看| 亚洲成人手机| 亚洲av国产av综合av卡| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 青春草亚洲视频在线观看| 亚洲九九香蕉| 欧美日韩黄片免| 精品欧美一区二区三区在线| 成年人免费黄色播放视频| 久久久久网色| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 午夜免费观看性视频| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲精品自拍成人| 男女午夜视频在线观看| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 少妇粗大呻吟视频| 午夜成年电影在线免费观看| 一个人免费在线观看的高清视频 | 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 韩国高清视频一区二区三区| 中文字幕色久视频| 午夜福利,免费看| 美女福利国产在线| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 在线永久观看黄色视频| 国产成人啪精品午夜网站| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产男人的电影天堂91| 少妇被粗大的猛进出69影院| 成人影院久久| 老汉色av国产亚洲站长工具| 精品卡一卡二卡四卡免费| 天堂中文最新版在线下载| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产黄频视频在线观看| 18禁观看日本| 亚洲成国产人片在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| av一本久久久久| 十八禁网站免费在线| 久久精品国产综合久久久| 亚洲av日韩在线播放| 欧美日韩精品网址| 久久99一区二区三区| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲国产欧美一区二区综合| 婷婷成人精品国产| 操美女的视频在线观看| 在线观看免费视频网站a站| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美在线一区亚洲| 日本五十路高清| 天堂8中文在线网| 母亲3免费完整高清在线观看| 男女午夜视频在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人 | 他把我摸到了高潮在线观看 | 精品一品国产午夜福利视频| 久久精品国产综合久久久| 成人黄色视频免费在线看| av视频免费观看在线观看| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产国语露脸激情在线看| 欧美黄色片欧美黄色片| 下体分泌物呈黄色| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 侵犯人妻中文字幕一二三四区|