• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    中緬樹鼩體重、血清瘦素和下丘腦神經(jīng)肽表達量的季節(jié)性變化

    2014-03-25 07:14:52朱萬龍蔡金紅王政昆
    生物學雜志 2014年3期
    關鍵詞:神經(jīng)肽體脂季節(jié)性

    朱萬龍, 蔡金紅, 張 麟, 王政昆

    (云南師范大學 生命科學學院,昆明 650500)

    自然環(huán)境中,環(huán)境因子的季節(jié)性變化對動物的繁殖、生存和能量代謝等生理生態(tài)特征有著重要的影響[1]。由于氣候條件的變化,環(huán)境因素與生物相互作用,并共同影響著動物對能量的分配、獲取、處理及消耗[2]。在季節(jié)性變化中,面臨持續(xù)的環(huán)境變化時,生物有機體不斷的調整自身的生理生態(tài)特征,從而維持體重穩(wěn)態(tài)[3]。許多研究認為,季節(jié)變化影響著很多物種的體重和能量平衡[4, 5]。而有生物機體只有在能量的獲得和消耗之間保持平衡的情況下,才能夠維持正常的繁殖和生存,這種平衡依賴于能量攝入、消化過程以及能量分配之間的相互作用[6]。在寒冷的冬季,動物為了適應外界環(huán)境,維持自身體溫的恒定,會使產(chǎn)熱增加,從而增加能量消耗,最終使得能量攝入增加,所以,能量攝入的增加可能是由于動物對冬季寒冷環(huán)境產(chǎn)熱增加的適應性變化,從而維持體重平衡[7]。

    瘦素是由白色脂肪細胞分泌的蛋白類激素[8],通過血液循環(huán)作用于下丘腦,與下丘腦中的受體結合,可抑制攝食,促進產(chǎn)熱[9]。瘦素通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調控與機體能量穩(wěn)態(tài)平衡緊密的聯(lián)系在一起,可調節(jié)機體食物攝入和能量消耗[10]。在維持能量代謝活動中,下丘腦發(fā)揮著關鍵的作用,是能量平衡和代謝平衡的調控中樞[11],下丘腦各個核團之間,各種神經(jīng)肽相互形成了調控網(wǎng)絡,這是能量平衡的基礎[12]。下丘腦神經(jīng)元會分泌一些神經(jīng)肽,這些神經(jīng)肽可分為兩類:1)促進食欲神經(jīng)肽:比如神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY)、刺鼠相關蛋白(agouti related peptide,AgRP),可刺激進食和抑制能量消耗。2)抑制食欲神經(jīng)肽:比如阿片促黑色素原(pro-opiomelanocortin,POMC)、可卡因-安他非明轉錄調節(jié)肽(cocaine and amphetamine regulated transcript peptide,CART),可抑制食物攝入和刺激能量消耗[13]。其中NPY由36個氨基酸組成,是一種高度保守的多肽,是攝食最強的刺激因子,在1982年最早被分離出來[14],廣泛分布于外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng),其生物學功能主要是參與調節(jié)動物的攝食行為、生物節(jié)律性、平滑肌的收縮、呼吸調節(jié)以及影響下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌活動[15]。POMC由267個氨基酸組成,是一種前體蛋白,是一類厭食的神經(jīng)肽,在動物的應急、攝食和能量代謝等的調節(jié)中起著非常重要的作用[16]。CART是在動物體內(nèi)廣泛分布的一種神經(jīng)肽類物質[17],最初由Spiess等[18]在羊下丘腦的抽提物中分離出來,可抑制動物的攝食行為,降低體重,并受瘦素的調節(jié)[19]。動物下丘腦分泌的這些神經(jīng)肽通過調節(jié)食欲強弱和機體能量代謝活動來維持能量的平衡,NPY、POMC和CART基因的表達平衡說明了下丘腦體重調節(jié)平衡的正常狀態(tài)[20]。

    中緬樹鼩(Tupaiabelangeri)屬攀鼩目(Scandentia)樹鼩科(Tupaiidae),主要分布于南亞、東南亞,中國廣西南部、云南、四川西南、貴州西南部及海南島,為東洋界特有的小型哺乳動物,在國內(nèi)僅有中緬樹鼩一種,以現(xiàn)生樹鼩的分布特征來看,云貴高原及其附近的橫斷山地區(qū)可能構成了中緬樹鼩的分布北限[21]。之前的研究表明,中緬樹鼩的體重、產(chǎn)熱和能量收支具有季節(jié)性變化[22],消化道也具有季節(jié)性變化[23],但是對于血清瘦素和下丘腦神經(jīng)肽在能量代謝中的作用還沒有報道。本研究基于以上的結果,對不同季節(jié)中緬樹鼩的體重、體脂、血清瘦素和下丘腦神經(jīng)肽表達量進行測定,為進一步研究下丘腦神經(jīng)元在中緬樹鼩中的體重調節(jié)和能量穩(wěn)態(tài)調節(jié)奠定了基礎。

    1 材料與方法

    1.1 樣本采集

    中緬樹鼩春(3月)夏(6月)秋(9月)冬(12月)季各8只(4♂,4♀)、9只(4♂,5♀)、8只(4♂,4♀)和8只(4♂,4♀),動物捕回后適應3 d,之后處死動物,測定體重和體脂,制備血清,以測定其瘦素的含量,并取出下丘腦放于-80℃保存,用于RNA提取。激素于2012年11—12月在云南省昆明醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院進行測定;其它實驗均在云南師范大學生命科學學院實驗室進行。

    1.2 體重和體脂測定

    體重在動物處死后稱量,體脂含量采用丹麥福斯公司生產(chǎn)的SoxtecTM2043浸提裝置測定,將已去除內(nèi)臟等消化道器官的動物胴體置于60℃烘箱中干燥至恒重,取出來后稱量胴體總重,然后用小型粉碎機粉碎混勻后,稱取2 g左右的樣品測定脂肪含量。計算方法為:體脂含量(%)=總體脂重量(g)/胴體干重(g)×100%[3]。

    1.3 血清瘦素含量測定

    將動物處死后,取血,放于4 ℃靜置1 h,于4 ℃、4000 r/min離心30 min,吸取上層血清置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。血清瘦素含量采用瘦素放射免疫分析試劑盒(美國Linco公司生產(chǎn)) 測定。批內(nèi)差和批間差小于5 %。

    1.4 下丘腦神經(jīng)肽表達量測定

    1.4.1 RNA提取及純度鑒定

    下丘腦總RNA的提取與純化按照RNApure高純總RNA快速抽提試劑盒(BioTeke Co.)提供方法進行。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度和完整性。RNA于-80℃保存。

    1.4.2 cDNA第一鏈合成

    cDNA第一鏈的合成以下丘腦總RNA為模板,oligo(dT)18為反轉錄引物,按照M-MLV Frist Strand Kit試劑盒(Invitrogen Co.)提供方法進行。按表1冰浴配制反應體系,反應完畢后,-20℃ 保存。

    表1 cDNA第一鏈合成反應體系

    1.4.3NPY、POMC和CART基因cDNA核心序列的擴增

    根據(jù)表2所列引物,引物采用Tang[13]和Palou[24]報道的引物。以上述cDNA第一鏈為模板進行RT-PCR,擴增條件均為:95℃變性5 min,95 ℃ 30 s,54~56 ℃ 1 min,72 ℃ 1.5 min,共37個循環(huán),72 ℃ 延伸10 min。擴增體系為25 μL:其中含有1 μL Template(10 ng/μL), 2.5 μL 10×PCR Buffer,1 μL MgCl2(25 mmol/ L),2 μL dNTP Mixture(10 mmol/L,pH值8.0),1 μL Primer 01 (10 pmol/μL), 1 μL Primer 02(10 pmol/μL),0.5 μLTaqenzyme(4 U/μL,購自北京博邁德生物公司),16 μL ddH2O。RT-PCR產(chǎn)物以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并送至昆明碩陽科技有限公司進行正反兩個方向的序列測定。

    表2 擴增中緬樹鼩NPY、POMC、CART序列所用引物

    1.4.4 實時熒光定量PCR(FQ-PCR)

    采用ABI-7000TM實時熒光PCR儀擴增模板cDNA,并檢測熒光信號。按SYBR Green realmastermix Mix試劑盒說明配制FQ-PCR 反應體系如下(表3)。

    表3 FQ-PCR反應體系

    每個樣本基因進行3次FQ-PCR平行重復,后續(xù)數(shù)據(jù)處理均采用3個平行結果的平均值。內(nèi)參基因引物為:F:GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC;R:CATCTGCTGGAAGGTGGACA。擴增條件為94℃2 min;94℃15 s,60℃35 s,重復40個循環(huán)。

    1.4.5 2-△△CT相對定量法

    采用2-△△CT公式法定量計算目的基因的轉錄表達水平,用內(nèi)參基因作均一化處理,ΔΔCT=(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)處理組-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)對照組,目的基因的表達水平2-△△CT可反映出該樣本目的基因的初始模板量用內(nèi)參基因均一化處理后相對于對照樣本的表達倍數(shù) (差異)[13],對于對照樣本,ΔΔCT=0,2-△△CT=1,對于處理組樣本來說,如果2-△△CT>1,說明該基因表達上調,如果2-△△CT<1,則說明該基因表達下調。

    1.5 數(shù)據(jù)處理

    利用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行相關統(tǒng)計處理,體重用單因素方差(One-way ANOVA)分析,體脂、血清以及下丘腦神經(jīng)肽表達量結果采用協(xié)方差(ANCOVA)分析,體重作為協(xié)變量,組間差異性用多組比較(Duncan)分析。雌雄中緬樹鼩的各指標差異均不顯著(P>0.05),故兩者也可合并統(tǒng)計。均以平均值±標準誤表示(Mean±S.E.),P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

    2 結果

    2.1 體重和體脂的季節(jié)性變化

    不同季節(jié)間,中緬樹鼩體重差異極顯著(F=20.984,P<0.01)(圖1);體脂差異極顯著(F=8.172,P<0.01)(圖2),其中體重和體脂都是冬季最高,夏季最低。

    圖1 中緬樹鼩體重的季節(jié)性變化

    注:不同字母代表差異性顯著,下同。

    圖2 中緬樹鼩體脂的季節(jié)性變化

    2.2 血清瘦素濃度和下丘腦神經(jīng)肽表達量的季節(jié)性變化

    中緬樹鼩不同季節(jié)的血清瘦素濃度分別為7.14 ng/mL±0.44 ng/mL、7.94 ng/mL±0.31 ng/mL、6.91 ng/mL±0.57 ng/mL、6.19 ng/mL±0.71 ng/mL,其中夏季顯著高于冬季(P<0.05),而春秋季與夏冬季差異不顯著(圖3)。中緬樹鼩的體重和血清瘦素具有顯著的負相關(r=-0.540,P<0.01; 圖4)。

    圖3 中緬樹鼩血清瘦素濃度的季節(jié)性變化

    圖4 中緬樹鼩體重和血清瘦素濃度的關系圖

    圖5 中緬樹鼩下丘腦NPY表達量的季節(jié)性變化

    NPY:不同季節(jié)間,中緬樹鼩下丘腦神經(jīng)肽NPYmRNA表達量差異不顯著(F=2.147,P>0.05)(圖 5)。POMC: 不同季節(jié)間,中緬樹鼩下丘腦神經(jīng)肽POMCmRNA表達量差異顯著(F=7.433,P<0.05),其中夏季顯著高于其他季節(jié),冬季最低(圖 6)。CART: 不同季節(jié)間,中緬樹鼩下丘腦神經(jīng)肽CARTmRNA表達量差異不顯著(F=2.856,P>0.05)(圖 7)。

    圖 6 中緬樹鼩下丘腦POMC表達量的季節(jié)性變化

    圖7 中緬樹鼩下丘腦CART表達量的季節(jié)性變化

    3 討論

    面對外界環(huán)境的不斷變化,動物會出現(xiàn)生理生態(tài)特征的表型可塑性,從而使能量攝入與能量消耗之間存在一個動態(tài)平衡[1]。能量攝入與體重、消化等因素有關。如果要測定動物的營養(yǎng)狀態(tài),體重則是一個重要因子,這也取決于能量攝入和能量消耗之間的平衡。許多小型哺乳動物在缺乏食物和冷脅迫的環(huán)境中,通過減少總能量需求來降低體重,從而適應環(huán)境[1],如長爪沙鼠(Merionesunguiculatus)[3]、布氏田鼠等(Microusbrandti)[5]。而中緬樹鼩的體重變化特征與它們不同,隨著環(huán)境溫度的降低,體重不斷的增加,這與金黃倉鼠(Mesocricetusauratus)和潘帕斯鼠(Akodonazarze)等情況相似[25]。這很可能與中緬樹鼩的分布區(qū)有關,中緬樹鼩分布于熱帶亞熱帶及其高原地區(qū),在冬季沒有冰雪覆蓋,食物資源相對比較充足。因此,可增加攝食量來滿足能量消耗的增加,從而導致體重增加。在寒冷環(huán)境中,小型哺乳動物會增加體內(nèi)的脂肪存儲來彌補能量的消耗[26]。研究表明長爪沙鼠在低溫條件下會增加體內(nèi)脂肪存儲,作為能量來源的補充[27]。中緬樹鼩體脂的變化與體重的變化相一致,均為冬季最高,夏季最低。這與中緬樹鼩的生活環(huán)境是密不可分的,祿勸地區(qū)屬滇中高原北部,北亞熱帶高原氣候,年平均溫度為15.6℃,冬季沒有冰雪覆蓋,食物資源充足,攝入量的增加使體重增加,從而導致體脂增加。

    中緬樹鼩的血清瘦素濃度冬季最低,低濃度的瘦素可防止進一步消耗能量,從而維持能量的平衡。在寒冷的冬季,低溫誘導中緬樹鼩降低瘦素含量,形成饑餓信號,從而增加能量攝入,以補償寒冷環(huán)境下維持生存所需的能量。瘦素作為一種信號,通過血液循環(huán)作用于下丘腦[28],低濃度瘦素可促進NPY的分泌[29],從而食欲增強,攝入量增加,以滿足產(chǎn)熱的需要。此外,中緬樹鼩的體重和血清瘦素呈負相關,與冷馴化條件下體重和血清瘦素的相關關系相似,說明在冬季或者低溫條件下,低濃度的瘦素有利于增加能量攝入,從而增加體重[30]。下丘腦神經(jīng)元NPY、POMC和CART被認為在能量調節(jié)中有重要的作用[12]。下丘腦存在的NPY通路能增加食欲和攝食量,這與NPY神經(jīng)元廣泛分布的側支刺激食欲的反應有關。中緬樹鼩下丘腦神經(jīng)元NPY的表達量在夏季最低,冬季最高,春季和秋季變化不大,與體重和攝入量的變化趨勢一致。NPY基因表達量增加,則促進食欲的增加,從而導致攝入量增加,攝入量的增加最終使體重增加,以補償中緬樹鼩在冬季產(chǎn)熱增加。而POMC和CART有抑制食欲的作用,在夏季,POMC和CART基因的表達量相對增加,抑制了食欲,導致攝入量降低,以適應夏季炎熱的環(huán)境。

    綜上所述,中緬樹鼩通過增加體重和體脂來適應冬季的寒冷環(huán)境,并表現(xiàn)出了季節(jié)性變化。在此過程中,瘦素作為信號,作用于下丘腦,通過控制神經(jīng)肽NPY、POMC、CART基因的表達量來調節(jié)中緬樹鼩能量穩(wěn)態(tài)。

    參考文獻:

    [1]Lovegrove B G. Seasonal thermoregulatory responses in mammals[J]. J Comp Physiol B, 2005, 175(4): 231-247.

    [2]Corp N, Gorman M L, Speakman J R. Daily energy expenditure of free-living male wood mice in different habitats and seasons[J]. Functional Ecology, 1999, 13(5): 585-593.

    [3]Li X S, Wang D H. Regulation of body weight and thermogenesis in seasonally acclimatized Brandt′s voles (Microtusbrandti) [J]. Horm Behav, 2005, 48(3): 321-328.

    [4]Mutze G J, Green B, Newgrain K. Ater flux and energy use in wild house mice (Musdomesticus) and the impact of seasonal aridity on breeding and population levels[J]. Oecologia, 1991, 88: 529-538.

    [5]Concannon P, Levac K, Rawson R. Seasonal changes in serum leptin, food intake, and body weight in photoentrained woodchucks[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2001, 281(3): 951-959.

    [6]Ahima R S, Dushay J, Flier S N. Leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice[J]. J Clin Invest, 1997, 99(3): 391-395.

    [7]Nagy K A, Gruchacz M J. Seasonal water and energy metabolism of the desert welling kangaroo rat (Dipodomysmerriami) [J]. Physiological Zoology, 1994, 67: 1461-1478.

    [8]Zhang Y, Proenca R, Maffei M. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue[J]. Nature, 1994, 372(6505): 425-432.

    [9]Fink B D, Herlein J A, Almind K. Mitochondrial proton leak in obesity-resistant and obesity-prone mice[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2007, 293(5): 1773-1780.

    [10]Friedman J M, Halaas J L. Leptin and the regulation of body weight in mammals[J]. Nature, 1998, 395(6704): 763-770.

    [11]Mercer R E, Chee M J, Colmers W F. The role of NPY in hypothalamic mediated food intake[J]. Front Neuroendocrinol, 2011, 32(4): 398-415.

    [12]Schwartz M W, Woods S C, Porte D Jr. Central nervous system control of food intake[J]. Nature, 2000, 404(6778): 661-671.

    [13]Tang G B, Cui J G, Wang D H, Role of hypoleptinemia during cold adaptation in Brandt′s voles (Lasiopodomysbrandtii) [J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2009, 297(5): 1293-1301.

    [14]Tatemoto K, Neuropeptide Y. Complete amino acid sequence of the brainpeptide[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1982, 79(18): 5485-5489.

    [15]Larhammar D. Evolution of neuropeptide Y, peptide YY and pancreatic polypeptide[J]. Regul Pept, 1996, 62(1): 1-11.

    [16]Pritchard L E, Turnbull A V, White A. Pro-opiomelanocortin processing in the hypothalamus: impact on melanocortin signalling and obesity[J]. J Endocrinol, 2002, 172(3): 411-421.

    [17]Kuhar M J, Yoho L L. CART peptide analysis by Western blotting[J]. Synapse, 1999, 33(3): 163-171.

    [18]Spiess J, Villarreal J, Vale W. Isolation and sequence analysis of a somatostatin-like polypeptide from ovine hypothalamus[J]. Biochemistry, 1981, 20(7): 1982-1988.

    [19]Kristensen P, Judge M E, Thim L. Hypothalamic CART is a new anorectic peptide regulated by leptin[J]. Nature, 1998, 393(6680): 72-76.

    [20]Bouret S G, Draper S J, Simerly R B. Trophic action of leptin on hypothalamic neurons that regulate feeding[J]. Science, 2004, 304(5667): 108-110.

    [21]Sloan Wilson D, Clark A B, Coleman K. Shyness and boldness in humans and other animals[J]. Trends Ecol Evol, 1994, 9(11): 442-446.

    [22]Zhu W L, Zhang H, Wang Z K. Seasonal changes in body mass and thermogenesis in tree shrews (Tupaiabelangeri) the roles of photoperiod and cold[J]. Journal of Thermal Biology, 2012, 37:479-484.

    [23]蔡金紅, 朱萬龍, 謝 靜, 等. 中緬樹鼩消化道長度和重量變化[J]. 動物學雜志, 2010, 45(1):140-144.

    [24]Palou M, Sánchez J, Rodríguez A M. Induction of NPY/AgRP orexigenic peptide expression in rat hypothalamus is an early event in fasting: relationship with circulating leptin, insulin and glucose[J]. Cell Physiol Biochem, 2009, 23(1-3): 115-124.

    [25]Nagy T R, Gower B A, Stetson M H. Endocrine correlates of seasonal body mass dynamics in the collared lemming[J]. Amer Zool, 1995, 35: 246-258.

    [26]Puerta M L, Abelenda M. Cold acclimation in food-restricted rats[J]. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol, 1987, 87(1): 31-33.

    [27]Liu H, Wang D H, Wang Z W. Energy requirements during reproduction in female Brandt′s volesMicrotusbrandti[J]. Journal of Mammalogy, 2003, 84(4): 1410-1416.

    [28]Abelenda M, Ledesma A, Bial E. Leptin administration to cold acclimated rats reduce both food intake and brown adpose tissue thermogenesis[J]. J Therm Biol, 2003, 28: 525-530.

    [29]Nieminen P, Hyvarinen H. Seasonality of leptin levels in the BAT of the common shrew (Sorexaraneus) [J]. Z Naturforsch C, 2000, 55(5/6): 455-460.

    [30]Zhang L, Liu P F, Zhu W L, et al. Variations in thermal physiology and energetics of the tree shrew (Tupaiabelangeri) in response to cold acclimation[J]. Journal of Comparative Physiology, 2012, 182: 167-176.

    猜你喜歡
    神經(jīng)肽體脂季節(jié)性
    神經(jīng)肽Y在心血管疾病中的研究進展
    棘皮動物神經(jīng)肽結構與功能研究進展
    海洋科學(2021年6期)2021-08-02 06:32:40
    粕類季節(jié)性規(guī)律:豆粕篇
    湖南飼料(2021年3期)2021-07-28 07:05:58
    季節(jié)性需求放緩 鉀肥價格下行
    蔬菜價格呈季節(jié)性回落
    從顏值到實用性華為智能體脂秤VS小米體脂秤
    遠離季節(jié)性過敏
    Coco薇(2017年12期)2018-01-03 21:34:42
    基于質譜技術的神經(jīng)肽研究進展
    血漿神經(jīng)肽Y水平與原發(fā)性高血壓靶器官損害的相關性
    記錄體重也許斑斕
    世界博覽(2016年6期)2016-04-26 15:55:29
    国产1区2区3区精品| 99国产精品一区二区蜜桃av| 嫩草影视91久久| 国语自产精品视频在线第100页| 欧美不卡视频在线免费观看 | 婷婷精品国产亚洲av在线| 美女免费视频网站| 久久人人精品亚洲av| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 极品教师在线免费播放| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲av五月六月丁香网| 波多野结衣高清无吗| 免费高清视频大片| 国产伦人伦偷精品视频| 日韩欧美免费精品| 亚洲国产精品999在线| 午夜福利18| 久久久国产精品麻豆| 后天国语完整版免费观看| 精品第一国产精品| 亚洲精品国产区一区二| 久久中文看片网| a级毛片在线看网站| 91麻豆av在线| 国产精品一区二区精品视频观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 大型av网站在线播放| 欧美丝袜亚洲另类 | √禁漫天堂资源中文www| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产一区在线观看成人免费| 精品久久久久久久末码| 久久热在线av| 在线观看舔阴道视频| 丁香六月欧美| 国产日本99.免费观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 午夜免费鲁丝| 妹子高潮喷水视频| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 真人一进一出gif抽搐免费| 国产欧美日韩一区二区精品| 午夜精品久久久久久毛片777| 最近在线观看免费完整版| 人妻久久中文字幕网| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 97碰自拍视频| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产1区2区3区精品| 黄色毛片三级朝国网站| 伦理电影免费视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 女警被强在线播放| 制服诱惑二区| 亚洲成av人片免费观看| 精品第一国产精品| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 高清在线国产一区| 免费在线观看影片大全网站| 色综合站精品国产| 婷婷丁香在线五月| 亚洲三区欧美一区| 亚洲第一青青草原| 黄色片一级片一级黄色片| 一级毛片高清免费大全| 亚洲国产精品sss在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 日本三级黄在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 男女视频在线观看网站免费 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 日韩欧美三级三区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 热re99久久国产66热| 午夜免费成人在线视频| 香蕉av资源在线| 在线免费观看的www视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| or卡值多少钱| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久久久久久精品吃奶| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久草成人影院| 欧美另类亚洲清纯唯美| 精品一区二区三区av网在线观看| 91九色精品人成在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 丝袜美腿诱惑在线| 日本三级黄在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲av电影在线进入| 亚洲免费av在线视频| 不卡av一区二区三区| 国产不卡一卡二| 日本 欧美在线| 午夜久久久久精精品| 在线观看www视频免费| 久久久水蜜桃国产精品网| 午夜激情福利司机影院| 国产精品一区二区精品视频观看| 美女高潮到喷水免费观看| 99热6这里只有精品| 一本综合久久免费| 草草在线视频免费看| a在线观看视频网站| 精品一区二区三区av网在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 午夜激情福利司机影院| 国产精品乱码一区二三区的特点| 久久久久久久久久黄片| 99久久国产精品久久久| 午夜激情av网站| 1024香蕉在线观看| 国产麻豆成人av免费视频| 一区二区三区国产精品乱码| 国产精品免费视频内射| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 91成年电影在线观看| 最近在线观看免费完整版| 正在播放国产对白刺激| 精品高清国产在线一区| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲一区中文字幕在线| 久热爱精品视频在线9| 不卡一级毛片| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲欧美激情综合另类| 午夜免费鲁丝| 少妇熟女aⅴ在线视频| 日韩国内少妇激情av| 色哟哟哟哟哟哟| 丁香欧美五月| 亚洲一码二码三码区别大吗| 精品国内亚洲2022精品成人| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲专区国产一区二区| 国产精品99久久99久久久不卡| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 在线视频色国产色| 欧美在线黄色| 中亚洲国语对白在线视频| 91老司机精品| 国产精品久久久av美女十八| 又大又爽又粗| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲国产看品久久| 99精品久久久久人妻精品| 又黄又粗又硬又大视频| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 成年女人毛片免费观看观看9| 又黄又爽又免费观看的视频| 90打野战视频偷拍视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲中文字幕日韩| 久久久久久久午夜电影| 后天国语完整版免费观看| 特大巨黑吊av在线直播 | 大型黄色视频在线免费观看| 国产av在哪里看| 99精品欧美一区二区三区四区| 免费高清在线观看日韩| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 欧美日韩黄片免| avwww免费| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 午夜精品在线福利| 婷婷丁香在线五月| 久久 成人 亚洲| 国产乱人伦免费视频| 国产免费av片在线观看野外av| 啪啪无遮挡十八禁网站| e午夜精品久久久久久久| 我的亚洲天堂| 欧美日韩精品网址| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 极品教师在线免费播放| 日本一区二区免费在线视频| 久久伊人香网站| 少妇熟女aⅴ在线视频| 18禁黄网站禁片免费观看直播| a在线观看视频网站| 看免费av毛片| 老汉色∧v一级毛片| 国产精品久久久人人做人人爽| 免费观看人在逋| 中文字幕精品亚洲无线码一区 | 国产91精品成人一区二区三区| x7x7x7水蜜桃| 麻豆成人av在线观看| 久久久久久大精品| 国产成人av激情在线播放| 成人三级黄色视频| 三级毛片av免费| 国产精品98久久久久久宅男小说| or卡值多少钱| 看免费av毛片| 草草在线视频免费看| 三级毛片av免费| 99国产精品一区二区三区| 99re在线观看精品视频| 女性生殖器流出的白浆| 久久香蕉激情| 国产精品亚洲美女久久久| 黄片小视频在线播放| 亚洲一区高清亚洲精品| 少妇粗大呻吟视频| 18美女黄网站色大片免费观看| 中文字幕高清在线视频| 深夜精品福利| 高清在线国产一区| 国产不卡一卡二| 无人区码免费观看不卡| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 亚洲 欧美一区二区三区| 一级a爱片免费观看的视频| 免费搜索国产男女视频| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲国产欧美网| 亚洲全国av大片| 黄色视频不卡| 亚洲第一电影网av| 美女大奶头视频| 1024手机看黄色片| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| av在线天堂中文字幕| 观看免费一级毛片| 欧美又色又爽又黄视频| 欧美激情高清一区二区三区| 精品无人区乱码1区二区| 国产v大片淫在线免费观看| 级片在线观看| 不卡av一区二区三区| 99国产极品粉嫩在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 国产在线精品亚洲第一网站| 色综合亚洲欧美另类图片| 亚洲免费av在线视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 日韩大尺度精品在线看网址| 亚洲第一青青草原| 在线播放国产精品三级| 亚洲成人精品中文字幕电影| 99国产精品一区二区蜜桃av| www.精华液| 国产亚洲精品一区二区www| 久久精品人妻少妇| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 成人亚洲精品一区在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美三级亚洲精品| 国产精品亚洲av一区麻豆| 中文字幕最新亚洲高清| 国语自产精品视频在线第100页| 美女免费视频网站| cao死你这个sao货| 色综合欧美亚洲国产小说| 欧美不卡视频在线免费观看 | 女性被躁到高潮视频| 国产真人三级小视频在线观看| 老鸭窝网址在线观看| 午夜激情福利司机影院| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 999久久久国产精品视频| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲国产精品久久男人天堂| 久久国产精品影院| 亚洲第一青青草原| 无人区码免费观看不卡| 亚洲一区二区三区不卡视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产亚洲精品久久久久5区| 日本黄色视频三级网站网址| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 后天国语完整版免费观看| av免费在线观看网站| 国产av不卡久久| 中出人妻视频一区二区| 精品福利观看| 香蕉av资源在线| 十八禁人妻一区二区| 正在播放国产对白刺激| 18禁观看日本| 1024手机看黄色片| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲黑人精品在线| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 欧美日韩乱码在线| 国产熟女xx| 亚洲精品粉嫩美女一区| 免费观看精品视频网站| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲欧美精品综合久久99| 人人妻人人澡欧美一区二区| 99久久精品国产亚洲精品| 一进一出抽搐gif免费好疼| 嫁个100分男人电影在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 色播亚洲综合网| 无限看片的www在线观看| 91成年电影在线观看| 成人欧美大片| 男女床上黄色一级片免费看| 精品一区二区三区av网在线观看| 免费av毛片视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲avbb在线观看| 草草在线视频免费看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产午夜福利久久久久久| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产麻豆成人av免费视频| 成人国产综合亚洲| 国产成年人精品一区二区| 亚洲成人久久爱视频| netflix在线观看网站| 亚洲av美国av| 国产在线精品亚洲第一网站| 一二三四社区在线视频社区8| 91大片在线观看| 一进一出好大好爽视频| 九色国产91popny在线| 久久天堂一区二区三区四区| 久久热在线av| 十八禁网站免费在线| 久久热在线av| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产精品野战在线观看| 久久久久久大精品| 香蕉久久夜色| 午夜亚洲福利在线播放| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产视频一区二区在线看| 最近最新免费中文字幕在线| 熟女电影av网| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 妹子高潮喷水视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲全国av大片| 黄色片一级片一级黄色片| 好男人电影高清在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲专区中文字幕在线| 久久这里只有精品19| www.自偷自拍.com| 国产亚洲欧美98| 久久人人精品亚洲av| 国产亚洲欧美98| 亚洲成人精品中文字幕电影| 成人亚洲精品av一区二区| av在线播放免费不卡| 老司机福利观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 伦理电影免费视频| 国产精品一区二区三区四区久久 | 嫩草影视91久久| x7x7x7水蜜桃| 国产成人系列免费观看| 99热这里只有精品一区 | 亚洲色图av天堂| 欧美黑人巨大hd| 亚洲专区国产一区二区| 青草久久国产| ponron亚洲| 久99久视频精品免费| 自线自在国产av| 热99re8久久精品国产| 日韩欧美国产一区二区入口| 少妇的丰满在线观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 国产97色在线日韩免费| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 天堂影院成人在线观看| 长腿黑丝高跟| 久久精品国产综合久久久| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲一区中文字幕在线| 日韩大码丰满熟妇| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲自拍偷在线| 特大巨黑吊av在线直播 | 国产精品野战在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 老司机深夜福利视频在线观看| 成人午夜高清在线视频 | 欧美日韩福利视频一区二区| 一区二区三区高清视频在线| 露出奶头的视频| 国产又爽黄色视频| 男人的好看免费观看在线视频 | 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 丝袜在线中文字幕| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国内精品久久久久久久电影| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲男人的天堂狠狠| 无遮挡黄片免费观看| 1024手机看黄色片| 婷婷亚洲欧美| videosex国产| 高清在线国产一区| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 欧美精品亚洲一区二区| 成人免费观看视频高清| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 日韩大码丰满熟妇| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 欧美黄色片欧美黄色片| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲三区欧美一区| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产主播在线观看一区二区| 99久久精品国产亚洲精品| 久久婷婷成人综合色麻豆| 欧美黑人巨大hd| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲精品美女久久av网站| 国产精品永久免费网站| 国产野战对白在线观看| 可以在线观看的亚洲视频| 国产视频一区二区在线看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 欧美黄色淫秽网站| 精品电影一区二区在线| 91国产中文字幕| 亚洲av成人一区二区三| www.999成人在线观看| 国产成人欧美在线观看| 精品国产美女av久久久久小说| 一级毛片女人18水好多| 日日干狠狠操夜夜爽| www日本在线高清视频| cao死你这个sao货| 国产99白浆流出| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美在线黄色| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲av五月六月丁香网| 久9热在线精品视频| 亚洲专区中文字幕在线| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久亚洲真实| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 色综合站精品国产| 人人澡人人妻人| 在线永久观看黄色视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 成人三级黄色视频| 国产97色在线日韩免费| 男人舔女人的私密视频| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 妹子高潮喷水视频| 久久精品成人免费网站| 757午夜福利合集在线观看| 久久久久久久午夜电影| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 欧美黑人精品巨大| 首页视频小说图片口味搜索| 在线观看www视频免费| 99riav亚洲国产免费| 在线观看66精品国产| 男人的好看免费观看在线视频 | 热re99久久国产66热| 天堂√8在线中文| 制服人妻中文乱码| 国产高清激情床上av| 成人亚洲精品av一区二区| 午夜a级毛片| 国产v大片淫在线免费观看| 午夜福利18| xxxwww97欧美| 999精品在线视频| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 久久久国产成人免费| 国产精品免费视频内射| 又大又爽又粗| 欧美成人午夜精品| 禁无遮挡网站| 国产99白浆流出| 99久久无色码亚洲精品果冻| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 超碰成人久久| 午夜亚洲福利在线播放| 黑人操中国人逼视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲,欧美精品.| 亚洲人成网站高清观看| 欧美黑人欧美精品刺激| 欧美大码av| 黄色女人牲交| 老司机福利观看| 亚洲国产看品久久| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产99白浆流出| 麻豆av在线久日| 人人妻人人看人人澡| 韩国av一区二区三区四区| 亚洲激情在线av| 欧美中文综合在线视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 精品无人区乱码1区二区| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 男人操女人黄网站| 国产精品一区二区精品视频观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 757午夜福利合集在线观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产av又大| 2021天堂中文幕一二区在线观 | 精品不卡国产一区二区三区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 一进一出好大好爽视频| 国产亚洲精品一区二区www| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产成人系列免费观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 色播亚洲综合网| 欧美+亚洲+日韩+国产| 精品久久久久久久久久久久久 | 亚洲在线自拍视频| 久久精品国产亚洲av高清一级| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 99热这里只有精品一区 | 91成人精品电影| 黄片播放在线免费| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产高清视频在线播放一区| 国产亚洲欧美精品永久| 久久久久久大精品| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 欧美精品亚洲一区二区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 91成人精品电影| 午夜久久久在线观看| av天堂在线播放| 草草在线视频免费看| 狂野欧美激情性xxxx| 成人三级黄色视频| 国产激情久久老熟女| 久久精品国产清高在天天线| 窝窝影院91人妻| 久久中文字幕人妻熟女| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 国产av又大| 嫩草影视91久久| 成年免费大片在线观看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产成人啪精品午夜网站| 日韩欧美三级三区| 亚洲一区二区三区不卡视频| 久9热在线精品视频| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 一级作爱视频免费观看| 国产精品久久久久久精品电影 | 亚洲av日韩精品久久久久久密| 一级a爱视频在线免费观看| 十分钟在线观看高清视频www| 久久精品影院6| 免费无遮挡裸体视频| av片东京热男人的天堂| АⅤ资源中文在线天堂| 麻豆成人av在线观看| 精品久久蜜臀av无| 久久久久久大精品| 妹子高潮喷水视频| 国产精品 欧美亚洲| 制服丝袜大香蕉在线| 少妇粗大呻吟视频| 中文在线观看免费www的网站 | 99热这里只有精品一区 | 亚洲国产看品久久| 国产成人精品久久二区二区免费| 桃红色精品国产亚洲av|