中緬樹鼩體重、血清瘦素和下丘腦神經(jīng)肽表達量的季節(jié)性變化

朱萬龍, 蔡金紅, 張 麟, 王政昆

(云南師范大學 生命科學學院，昆明 650500)

自然環(huán)境中，環(huán)境因子的季節(jié)性變化對動物的繁殖、生存和能量代謝等生理生態(tài)特征有著重要的影響[1]。由于氣候條件的變化，環(huán)境因素與生物相互作用，并共同影響著動物對能量的分配、獲取、處理及消耗[2]。在季節(jié)性變化中，面臨持續(xù)的環(huán)境變化時，生物有機體不斷的調整自身的生理生態(tài)特征，從而維持體重穩(wěn)態(tài)[3]。許多研究認為，季節(jié)變化影響著很多物種的體重和能量平衡[4, 5]。而有生物機體只有在能量的獲得和消耗之間保持平衡的情況下，才能夠維持正常的繁殖和生存，這種平衡依賴于能量攝入、消化過程以及能量分配之間的相互作用[6]。在寒冷的冬季，動物為了適應外界環(huán)境，維持自身體溫的恒定，會使產(chǎn)熱增加，從而增加能量消耗，最終使得能量攝入增加，所以，能量攝入的增加可能是由于動物對冬季寒冷環(huán)境產(chǎn)熱增加的適應性變化，從而維持體重平衡[7]。

瘦素是由白色脂肪細胞分泌的蛋白類激素[8]，通過血液循環(huán)作用于下丘腦，與下丘腦中的受體結合，可抑制攝食，促進產(chǎn)熱[9]。瘦素通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調控與機體能量穩(wěn)態(tài)平衡緊密的聯(lián)系在一起，可調節(jié)機體食物攝入和能量消耗[10]。在維持能量代謝活動中，下丘腦發(fā)揮著關鍵的作用，是能量平衡和代謝平衡的調控中樞[11]，下丘腦各個核團之間，各種神經(jīng)肽相互形成了調控網(wǎng)絡，這是能量平衡的基礎[12]。下丘腦神經(jīng)元會分泌一些神經(jīng)肽，這些神經(jīng)肽可分為兩類：1)促進食欲神經(jīng)肽：比如神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)、刺鼠相關蛋白(agouti related peptide，AgRP)，可刺激進食和抑制能量消耗。2)抑制食欲神經(jīng)肽：比如阿片促黑色素原(pro-opiomelanocortin，POMC)、可卡因-安他非明轉錄調節(jié)肽(cocaine and amphetamine regulated transcript peptide，CART)，可抑制食物攝入和刺激能量消耗[13]。其中NPY由36個氨基酸組成，是一種高度保守的多肽，是攝食最強的刺激因子，在1982年最早被分離出來[14]，廣泛分布于外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其生物學功能主要是參與調節(jié)動物的攝食行為、生物節(jié)律性、平滑肌的收縮、呼吸調節(jié)以及影響下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌活動[15]。POMC由267個氨基酸組成，是一種前體蛋白，是一類厭食的神經(jīng)肽，在動物的應急、攝食和能量代謝等的調節(jié)中起著非常重要的作用[16]。CART是在動物體內(nèi)廣泛分布的一種神經(jīng)肽類物質[17]，最初由Spiess等[18]在羊下丘腦的抽提物中分離出來，可抑制動物的攝食行為，降低體重，并受瘦素的調節(jié)[19]。動物下丘腦分泌的這些神經(jīng)肽通過調節(jié)食欲強弱和機體能量代謝活動來維持能量的平衡，NPY、POMC和CART基因的表達平衡說明了下丘腦體重調節(jié)平衡的正常狀態(tài)[20]。

中緬樹鼩(Tupaiabelangeri)屬攀鼩目(Scandentia)樹鼩科(Tupaiidae)，主要分布于南亞、東南亞，中國廣西南部、云南、四川西南、貴州西南部及海南島，為東洋界特有的小型哺乳動物，在國內(nèi)僅有中緬樹鼩一種，以現(xiàn)生樹鼩的分布特征來看，云貴高原及其附近的橫斷山地區(qū)可能構成了中緬樹鼩的分布北限[21]。之前的研究表明，中緬樹鼩的體重、產(chǎn)熱和能量收支具有季節(jié)性變化[22]，消化道也具有季節(jié)性變化[23]，但是對于血清瘦素和下丘腦神經(jīng)肽在能量代謝中的作用還沒有報道。本研究基于以上的結果，對不同季節(jié)中緬樹鼩的體重、體脂、血清瘦素和下丘腦神經(jīng)肽表達量進行測定，為進一步研究下丘腦神經(jīng)元在中緬樹鼩中的體重調節(jié)和能量穩(wěn)態(tài)調節(jié)奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

中緬樹鼩春(3月)夏(6月)秋(9月)冬(12月)季各8只(4♂，4♀)、9只(4♂，5♀)、8只(4♂，4♀)和8只(4♂，4♀)，動物捕回后適應3 d，之后處死動物，測定體重和體脂，制備血清，以測定其瘦素的含量，并取出下丘腦放于-80℃保存，用于RNA提取。激素于2012年11—12月在云南省昆明醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院進行測定；其它實驗均在云南師范大學生命科學學院實驗室進行。

1.2 體重和體脂測定

體重在動物處死后稱量，體脂含量采用丹麥福斯公司生產(chǎn)的SoxtecTM2043浸提裝置測定，將已去除內(nèi)臟等消化道器官的動物胴體置于60℃烘箱中干燥至恒重，取出來后稱量胴體總重，然后用小型粉碎機粉碎混勻后，稱取2 g左右的樣品測定脂肪含量。計算方法為：體脂含量(%)=總體脂重量(g)/胴體干重(g)×100%[3]。

1.3 血清瘦素含量測定

將動物處死后，取血，放于4 ℃靜置1 h，于4 ℃、4000 r/min離心30 min，吸取上層血清置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。血清瘦素含量采用瘦素放射免疫分析試劑盒(美國Linco公司生產(chǎn)) 測定。批內(nèi)差和批間差小于5 %。

1.4 下丘腦神經(jīng)肽表達量測定

1.4.1 RNA提取及純度鑒定

下丘腦總RNA的提取與純化按照RNApure高純總RNA快速抽提試劑盒(BioTeke Co.)提供方法進行。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度和完整性。RNA于-80℃保存。

1.4.2 cDNA第一鏈合成

cDNA第一鏈的合成以下丘腦總RNA為模板，oligo(dT)18為反轉錄引物，按照M-MLV Frist Strand Kit試劑盒(Invitrogen Co.)提供方法進行。按表1冰浴配制反應體系，反應完畢后，-20℃ 保存。

表1 cDNA第一鏈合成反應體系

1.4.3NPY、POMC和CART基因cDNA核心序列的擴增

根據(jù)表2所列引物，引物采用Tang[13]和Palou[24]報道的引物。以上述cDNA第一鏈為模板進行RT-PCR，擴增條件均為：95℃變性5 min，95 ℃ 30 s，54～56 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，共37個循環(huán)，72 ℃ 延伸10 min。擴增體系為25 μL：其中含有1 μL Template(10 ng/μL)， 2.5 μL 10×PCR Buffer，1 μL MgCl2(25 mmol/ L)，2 μL dNTP Mixture(10 mmol/L，pH值8.0)，1 μL Primer 01 (10 pmol/μL)， 1 μL Primer 02(10 pmol/μL)，0.5 μLTaqenzyme(4 U/μL，購自北京博邁德生物公司)，16 μL ddH2O。RT-PCR產(chǎn)物以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并送至昆明碩陽科技有限公司進行正反兩個方向的序列測定。

表2 擴增中緬樹鼩NPY、POMC、CART序列所用引物

1.4.4 實時熒光定量PCR(FQ-PCR)

采用ABI-7000TM實時熒光PCR儀擴增模板cDNA，并檢測熒光信號。按SYBR Green realmastermix Mix試劑盒說明配制FQ-PCR 反應體系如下(表3)。

表3 FQ-PCR反應體系

每個樣本基因進行3次FQ-PCR平行重復，后續(xù)數(shù)據(jù)處理均采用3個平行結果的平均值。內(nèi)參基因引物為：F：GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC；R：CATCTGCTGGAAGGTGGACA。擴增條件為94℃2 min；94℃15 s，60℃35 s，重復40個循環(huán)。

1.4.5 2-△△CT相對定量法

采用2-△△CT公式法定量計算目的基因的轉錄表達水平，用內(nèi)參基因作均一化處理，ΔΔCT=(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)處理組-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)對照組，目的基因的表達水平2-△△CT可反映出該樣本目的基因的初始模板量用內(nèi)參基因均一化處理后相對于對照樣本的表達倍數(shù) (差異)[13]，對于對照樣本，ΔΔCT=0，2-△△CT=1，對于處理組樣本來說，如果2-△△CT>1，說明該基因表達上調，如果2-△△CT<1，則說明該基因表達下調。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行相關統(tǒng)計處理，體重用單因素方差(One-way ANOVA)分析，體脂、血清以及下丘腦神經(jīng)肽表達量結果采用協(xié)方差(ANCOVA)分析，體重作為協(xié)變量，組間差異性用多組比較(Duncan)分析。雌雄中緬樹鼩的各指標差異均不顯著(P>0.05)，故兩者也可合并統(tǒng)計。均以平均值±標準誤表示(Mean±S.E.)，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 體重和體脂的季節(jié)性變化

不同季節(jié)間，中緬樹鼩體重差異極顯著(F=20.984，P<0.01)(圖1)；體脂差異極顯著(F=8.172，P<0.01)(圖2)，其中體重和體脂都是冬季最高，夏季最低。

圖1 中緬樹鼩體重的季節(jié)性變化

注：不同字母代表差異性顯著,下同。

圖2 中緬樹鼩體脂的季節(jié)性變化

2.2 血清瘦素濃度和下丘腦神經(jīng)肽表達量的季節(jié)性變化

中緬樹鼩不同季節(jié)的血清瘦素濃度分別為7.14 ng/mL±0.44 ng/mL、7.94 ng/mL±0.31 ng/mL、6.91 ng/mL±0.57 ng/mL、6.19 ng/mL±0.71 ng/mL，其中夏季顯著高于冬季(P<0.05)，而春秋季與夏冬季差異不顯著(圖3)。中緬樹鼩的體重和血清瘦素具有顯著的負相關(r=-0.540,P<0.01; 圖4)。

圖3 中緬樹鼩血清瘦素濃度的季節(jié)性變化

圖4 中緬樹鼩體重和血清瘦素濃度的關系圖

圖5 中緬樹鼩下丘腦NPY表達量的季節(jié)性變化

NPY：不同季節(jié)間，中緬樹鼩下丘腦神經(jīng)肽NPYmRNA表達量差異不顯著(F=2.147，P>0.05)(圖 5)。POMC: 不同季節(jié)間，中緬樹鼩下丘腦神經(jīng)肽POMCmRNA表達量差異顯著(F=7.433，P<0.05)，其中夏季顯著高于其他季節(jié)，冬季最低(圖 6)。CART: 不同季節(jié)間，中緬樹鼩下丘腦神經(jīng)肽CARTmRNA表達量差異不顯著(F=2.856，P>0.05)(圖 7)。

圖 6 中緬樹鼩下丘腦POMC表達量的季節(jié)性變化

圖7 中緬樹鼩下丘腦CART表達量的季節(jié)性變化

3 討論

面對外界環(huán)境的不斷變化，動物會出現(xiàn)生理生態(tài)特征的表型可塑性，從而使能量攝入與能量消耗之間存在一個動態(tài)平衡[1]。能量攝入與體重、消化等因素有關。如果要測定動物的營養(yǎng)狀態(tài)，體重則是一個重要因子，這也取決于能量攝入和能量消耗之間的平衡。許多小型哺乳動物在缺乏食物和冷脅迫的環(huán)境中，通過減少總能量需求來降低體重，從而適應環(huán)境[1]，如長爪沙鼠(Merionesunguiculatus)[3]、布氏田鼠等(Microusbrandti)[5]。而中緬樹鼩的體重變化特征與它們不同，隨著環(huán)境溫度的降低，體重不斷的增加，這與金黃倉鼠(Mesocricetusauratus)和潘帕斯鼠(Akodonazarze)等情況相似[25]。這很可能與中緬樹鼩的分布區(qū)有關，中緬樹鼩分布于熱帶亞熱帶及其高原地區(qū)，在冬季沒有冰雪覆蓋，食物資源相對比較充足。因此，可增加攝食量來滿足能量消耗的增加，從而導致體重增加。在寒冷環(huán)境中，小型哺乳動物會增加體內(nèi)的脂肪存儲來彌補能量的消耗[26]。研究表明長爪沙鼠在低溫條件下會增加體內(nèi)脂肪存儲，作為能量來源的補充[27]。中緬樹鼩體脂的變化與體重的變化相一致，均為冬季最高，夏季最低。這與中緬樹鼩的生活環(huán)境是密不可分的，祿勸地區(qū)屬滇中高原北部，北亞熱帶高原氣候，年平均溫度為15.6℃，冬季沒有冰雪覆蓋，食物資源充足，攝入量的增加使體重增加，從而導致體脂增加。

中緬樹鼩的血清瘦素濃度冬季最低，低濃度的瘦素可防止進一步消耗能量，從而維持能量的平衡。在寒冷的冬季，低溫誘導中緬樹鼩降低瘦素含量，形成饑餓信號，從而增加能量攝入，以補償寒冷環(huán)境下維持生存所需的能量。瘦素作為一種信號，通過血液循環(huán)作用于下丘腦[28]，低濃度瘦素可促進NPY的分泌[29]，從而食欲增強，攝入量增加，以滿足產(chǎn)熱的需要。此外，中緬樹鼩的體重和血清瘦素呈負相關，與冷馴化條件下體重和血清瘦素的相關關系相似，說明在冬季或者低溫條件下，低濃度的瘦素有利于增加能量攝入，從而增加體重[30]。下丘腦神經(jīng)元NPY、POMC和CART被認為在能量調節(jié)中有重要的作用[12]。下丘腦存在的NPY通路能增加食欲和攝食量，這與NPY神經(jīng)元廣泛分布的側支刺激食欲的反應有關。中緬樹鼩下丘腦神經(jīng)元NPY的表達量在夏季最低，冬季最高，春季和秋季變化不大，與體重和攝入量的變化趨勢一致。NPY基因表達量增加，則促進食欲的增加，從而導致攝入量增加，攝入量的增加最終使體重增加，以補償中緬樹鼩在冬季產(chǎn)熱增加。而POMC和CART有抑制食欲的作用，在夏季，POMC和CART基因的表達量相對增加，抑制了食欲，導致攝入量降低，以適應夏季炎熱的環(huán)境。

綜上所述，中緬樹鼩通過增加體重和體脂來適應冬季的寒冷環(huán)境，并表現(xiàn)出了季節(jié)性變化。在此過程中，瘦素作為信號，作用于下丘腦，通過控制神經(jīng)肽NPY、POMC、CART基因的表達量來調節(jié)中緬樹鼩能量穩(wěn)態(tài)。

參考文獻:

[1]Lovegrove B G. Seasonal thermoregulatory responses in mammals[J]. J Comp Physiol B, 2005, 175(4): 231-247.

[2]Corp N, Gorman M L, Speakman J R. Daily energy expenditure of free-living male wood mice in different habitats and seasons[J]. Functional Ecology, 1999, 13(5): 585-593.

[3]Li X S, Wang D H. Regulation of body weight and thermogenesis in seasonally acclimatized Brandt′s voles (Microtusbrandti) [J]. Horm Behav, 2005, 48(3): 321-328.

[4]Mutze G J, Green B, Newgrain K. Ater flux and energy use in wild house mice (Musdomesticus) and the impact of seasonal aridity on breeding and population levels[J]. Oecologia, 1991, 88: 529-538.

[5]Concannon P, Levac K, Rawson R. Seasonal changes in serum leptin, food intake, and body weight in photoentrained woodchucks[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2001, 281(3): 951-959.

[6]Ahima R S, Dushay J, Flier S N. Leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice[J]. J Clin Invest, 1997, 99(3): 391-395.

[7]Nagy K A, Gruchacz M J. Seasonal water and energy metabolism of the desert welling kangaroo rat (Dipodomysmerriami) [J]. Physiological Zoology, 1994, 67: 1461-1478.

[8]Zhang Y, Proenca R, Maffei M. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue[J]. Nature, 1994, 372(6505): 425-432.

[9]Fink B D, Herlein J A, Almind K. Mitochondrial proton leak in obesity-resistant and obesity-prone mice[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2007, 293(5): 1773-1780.

[10]Friedman J M, Halaas J L. Leptin and the regulation of body weight in mammals[J]. Nature, 1998, 395(6704): 763-770.

[11]Mercer R E, Chee M J, Colmers W F. The role of NPY in hypothalamic mediated food intake[J]. Front Neuroendocrinol, 2011, 32(4): 398-415.

[12]Schwartz M W, Woods S C, Porte D Jr. Central nervous system control of food intake[J]. Nature, 2000, 404(6778): 661-671.

[13]Tang G B, Cui J G, Wang D H, Role of hypoleptinemia during cold adaptation in Brandt′s voles (Lasiopodomysbrandtii) [J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2009, 297(5): 1293-1301.

[14]Tatemoto K， Neuropeptide Y. Complete amino acid sequence of the brainpeptide[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1982, 79(18): 5485-5489.

[15]Larhammar D. Evolution of neuropeptide Y, peptide YY and pancreatic polypeptide[J]. Regul Pept, 1996, 62(1): 1-11.

[16]Pritchard L E, Turnbull A V, White A. Pro-opiomelanocortin processing in the hypothalamus: impact on melanocortin signalling and obesity[J]. J Endocrinol, 2002, 172(3): 411-421.

[17]Kuhar M J, Yoho L L. CART peptide analysis by Western blotting[J]. Synapse, 1999, 33(3): 163-171.

[18]Spiess J, Villarreal J, Vale W. Isolation and sequence analysis of a somatostatin-like polypeptide from ovine hypothalamus[J]. Biochemistry, 1981, 20(7): 1982-1988.

[19]Kristensen P, Judge M E, Thim L. Hypothalamic CART is a new anorectic peptide regulated by leptin[J]. Nature, 1998, 393(6680): 72-76.

[20]Bouret S G, Draper S J, Simerly R B. Trophic action of leptin on hypothalamic neurons that regulate feeding[J]. Science, 2004, 304(5667): 108-110.

[21]Sloan Wilson D, Clark A B, Coleman K. Shyness and boldness in humans and other animals[J]. Trends Ecol Evol, 1994, 9(11): 442-446.

[22]Zhu W L, Zhang H, Wang Z K. Seasonal changes in body mass and thermogenesis in tree shrews (Tupaiabelangeri) the roles of photoperiod and cold[J]. Journal of Thermal Biology, 2012, 37:479-484.

[23]蔡金紅, 朱萬龍, 謝 靜, 等. 中緬樹鼩消化道長度和重量變化[J]. 動物學雜志, 2010, 45(1):140-144.

[24]Palou M, Sánchez J, Rodríguez A M. Induction of NPY/AgRP orexigenic peptide expression in rat hypothalamus is an early event in fasting: relationship with circulating leptin, insulin and glucose[J]. Cell Physiol Biochem, 2009, 23(1-3): 115-124.

[25]Nagy T R, Gower B A, Stetson M H. Endocrine correlates of seasonal body mass dynamics in the collared lemming[J]. Amer Zool, 1995, 35: 246-258.

[26]Puerta M L, Abelenda M. Cold acclimation in food-restricted rats[J]. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol, 1987, 87(1): 31-33.

[27]Liu H, Wang D H, Wang Z W. Energy requirements during reproduction in female Brandt′s volesMicrotusbrandti[J]. Journal of Mammalogy, 2003, 84(4): 1410-1416.

[28]Abelenda M, Ledesma A, Bial E. Leptin administration to cold acclimated rats reduce both food intake and brown adpose tissue thermogenesis[J]. J Therm Biol, 2003, 28: 525-530.

[29]Nieminen P, Hyvarinen H. Seasonality of leptin levels in the BAT of the common shrew (Sorexaraneus) [J]. Z Naturforsch C, 2000, 55(5/6): 455-460.

[30]Zhang L, Liu P F, Zhu W L, et al. Variations in thermal physiology and energetics of the tree shrew (Tupaiabelangeri) in response to cold acclimation[J]. Journal of Comparative Physiology, 2012, 182: 167-176.