• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    假蜜環(huán)菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化研究

    2014-03-25 07:14:58徐來清張書祥
    生物學(xué)雜志 2014年3期
    關(guān)鍵詞:菌粉甲素發(fā)酵罐

    徐來清, 張書祥

    (安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,安徽 合肥 230601)

    假蜜環(huán)菌 [Armillariellatabescens(Scop.ex Fr.)Sing]是層菌綱口蘑科假蜜環(huán)菌屬真菌,因菌絲體在暗處發(fā)出熒光,故稱為亮菌。該菌具有治療肝炎、膽囊炎、腫瘤以及放療、化療引起的白細(xì)胞減少等藥效,且還具有強筋壯骨、疏風(fēng)活絡(luò)、明目、利肺、醒酒、益腸胃等保健功效[1-3]。現(xiàn)代研究表明,用乙醇、乙酸乙酯提取可得到亮菌甲素、亮菌乙素、亮菌丙素,而亮菌甲素主要用于急慢性肝炎、慢性淺表性胃炎和慢性膽囊炎急性發(fā)作等疾病的對癥治療[3,4]。另據(jù)報道,用水提或堿提法可提取得到亮菌雜多糖ATM3、AT-HW和AT-AC,而亮菌多糖是假蜜環(huán)菌生理生化活性的主要成分之一,具有抑制小鼠S180腫瘤的生長,提高機體免疫機能的功效[5-8]。

    目前, 國內(nèi)亮菌口服液或膠囊制劑多采用固體發(fā)酵工藝生產(chǎn),以廉價易得的玉米粉、紅薯粉等原料按一定比例混合配制固體培養(yǎng)基, 滅菌接種, 然后在室內(nèi)避光培養(yǎng)2個月左右。這種生產(chǎn)方式優(yōu)點是發(fā)酵程度深,有利于多種藥用有效成分的表達(dá)分泌,但明顯存在的問題是生產(chǎn)周期長,污染的概率大,且一旦染菌只能全部丟掉,浪費大。因此,固體發(fā)酵規(guī)模小、周期長、產(chǎn)量低的缺點嚴(yán)重制約了企業(yè)的產(chǎn)能和效益。

    本文在相關(guān)文獻(xiàn)報道的基礎(chǔ)上[9,10],針對合肥誠志生物制藥有限公司提供的假蜜環(huán)菌菌種,在本實驗室前期工作的基礎(chǔ)[11]上,進(jìn)行液體發(fā)酵罐深層發(fā)酵和靜置發(fā)酵兩種發(fā)酵方式的研究,探究其取代傳統(tǒng)固體發(fā)酵方式的可行性,為亮菌口服液的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種

    假蜜環(huán)菌[Armillariellatabescens(Scop.ex Fr.)Sing]菌種由合肥誠志生物制藥有限公司提供。

    1.1.2 培養(yǎng)基

    1)試管斜面培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基。

    2)液體培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯去皮,200;KH2PO4,2;MgSO4·7H2O,1。

    1.1.3 試劑

    亮菌甲素對照品(中國藥品生物制品檢定所);甲醇為色譜純,其余試劑均為分析純。

    1.1.4 主要儀器

    UV-5200 紫外分光光度計(上海元析儀器有限公司); SX-700壓力蒸汽滅菌鍋(TOMY);R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI);高效液相色譜儀(HITACHI D-2000 series);色譜柱:Agilent TC-C18(2) (4.6 mm × 250 mm,5 μm);檢測器:L-2420; PiloFD系列中試型凍干機(SIM),GF-1高速勻漿機(海門市麒麟醫(yī)用儀器廠);SNB-2數(shù)字粘度計(上海精科);BIOFLO-410型發(fā)酵罐(NBS)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 液體種子的制備[11]

    試管菌種經(jīng)活化,用接種鏟挑取試管表面菌絲體于盛有無菌水的250 mL三角瓶中,勻漿機打散,按10%接種量接種入250 mL 三角瓶內(nèi),28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)4 d。

    1.2.2 發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵

    待三角瓶內(nèi)形成菌絲球并均勻分散在培養(yǎng)基中時,將液體種子按5%接種量接種于14 L 發(fā)酵罐中。28 ℃,200 r/min,pH值5.5,通氣量1∶ 1 v/v·m,培養(yǎng)7 d,放罐。

    1.2.3 靜置發(fā)酵

    將液體種子按10%接種量接種于500 mL三角瓶中,先28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)4 d,然后避光靜置培養(yǎng)2個星期。用勻漿機將發(fā)酵液攪勻,準(zhǔn)確測定菌絲生物量及各活性成分含量。

    1.3 測定方法

    1.3.1 亮菌干重的測定

    取發(fā)酵罐的發(fā)酵液樣品共9份,每份100 mL,4000 r/min離心20 min,去上清,沉淀用蒸餾水沖洗,重復(fù)操作2次收集沉淀,取9份中的任意3份,80℃烘干至恒重,電子天平稱量菌絲體的干質(zhì)量。另外6份冷凍干燥制成亮菌菌粉,測定菌粉中多糖和蛋白含量。靜置發(fā)酵菌絲體生物量的測定與之相同。

    1.3.2 多糖含量測定[10,12]

    1)熱水浸提法提取亮菌粗多糖。發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵法:稱取制得的1 g菌粉,加入蒸餾水300 mL,80℃下水浴2.5 h,不斷攪動,防止黏壁。浸提完畢后冷卻至室溫,4000 r/min離心20 min,收集上清,沉淀在相同條件下重復(fù)浸提2次,合并濾液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(65℃)濃縮至原液的1/6,得亮菌粗多糖提取液。

    液體靜置法:取發(fā)酵完畢后的發(fā)酵液100 mL代替1 g菌粉,其余操作與發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵法完全相同。

    2)樣品多糖含量測定。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密量取0.1 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 mL分別置于潔凈的具塞試管中,分別加入蒸餾水補充至1 mL,依次加入6%的苯酚1 mL,再迅速加入濃硫酸5 mL,振蕩混勻10 min,冷卻至室溫靜置20 min,490 nm處比色,測定吸光值。測的多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y= 11.41x+0.003(x為多糖濃度,y為OD值),回歸率R2= 0.9993。

    樣品多糖含量測定:向提取的多糖溶液中加入95%乙醇,使含醇量達(dá)到80%,4℃靜置過夜,4000 r/min條件下離心20 min得粗多糖,加入蒸餾水復(fù)溶,定容至1000 mL。苯酚硫酸法測定吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算發(fā)酵液中多糖濃度。

    1.3.3 蛋白質(zhì)含量測定[11]

    1)考馬斯亮藍(lán)G-250染液的配置:取50 mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于25 mL 95%乙醇中,待完全溶解后加入50 mL 85%磷酸,最后用蒸餾水定容至500 mL。

    2)考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密量取100 mg/L的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6和0.8 mL,分別置于潔凈的具塞試管中,分別加入蒸餾水補充至1 mL,各試管中依次加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑,595 nm處比色,測定吸光值。測的考馬斯亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=6.9463x+0.0054(x為蛋白濃度,y為OD值),回歸率R2=0.9997。

    3)樣品中蛋白質(zhì)含量測定:稱取1 g菌粉(菌粉用蒸餾水定容至100 mL)或100 mL發(fā)酵液,4000 r/min ,4℃離心20 min,破碎細(xì)胞,收集上清,沉淀相同條件重復(fù)浸提2次,合并濾液,定容至1000 mL,595 nm處比色,測定吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算發(fā)酵液中蛋白濃度。

    1.3.4 亮菌甲素含量的測定[13,14]

    1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密稱取10 mg亮菌甲素標(biāo)準(zhǔn)品置500 mL容量瓶中,以流動相為甲醇和0.1 mol/L乙酸(50∶ 50)溶解定容,超聲20 min后,用流動相梯度稀釋成濃度為0.125、0.25、0.5、1、2和4 mg/L的系列對照品溶液。分別進(jìn)樣16 μL,柱溫30℃,檢測波長為366 nm,測定峰面積積分值。在上述色譜條件下測定,測的亮菌甲素標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=112.57x+2978.8(x為亮菌甲素濃度,y為峰面積積分值),回歸率R2=0.9997。

    2)樣品中亮菌甲素含量的測定:為了進(jìn)一步的分析靜置發(fā)酵液中藥效成分亮菌甲素的含量,稱取經(jīng)勻漿機打散的靜置發(fā)酵的發(fā)酵液100 mL,超聲15 min,4000 r/min ,4℃離心20 min,收集上清,沉淀相同條件重復(fù)浸提2次,合并濾液,定容至1000 mL,取50 mL置分液漏斗中加無水乙醇10 mL,再加50 mL無水乙醚提取,收集有機相,水相繼續(xù)用50 mL無水乙醚提取2次,合并乙醚液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干,用流動相溶解定容至10 mL,進(jìn)樣16 μL,柱溫30℃,檢測波長為366 nm,測定峰面積積分值。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 發(fā)酵罐深層發(fā)酵

    經(jīng)發(fā)酵罐7 d避光培養(yǎng),測得此時的發(fā)酵液粘度為746 mPa·S(測定條件:25.0℃,1#轉(zhuǎn)子,6 r/min),此時發(fā)酵液中菌絲呈白色纖維糊狀,發(fā)酵液呈棕黃色。發(fā)酵液菌絲干重及菌粉中多糖和蛋白含量見表1。

    表1 發(fā)酵罐發(fā)酵液組分

    由表1可知,通過發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵方式所獲得的亮菌生物量平均能達(dá)到16.55 g/L,且周期短。但缺點是發(fā)酵液顏色不深,發(fā)酵程度低,無法像固體發(fā)酵那樣菌絲體表層分泌大量棕褐色液體,這可能是由于液體發(fā)酵環(huán)境無法為亮菌次級代謝產(chǎn)胞外棕褐色漿液創(chuàng)造適宜的環(huán)境。

    2.2 靜置培養(yǎng)發(fā)酵

    靜置發(fā)酵2周后,發(fā)酵液表面形成約5 mm厚的菌絲層,且菌絲分泌大量棕褐色液體,發(fā)酵液中菌索向下延伸粗壯且多分支布滿整個三角瓶,三角瓶中發(fā)酵液呈膠質(zhì)半固體形態(tài)。稱取經(jīng)勻漿機打散的發(fā)酵液100 mL,4000 r/min條件下離心20 min ,沉淀80℃烘干至恒重。發(fā)酵液組分各項指標(biāo)見表2。

    表 2 靜置培養(yǎng)發(fā)酵液組分

    通過表2可知,發(fā)酵液中多糖含量為9.5%,蛋白質(zhì)含量為3.0%。對比表1和表2,雖然靜置發(fā)酵得到的亮菌生物量不及發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵,但其發(fā)酵程度深,培養(yǎng)基利用率高,發(fā)酵液中多糖和蛋白含量明顯優(yōu)于液體深層發(fā)酵的發(fā)酵結(jié)果,同時也優(yōu)于傳統(tǒng)的固體發(fā)酵[11]。

    為了進(jìn)一步的探究靜置發(fā)酵生產(chǎn)工藝能否取代傳統(tǒng)的亮菌固體發(fā)酵生產(chǎn)工藝,本實驗室采用HPLC法檢測靜置發(fā)酵液中亮菌甲素的含量(見圖1和圖2),結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中亮菌甲素含量平均為3.118 mg/L。

    圖 1 亮菌甲素對照品HPLC色譜圖

    圖2 樣品HPLC色譜圖

    由圖1和圖2可以看出,亮菌甲素對照品和供試品中亮菌甲素的保留時間均在6.91 min左右,峰形較好。亮菌甲素屬于香豆素類衍生物,具有親脂性,易溶于乙醚,因此采用乙醚提取純化,結(jié)果顯示純化后的樣品中雜質(zhì)含量較少且對待測物峰無影響[4,14]。

    3 小結(jié)與討論

    1)通過14 L發(fā)酵罐進(jìn)行液體深層發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)盡管能夠?qū)崿F(xiàn)可觀的菌絲生物量和較短的發(fā)酵周期,但發(fā)酵液顏色不是很深,發(fā)酵程度低,發(fā)酵液制得的菌粉中多糖和蛋白含量均較低,無法形成像固體發(fā)酵菌絲體分泌大量棕褐色液體和粗壯多分枝菌索的現(xiàn)象,而能否大量分泌棕褐色液體是合肥誠志生物制藥有限公司在應(yīng)用傳統(tǒng)的固體發(fā)酵工藝生產(chǎn)亮菌口服液制劑中衡量亮菌發(fā)酵質(zhì)量的一項重要指標(biāo),因此本文所采用的發(fā)酵罐液體深層發(fā)酵工藝尚需進(jìn)一步加以研究和探討。

    2)采用液體靜置發(fā)酵的方法,觀察發(fā)現(xiàn)所有三角瓶都能分泌大量棕褐色液體和形成粗壯多分支的菌索。該方法大大縮短了發(fā)酵周期,且發(fā)酵液質(zhì)量高,雜質(zhì)少,提取濃縮簡單易行,亮菌多糖等活性成分指標(biāo)均優(yōu)于傳統(tǒng)的固體發(fā)酵。

    綜合以上兩種發(fā)酵方法,液體靜置發(fā)酵法結(jié)合了傳統(tǒng)固體發(fā)酵程度深和液體發(fā)酵周期短的雙重優(yōu)點,且在多項技術(shù)指標(biāo)及發(fā)酵成本方面均有優(yōu)越性。此外,靜置發(fā)酵法操作簡便,無需專門設(shè)備,是亮菌制劑工業(yè)生產(chǎn)工藝改進(jìn)與創(chuàng)新的首選。

    參考文獻(xiàn):

    [1]卯曉嵐.中國大型真菌[M].鄭州:河南科學(xué)技術(shù)出版社,2000,187.

    [2]凌慶枝,袁懷波,王妮娜,等.亮菌固態(tài)和液體發(fā)酵多糖及其醒酒作用研究[J].食品科學(xué),2008,29(5):324-326.

    [3]沈業(yè)壽,馬金寶.亮菌研究的現(xiàn)狀與展望[J].安徽大學(xué)學(xué)報,2007,31(1):82-86.

    [4]王 巖.香豆素類利膽藥物亮菌甲素的藥代動力學(xué)研究[D].長春,吉林大學(xué),2008.

    [5]Nagai K, Tanaka J, Kiho T, et al. Synthesis and antitumor activities of mitomycin C (1-3)-beta-D-glucan conjugate[J].Chem Pharm Bull(Tokyo), 1992, 40(4): 986-989.

    [6]趙戈清,羅 霞,劉高陽,等.亮菌多糖對S180荷瘤小鼠免疫功能的研究[J].免疫學(xué)雜志,2006,22(3):146-148.

    [7]Kiho T.Polysaccharides in fungi. XXIX. structural features of two antitumor polysaccharides from the fruiting bodies ofArmillariellatabescens[J].Chemical and Pharmaceutical Bulletin,1992,40(8):2212-2214.

    [8]高 婷,白家峰,羅 霞,等.亮菌粗多糖對小鼠免疫功能的影響[J].四川大學(xué)學(xué)報,2005,42(2):395-398.

    [9]敖宗華, 符慧子, 鄒錫良. 大規(guī)模液體深層發(fā)酵生產(chǎn)亮菌菌絲體菌粉及其多糖工藝[P]. CN: 1596585, 2005-03-23.

    [10]敖宗華,陸震鳴,孫軍恩,等.亮菌菌粉和亮菌糖漿品質(zhì)分析比較[J].生物技術(shù)通報,2008,4:188-190.

    [11]宋 淼,王 清,張書祥.假蜜環(huán)菌液體種子培養(yǎng)條件的優(yōu)化及其應(yīng)用研究[J].生物學(xué)雜志,2012,29(5):64-67.

    [12]董麗輝,范三微,黃貝貝.亮菌液體發(fā)酵多糖提取工藝研究[J].食品工業(yè),2012,33(10):4-6.

    [13]黃趙剛,李紹平,張 平,等.高效液相色譜法測定亮菌糖漿中亮菌甲素的含量[J].藥物分析雜志,2003, 23(3):229-231.

    [14]任惠霞,張 平,程 剛,等.高效液相色譜法測定亮菌水提液中亮菌甲素的含量[J].安徽醫(yī)藥,2012,16(6):759-760.

    猜你喜歡
    菌粉甲素發(fā)酵罐
    餐廚廢水和固渣厭氧發(fā)酵試驗研究
    冷凍干燥乳雙歧桿菌A04菌粉的貯藏活性研究
    發(fā)酵罐不銹鋼換熱盤管泄漏失效分析
    一株耐Cd羅爾斯通氏菌的分離、鑒定及其對Cd2+的吸附特性研究
    燈盞甲素在大鼠腦缺血再灌注損傷模型的PK-PD結(jié)合模型研究
    利用計算流體力學(xué)技術(shù)分析啤酒發(fā)酵罐構(gòu)型對溫度和流動的影響
    優(yōu)良益生菌高效篩選與應(yīng)用關(guān)鍵技術(shù)2014年度報告
    科技資訊(2016年7期)2016-05-14 14:38:11
    30L發(fā)酵罐培養(yǎng)枯草芽孢桿菌產(chǎn)高密度芽孢的研究
    分析漢防己甲素治療塵肺的療效及對免疫功能的影響
    連續(xù)4周口服雷公藤甲素對大鼠血紅素加氧酶的影響
    噜噜噜噜噜久久久久久91| 久久久久久久久大av| 少妇的逼好多水| 久久久久九九精品影院| 亚洲美女搞黄在线观看 | 看黄色毛片网站| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 免费人成视频x8x8入口观看| 国内精品久久久久久久电影| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 亚洲男人的天堂狠狠| 91在线观看av| 欧美又色又爽又黄视频| 哪里可以看免费的av片| 人妻少妇偷人精品九色| 国产色婷婷99| 亚洲成人久久性| 99久久中文字幕三级久久日本| 欧美激情在线99| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 99热这里只有是精品50| 悠悠久久av| 国产私拍福利视频在线观看| 性色avwww在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产黄片美女视频| 国产主播在线观看一区二区| 成人无遮挡网站| 亚洲不卡免费看| 看免费成人av毛片| 国产精品av视频在线免费观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 色视频www国产| 真人做人爱边吃奶动态| av天堂中文字幕网| 免费电影在线观看免费观看| 久久午夜亚洲精品久久| 精品国内亚洲2022精品成人| 永久网站在线| 成年女人永久免费观看视频| 成人性生交大片免费视频hd| 欧美高清成人免费视频www| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲精品国产成人久久av| 午夜爱爱视频在线播放| 在线观看舔阴道视频| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产精品女同一区二区软件 | 草草在线视频免费看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 精品久久久久久成人av| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲18禁久久av| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产大屁股一区二区在线视频| 看十八女毛片水多多多| av在线观看视频网站免费| 国产三级中文精品| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 成人无遮挡网站| 韩国av在线不卡| 麻豆一二三区av精品| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产一区二区在线av高清观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲天堂国产精品一区在线| 国产人妻一区二区三区在| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 搞女人的毛片| 精品一区二区免费观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国内精品久久久久精免费| 999久久久精品免费观看国产| 亚洲av免费在线观看| 春色校园在线视频观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 日本一二三区视频观看| 美女高潮的动态| 麻豆成人午夜福利视频| 五月伊人婷婷丁香| eeuss影院久久| 18禁在线播放成人免费| 亚洲图色成人| 两个人的视频大全免费| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲av二区三区四区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 天天躁日日操中文字幕| 精品国内亚洲2022精品成人| 美女大奶头视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲经典国产精华液单| 男女边吃奶边做爰视频| 91精品国产九色| 黄色配什么色好看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产中年淑女户外野战色| 久久久久久久久中文| 婷婷精品国产亚洲av在线| 亚洲性夜色夜夜综合| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产精品人妻久久久影院| 给我免费播放毛片高清在线观看| 91在线观看av| 少妇被粗大猛烈的视频| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲性久久影院| 国产精品无大码| 一区二区三区四区激情视频 | 久久久久国内视频| 波多野结衣巨乳人妻| av中文乱码字幕在线| 男女之事视频高清在线观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 两个人的视频大全免费| 99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲av成人精品一区久久| 日韩欧美 国产精品| 亚洲精品国产成人久久av| 成人鲁丝片一二三区免费| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产伦精品一区二区三区视频9| 毛片女人毛片| 精品久久久久久久久久免费视频| 看十八女毛片水多多多| 成人三级黄色视频| 日韩精品有码人妻一区| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 美女cb高潮喷水在线观看| 精品久久久久久成人av| 在线国产一区二区在线| 精品一区二区三区视频在线观看免费| avwww免费| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲天堂国产精品一区在线| 白带黄色成豆腐渣| 国产一区二区三区av在线 | 麻豆久久精品国产亚洲av| 日本 av在线| 国产伦人伦偷精品视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 精品久久久久久久久久免费视频| av福利片在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 18禁在线播放成人免费| 国内精品久久久久久久电影| 精品久久久噜噜| av.在线天堂| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 午夜亚洲福利在线播放| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产成人a区在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产高潮美女av| 一a级毛片在线观看| 国产一区二区激情短视频| 亚洲va在线va天堂va国产| 91精品国产九色| 18+在线观看网站| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 中亚洲国语对白在线视频| 久久久国产成人精品二区| 99久久精品一区二区三区| 免费av不卡在线播放| 亚洲乱码一区二区免费版| 综合色av麻豆| 真人一进一出gif抽搐免费| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产免费男女视频| av国产免费在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 91在线观看av| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 一级黄色大片毛片| 日日啪夜夜撸| 男女边吃奶边做爰视频| 精品人妻熟女av久视频| 成人欧美大片| 国产一级毛片七仙女欲春2| 一本精品99久久精品77| 久久久国产成人精品二区| 精品久久久久久久久久免费视频| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲电影在线观看av| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产高清有码在线观看视频| 五月玫瑰六月丁香| 狠狠狠狠99中文字幕| 久9热在线精品视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 少妇的逼水好多| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲无线在线观看| 午夜激情欧美在线| 欧美丝袜亚洲另类 | 身体一侧抽搐| 最新中文字幕久久久久| av在线天堂中文字幕| 国产淫片久久久久久久久| 成人亚洲精品av一区二区| 观看免费一级毛片| 精品福利观看| 亚洲自拍偷在线| 一个人免费在线观看电影| aaaaa片日本免费| 麻豆一二三区av精品| 国产精品久久久久久久电影| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 一区二区三区四区激情视频 | 国产av不卡久久| www.www免费av| 又爽又黄无遮挡网站| 国产伦一二天堂av在线观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国产 一区精品| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲欧美激情综合另类| 在线播放无遮挡| 久久人人精品亚洲av| 日本 欧美在线| 99久久成人亚洲精品观看| 国产高清不卡午夜福利| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲四区av| 国产综合懂色| 日本五十路高清| 九九热线精品视视频播放| x7x7x7水蜜桃| 国产精品亚洲美女久久久| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 97热精品久久久久久| 国产视频内射| 波多野结衣巨乳人妻| www.色视频.com| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 一级黄色大片毛片| 丝袜美腿在线中文| 色5月婷婷丁香| 88av欧美| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 少妇人妻一区二区三区视频| 很黄的视频免费| 国产熟女欧美一区二区| 久久亚洲真实| 日本熟妇午夜| 乱人视频在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 日日撸夜夜添| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 精品人妻1区二区| 男人和女人高潮做爰伦理| 不卡视频在线观看欧美| 舔av片在线| 国产在线精品亚洲第一网站| 香蕉av资源在线| 极品教师在线视频| 国产三级在线视频| 51国产日韩欧美| 99视频精品全部免费 在线| а√天堂www在线а√下载| 国产精品野战在线观看| 国产精品人妻久久久影院| 国产精品久久电影中文字幕| 精品人妻视频免费看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 欧美性感艳星| 看片在线看免费视频| 色吧在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 深夜a级毛片| 国产中年淑女户外野战色| 我的老师免费观看完整版| 一区二区三区免费毛片| 99久久九九国产精品国产免费| 国产精品精品国产色婷婷| 窝窝影院91人妻| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 99久国产av精品| 又粗又爽又猛毛片免费看| 午夜免费激情av| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 露出奶头的视频| 精品国内亚洲2022精品成人| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产精品一区二区免费欧美| 97超视频在线观看视频| 午夜久久久久精精品| 一区福利在线观看| 亚洲avbb在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲av二区三区四区| 亚洲国产欧美人成| 日韩欧美精品免费久久| АⅤ资源中文在线天堂| 99riav亚洲国产免费| 十八禁国产超污无遮挡网站| 成人av一区二区三区在线看| 国产精品久久久久久精品电影| 夜夜爽天天搞| 老女人水多毛片| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 欧美日韩综合久久久久久 | 一夜夜www| 性欧美人与动物交配| 97热精品久久久久久| 国内精品久久久久久久电影| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产 一区精品| 中国美女看黄片| 成人欧美大片| 日韩欧美国产一区二区入口| 我要搜黄色片| 联通29元200g的流量卡| 婷婷六月久久综合丁香| 欧美中文日本在线观看视频| 日本黄大片高清| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲最大成人中文| 国产精品久久久久久精品电影| 国产精华一区二区三区| 中文字幕av在线有码专区| 少妇丰满av| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 精品福利观看| 亚洲精品色激情综合| 乱系列少妇在线播放| 亚洲第一区二区三区不卡| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲国产精品合色在线| 男女视频在线观看网站免费| 欧美日韩综合久久久久久 | 伊人久久精品亚洲午夜| 一夜夜www| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产精品日韩av在线免费观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 成人美女网站在线观看视频| 国产黄a三级三级三级人| 国产高清三级在线| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国内精品久久久久精免费| 国产高清视频在线观看网站| 日韩一区二区视频免费看| 国产精品三级大全| 99久久精品一区二区三区| 男女边吃奶边做爰视频| 国产精品不卡视频一区二区| 国产黄色小视频在线观看| 日韩国内少妇激情av| 超碰av人人做人人爽久久| 韩国av一区二区三区四区| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲无线观看免费| av视频在线观看入口| 日本熟妇午夜| 亚洲精华国产精华精| av天堂中文字幕网| 亚洲最大成人手机在线| 1000部很黄的大片| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 此物有八面人人有两片| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美又色又爽又黄视频| 久久草成人影院| 少妇被粗大猛烈的视频| 黄色丝袜av网址大全| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 久久久久精品国产欧美久久久| 久久久久久伊人网av| 国产色爽女视频免费观看| 国产精品人妻久久久影院| 联通29元200g的流量卡| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 伦精品一区二区三区| 日本a在线网址| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 12—13女人毛片做爰片一| 久99久视频精品免费| 久久热精品热| 欧美3d第一页| 国产高清激情床上av| 级片在线观看| 九色成人免费人妻av| 日韩一区二区视频免费看| 九九热线精品视视频播放| 亚洲无线观看免费| 色播亚洲综合网| 国产精品98久久久久久宅男小说| 毛片女人毛片| 日韩欧美国产一区二区入口| 99久国产av精品| 久久亚洲精品不卡| 观看免费一级毛片| 国产精品日韩av在线免费观看| netflix在线观看网站| 俄罗斯特黄特色一大片| 伦理电影大哥的女人| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 在线免费十八禁| 亚洲精品在线观看二区| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费| or卡值多少钱| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲四区av| 久久精品人妻少妇| 性欧美人与动物交配| 成人国产麻豆网| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚洲熟妇熟女久久| 久久久久久久久久成人| 成人无遮挡网站| 国内精品美女久久久久久| 简卡轻食公司| 精品人妻视频免费看| 日本在线视频免费播放| 国产av不卡久久| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲七黄色美女视频| 在线a可以看的网站| 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲乱码一区二区免费版| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产精品一及| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲av一区综合| 伦理电影大哥的女人| 春色校园在线视频观看| 波多野结衣高清无吗| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 男人舔女人下体高潮全视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产三级中文精品| 在线免费十八禁| 亚洲第一区二区三区不卡| 嫁个100分男人电影在线观看| 麻豆成人av在线观看| 亚洲黑人精品在线| 99久久九九国产精品国产免费| 丰满乱子伦码专区| 淫妇啪啪啪对白视频| 一a级毛片在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产精品久久久久久av不卡| 老司机深夜福利视频在线观看| 天堂动漫精品| 99久国产av精品| 国产极品精品免费视频能看的| 国产精品亚洲美女久久久| 国产精品,欧美在线| 女人被狂操c到高潮| 亚洲av二区三区四区| 男女边吃奶边做爰视频| 国产av一区在线观看免费| 亚洲欧美日韩无卡精品| 99久久精品国产国产毛片| 色综合色国产| 床上黄色一级片| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 日本爱情动作片www.在线观看 | 成年版毛片免费区| 99九九线精品视频在线观看视频| 十八禁国产超污无遮挡网站| av国产免费在线观看| 禁无遮挡网站| 免费无遮挡裸体视频| 色哟哟·www| 日本三级黄在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 成年人黄色毛片网站| 老熟妇乱子伦视频在线观看| or卡值多少钱| 久久久精品大字幕| 国产老妇女一区| a级毛片免费高清观看在线播放| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产午夜福利久久久久久| 欧美在线一区亚洲| 国产精品不卡视频一区二区| 国产精品三级大全| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 欧美+亚洲+日韩+国产| 午夜老司机福利剧场| 国产精品乱码一区二三区的特点| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产成人a区在线观看| 一区福利在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 在线观看av片永久免费下载| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国语自产精品视频在线第100页| 舔av片在线| 国产精品人妻久久久久久| 听说在线观看完整版免费高清| 国产探花在线观看一区二区| 天堂√8在线中文| av黄色大香蕉| 国产高清激情床上av| 欧美中文日本在线观看视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 午夜老司机福利剧场| 日韩精品中文字幕看吧| 免费高清视频大片| 色尼玛亚洲综合影院| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 99精品久久久久人妻精品| 日韩中文字幕欧美一区二区| 男女视频在线观看网站免费| 国产探花极品一区二区| 亚洲无线在线观看| 少妇的逼水好多| 有码 亚洲区| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲第一电影网av| 无遮挡黄片免费观看| 在线免费观看不下载黄p国产 | 亚洲欧美日韩无卡精品| x7x7x7水蜜桃| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 国产精品久久久久久久电影| 桃红色精品国产亚洲av| 国产午夜福利久久久久久| 1024手机看黄色片| 身体一侧抽搐| 禁无遮挡网站| 1000部很黄的大片| 最近在线观看免费完整版| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产真实乱freesex| 悠悠久久av| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久久午夜欧美精品| aaaaa片日本免费| 国产三级中文精品| 一级av片app| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲av不卡在线观看| 草草在线视频免费看| 91在线观看av| 成年人黄色毛片网站| 欧美bdsm另类| 日韩欧美在线乱码| 免费观看的影片在线观看| www日本黄色视频网| 午夜视频国产福利| 俺也久久电影网| 搡老岳熟女国产| 国产探花在线观看一区二区| 欧美黑人巨大hd| 精品人妻1区二区| 精品一区二区三区av网在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久久久久九九精品二区国产| 高清在线国产一区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 999久久久精品免费观看国产| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲精品国产成人久久av| 日韩中文字幕欧美一区二区| 91麻豆av在线| 亚洲精品国产成人久久av| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲av不卡在线观看| 综合色av麻豆| 999久久久精品免费观看国产| 中文字幕免费在线视频6| 舔av片在线| av在线蜜桃| 直男gayav资源| 一个人免费在线观看电影| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产在视频线在精品| 69人妻影院| 一区二区三区激情视频| 久久草成人影院| 欧美性猛交黑人性爽| 成年女人看的毛片在线观看| 中文字幕免费在线视频6| 乱人视频在线观看| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 国产在视频线在精品| а√天堂www在线а√下载| 国产三级中文精品| 精品一区二区三区av网在线观看| 夜夜爽天天搞| 精品久久久久久,| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲欧美清纯卡通|