朱萬龍, 蔡金紅, 張 麟, 王政昆
(云南師范大學 生命科學學院,昆明 650500)
自然環(huán)境中,環(huán)境因子的季節(jié)性變化對動物的繁殖、生存和能量代謝等生理生態(tài)特征有著重要的影響[1]。由于氣候條件的變化,環(huán)境因素與生物相互作用,并共同影響著動物對能量的分配、獲取、處理及消耗[2]。在季節(jié)性變化中,面臨持續(xù)的環(huán)境變化時,生物有機體不斷的調整自身的生理生態(tài)特征,從而維持體重穩(wěn)態(tài)[3]。許多研究認為,季節(jié)變化影響著很多物種的體重和能量平衡[4, 5]。而有生物機體只有在能量的獲得和消耗之間保持平衡的情況下,才能夠維持正常的繁殖和生存,這種平衡依賴于能量攝入、消化過程以及能量分配之間的相互作用[6]。在寒冷的冬季,動物為了適應外界環(huán)境,維持自身體溫的恒定,會使產(chǎn)熱增加,從而增加能量消耗,最終使得能量攝入增加,所以,能量攝入的增加可能是由于動物對冬季寒冷環(huán)境產(chǎn)熱增加的適應性變化,從而維持體重平衡[7]。
瘦素是由白色脂肪細胞分泌的蛋白類激素[8],通過血液循環(huán)作用于下丘腦,與下丘腦中的受體結合,可抑制攝食,促進產(chǎn)熱[9]。瘦素通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調控與機體能量穩(wěn)態(tài)平衡緊密的聯(lián)系在一起,可調節(jié)機體食物攝入和能量消耗[10]。在維持能量代謝活動中,下丘腦發(fā)揮著關鍵的作用,是能量平衡和代謝平衡的調控中樞[11],下丘腦各個核團之間,各種神經(jīng)肽相互形成了調控網(wǎng)絡,這是能量平衡的基礎[12]。下丘腦神經(jīng)元會分泌一些神經(jīng)肽,這些神經(jīng)肽可分為兩類:1)促進食欲神經(jīng)肽:比如神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y,NPY)、刺鼠相關蛋白(agouti related peptide,AgRP),可刺激進食和抑制能量消耗。2)抑制食欲神經(jīng)肽:比如阿片促黑色素原(pro-opiomelanocortin,POMC)、可卡因-安他非明轉錄調節(jié)肽(cocaine and amphetamine regulated transcript peptide,CART),可抑制食物攝入和刺激能量消耗[13]。其中NPY由36個氨基酸組成,是一種高度保守的多肽,是攝食最強的刺激因子,在1982年最早被分離出來[14],廣泛分布于外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng),其生物學功能主要是參與調節(jié)動物的攝食行為、生物節(jié)律性、平滑肌的收縮、呼吸調節(jié)以及影響下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌活動[15]。POMC由267個氨基酸組成,是一種前體蛋白,是一類厭食的神經(jīng)肽,在動物的應急、攝食和能量代謝等的調節(jié)中起著非常重要的作用[16]。CART是在動物體內(nèi)廣泛分布的一種神經(jīng)肽類物質[17],最初由Spiess等[18]在羊下丘腦的抽提物中分離出來,可抑制動物的攝食行為,降低體重,并受瘦素的調節(jié)[19]。動物下丘腦分泌的這些神經(jīng)肽通過調節(jié)食欲強弱和機體能量代謝活動來維持能量的平衡,NPY、POMC和CART基因的表達平衡說明了下丘腦體重調節(jié)平衡的正常狀態(tài)[20]。
中緬樹鼩(Tupaiabelangeri)屬攀鼩目(Scandentia)樹鼩科(Tupaiidae),主要分布于南亞、東南亞,中國廣西南部、云南、四川西南、貴州西南部及海南島,為東洋界特有的小型哺乳動物,在國內(nèi)僅有中緬樹鼩一種,以現(xiàn)生樹鼩的分布特征來看,云貴高原及其附近的橫斷山地區(qū)可能構成了中緬樹鼩的分布北限[21]。之前的研究表明,中緬樹鼩的體重、產(chǎn)熱和能量收支具有季節(jié)性變化[22],消化道也具有季節(jié)性變化[23],但是對于血清瘦素和下丘腦神經(jīng)肽在能量代謝中的作用還沒有報道。本研究基于以上的結果,對不同季節(jié)中緬樹鼩的體重、體脂、血清瘦素和下丘腦神經(jīng)肽表達量進行測定,為進一步研究下丘腦神經(jīng)元在中緬樹鼩中的體重調節(jié)和能量穩(wěn)態(tài)調節(jié)奠定了基礎。
中緬樹鼩春(3月)夏(6月)秋(9月)冬(12月)季各8只(4♂,4♀)、9只(4♂,5♀)、8只(4♂,4♀)和8只(4♂,4♀),動物捕回后適應3 d,之后處死動物,測定體重和體脂,制備血清,以測定其瘦素的含量,并取出下丘腦放于-80℃保存,用于RNA提取。激素于2012年11—12月在云南省昆明醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院進行測定;其它實驗均在云南師范大學生命科學學院實驗室進行。
體重在動物處死后稱量,體脂含量采用丹麥福斯公司生產(chǎn)的SoxtecTM2043浸提裝置測定,將已去除內(nèi)臟等消化道器官的動物胴體置于60℃烘箱中干燥至恒重,取出來后稱量胴體總重,然后用小型粉碎機粉碎混勻后,稱取2 g左右的樣品測定脂肪含量。計算方法為:體脂含量(%)=總體脂重量(g)/胴體干重(g)×100%[3]。
將動物處死后,取血,放于4 ℃靜置1 h,于4 ℃、4000 r/min離心30 min,吸取上層血清置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。血清瘦素含量采用瘦素放射免疫分析試劑盒(美國Linco公司生產(chǎn)) 測定。批內(nèi)差和批間差小于5 %。
1.4.1 RNA提取及純度鑒定
下丘腦總RNA的提取與純化按照RNApure高純總RNA快速抽提試劑盒(BioTeke Co.)提供方法進行。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度和完整性。RNA于-80℃保存。
1.4.2 cDNA第一鏈合成
cDNA第一鏈的合成以下丘腦總RNA為模板,oligo(dT)18為反轉錄引物,按照M-MLV Frist Strand Kit試劑盒(Invitrogen Co.)提供方法進行。按表1冰浴配制反應體系,反應完畢后,-20℃ 保存。
表1 cDNA第一鏈合成反應體系
1.4.3NPY、POMC和CART基因cDNA核心序列的擴增
根據(jù)表2所列引物,引物采用Tang[13]和Palou[24]報道的引物。以上述cDNA第一鏈為模板進行RT-PCR,擴增條件均為:95℃變性5 min,95 ℃ 30 s,54~56 ℃ 1 min,72 ℃ 1.5 min,共37個循環(huán),72 ℃ 延伸10 min。擴增體系為25 μL:其中含有1 μL Template(10 ng/μL), 2.5 μL 10×PCR Buffer,1 μL MgCl2(25 mmol/ L),2 μL dNTP Mixture(10 mmol/L,pH值8.0),1 μL Primer 01 (10 pmol/μL), 1 μL Primer 02(10 pmol/μL),0.5 μLTaqenzyme(4 U/μL,購自北京博邁德生物公司),16 μL ddH2O。RT-PCR產(chǎn)物以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并送至昆明碩陽科技有限公司進行正反兩個方向的序列測定。
表2 擴增中緬樹鼩NPY、POMC、CART序列所用引物
1.4.4 實時熒光定量PCR(FQ-PCR)
采用ABI-7000TM實時熒光PCR儀擴增模板cDNA,并檢測熒光信號。按SYBR Green realmastermix Mix試劑盒說明配制FQ-PCR 反應體系如下(表3)。
表3 FQ-PCR反應體系
每個樣本基因進行3次FQ-PCR平行重復,后續(xù)數(shù)據(jù)處理均采用3個平行結果的平均值。內(nèi)參基因引物為:F:GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC;R:CATCTGCTGGAAGGTGGACA。擴增條件為94℃2 min;94℃15 s,60℃35 s,重復40個循環(huán)。
1.4.5 2-△△CT相對定量法
采用2-△△CT公式法定量計算目的基因的轉錄表達水平,用內(nèi)參基因作均一化處理,ΔΔCT=(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)處理組-(CT目的基因-CT內(nèi)參基因)對照組,目的基因的表達水平2-△△CT可反映出該樣本目的基因的初始模板量用內(nèi)參基因均一化處理后相對于對照樣本的表達倍數(shù) (差異)[13],對于對照樣本,ΔΔCT=0,2-△△CT=1,對于處理組樣本來說,如果2-△△CT>1,說明該基因表達上調,如果2-△△CT<1,則說明該基因表達下調。
利用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行相關統(tǒng)計處理,體重用單因素方差(One-way ANOVA)分析,體脂、血清以及下丘腦神經(jīng)肽表達量結果采用協(xié)方差(ANCOVA)分析,體重作為協(xié)變量,組間差異性用多組比較(Duncan)分析。雌雄中緬樹鼩的各指標差異均不顯著(P>0.05),故兩者也可合并統(tǒng)計。均以平均值±標準誤表示(Mean±S.E.),P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。
不同季節(jié)間,中緬樹鼩體重差異極顯著(F=20.984,P<0.01)(圖1);體脂差異極顯著(F=8.172,P<0.01)(圖2),其中體重和體脂都是冬季最高,夏季最低。
圖1 中緬樹鼩體重的季節(jié)性變化
注:不同字母代表差異性顯著,下同。
圖2 中緬樹鼩體脂的季節(jié)性變化
中緬樹鼩不同季節(jié)的血清瘦素濃度分別為7.14 ng/mL±0.44 ng/mL、7.94 ng/mL±0.31 ng/mL、6.91 ng/mL±0.57 ng/mL、6.19 ng/mL±0.71 ng/mL,其中夏季顯著高于冬季(P<0.05),而春秋季與夏冬季差異不顯著(圖3)。中緬樹鼩的體重和血清瘦素具有顯著的負相關(r=-0.540,P<0.01; 圖4)。
圖3 中緬樹鼩血清瘦素濃度的季節(jié)性變化
圖4 中緬樹鼩體重和血清瘦素濃度的關系圖
圖5 中緬樹鼩下丘腦NPY表達量的季節(jié)性變化
NPY:不同季節(jié)間,中緬樹鼩下丘腦神經(jīng)肽NPYmRNA表達量差異不顯著(F=2.147,P>0.05)(圖 5)。POMC: 不同季節(jié)間,中緬樹鼩下丘腦神經(jīng)肽POMCmRNA表達量差異顯著(F=7.433,P<0.05),其中夏季顯著高于其他季節(jié),冬季最低(圖 6)。CART: 不同季節(jié)間,中緬樹鼩下丘腦神經(jīng)肽CARTmRNA表達量差異不顯著(F=2.856,P>0.05)(圖 7)。
圖 6 中緬樹鼩下丘腦POMC表達量的季節(jié)性變化
圖7 中緬樹鼩下丘腦CART表達量的季節(jié)性變化
面對外界環(huán)境的不斷變化,動物會出現(xiàn)生理生態(tài)特征的表型可塑性,從而使能量攝入與能量消耗之間存在一個動態(tài)平衡[1]。能量攝入與體重、消化等因素有關。如果要測定動物的營養(yǎng)狀態(tài),體重則是一個重要因子,這也取決于能量攝入和能量消耗之間的平衡。許多小型哺乳動物在缺乏食物和冷脅迫的環(huán)境中,通過減少總能量需求來降低體重,從而適應環(huán)境[1],如長爪沙鼠(Merionesunguiculatus)[3]、布氏田鼠等(Microusbrandti)[5]。而中緬樹鼩的體重變化特征與它們不同,隨著環(huán)境溫度的降低,體重不斷的增加,這與金黃倉鼠(Mesocricetusauratus)和潘帕斯鼠(Akodonazarze)等情況相似[25]。這很可能與中緬樹鼩的分布區(qū)有關,中緬樹鼩分布于熱帶亞熱帶及其高原地區(qū),在冬季沒有冰雪覆蓋,食物資源相對比較充足。因此,可增加攝食量來滿足能量消耗的增加,從而導致體重增加。在寒冷環(huán)境中,小型哺乳動物會增加體內(nèi)的脂肪存儲來彌補能量的消耗[26]。研究表明長爪沙鼠在低溫條件下會增加體內(nèi)脂肪存儲,作為能量來源的補充[27]。中緬樹鼩體脂的變化與體重的變化相一致,均為冬季最高,夏季最低。這與中緬樹鼩的生活環(huán)境是密不可分的,祿勸地區(qū)屬滇中高原北部,北亞熱帶高原氣候,年平均溫度為15.6℃,冬季沒有冰雪覆蓋,食物資源充足,攝入量的增加使體重增加,從而導致體脂增加。
中緬樹鼩的血清瘦素濃度冬季最低,低濃度的瘦素可防止進一步消耗能量,從而維持能量的平衡。在寒冷的冬季,低溫誘導中緬樹鼩降低瘦素含量,形成饑餓信號,從而增加能量攝入,以補償寒冷環(huán)境下維持生存所需的能量。瘦素作為一種信號,通過血液循環(huán)作用于下丘腦[28],低濃度瘦素可促進NPY的分泌[29],從而食欲增強,攝入量增加,以滿足產(chǎn)熱的需要。此外,中緬樹鼩的體重和血清瘦素呈負相關,與冷馴化條件下體重和血清瘦素的相關關系相似,說明在冬季或者低溫條件下,低濃度的瘦素有利于增加能量攝入,從而增加體重[30]。下丘腦神經(jīng)元NPY、POMC和CART被認為在能量調節(jié)中有重要的作用[12]。下丘腦存在的NPY通路能增加食欲和攝食量,這與NPY神經(jīng)元廣泛分布的側支刺激食欲的反應有關。中緬樹鼩下丘腦神經(jīng)元NPY的表達量在夏季最低,冬季最高,春季和秋季變化不大,與體重和攝入量的變化趨勢一致。NPY基因表達量增加,則促進食欲的增加,從而導致攝入量增加,攝入量的增加最終使體重增加,以補償中緬樹鼩在冬季產(chǎn)熱增加。而POMC和CART有抑制食欲的作用,在夏季,POMC和CART基因的表達量相對增加,抑制了食欲,導致攝入量降低,以適應夏季炎熱的環(huán)境。
綜上所述,中緬樹鼩通過增加體重和體脂來適應冬季的寒冷環(huán)境,并表現(xiàn)出了季節(jié)性變化。在此過程中,瘦素作為信號,作用于下丘腦,通過控制神經(jīng)肽NPY、POMC、CART基因的表達量來調節(jié)中緬樹鼩能量穩(wěn)態(tài)。
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