樺木醇吡啶鹽衍生物的合成及其生理活性研究

欒俊穎， 池萬福， 韓榮弼

( 延邊大學(xué)長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室， 吉林 延吉 133002 )

樺木醇及其衍生物具有抗HIV[1-3]、抗腫瘤[4-6]和消炎[7-8]等作用，而且在抗HIV、抗腫瘤等方面顯示出靶向作用強(qiáng)、不良反應(yīng)小的特性.2005年S.C.Agnieszka等人[9]發(fā)現(xiàn)白樺脂醇對酒精引起的肝細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用；Tang J J等人[10]研究發(fā)現(xiàn)樺木醇能夠降低通常被固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)“打開”的基因活動，指出其有可能成為高脂血癥藥物開發(fā)的先導(dǎo)化合物.H.Kommera等人[11]研究發(fā)現(xiàn)在樺木酸的C-3的羥基上連接氯乙?；鶗r，其在體外的抗癌活性比樺木酸大大增加.本文以樺木醇1為原料，將其與溴乙酰氯發(fā)生酯化反應(yīng)得到化合物2，然后將化合物2與吡啶反應(yīng)得到化合物3，最終再通過陰離子交換得到目標(biāo)化合物4a-c(合成路線見圖1)，并對各化合物的活性進(jìn)行了探討.

圖1 樺木醇吡啶鹽衍生物的合成

1 合成

1.1 儀器和試劑

1H-NMR用AV-300型超導(dǎo)核磁共振波譜儀(德國Bruker公司，TMS為內(nèi)標(biāo))測定；熔點用X-5型顯微熔點儀(溫度計未經(jīng)校正)測定；紅外光譜用IRPrestige-21型傅立葉變換紅外光譜儀測定.所有反應(yīng)試劑均為市售分析純，購買后未經(jīng)處理直接使用.

1.2 樺木醇(1)的提取

樺木醇的提取和純化按文獻(xiàn)[12-13]方法進(jìn)行，所得樺木醇的熔點、紅外以及氫譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)值一致.

1.3 溴乙酰氯的制備

在溴乙酸(13.8 g，100 mmol)中，加入二氯化亞砜(10 mL)， 85 ℃下攪拌2 h，蒸餾收集120 ℃的餾分，得到9.1 g黃色液體.產(chǎn)率為64%, b.p.127～128 ℃;1H-NMR(CDCl3,300 MHz) δ: 4.35(s,2H,H—CH2),13C-NMR(75 MHz,CDCl3) δ: 165.74, 33.63.

1.4 28-O-溴乙?；鶚迥敬?2)的制備

將樺木醇1 (0.44 g，1.0 mmol)和三乙胺(0.28 mL，2.0 mmol)溶解于二氯甲烷(8 mL)中，在冰浴中邊攪拌邊滴加含有82 μL溴乙酰氯(1 mmol)和4 mL二氯甲烷的混合溶液，繼續(xù)反應(yīng)6 h；水洗(10 mL×3)，干燥，減壓除去溶劑得白色固體0.341 g，產(chǎn)率為56%.1H-NMR(CDCl3,300 MHz) δ: 4.52, 4.62(each s,1H,H-29), 3.88,4.30(each d,1H,J=9.6 Hz,H-28), 3.76～3.82(m,2H,OCOCH2Br), 3.05～3.18(m,1H,H-3), 2.28～2.45(m,1H,H-19), 1.61(s,1H,H-30), 0.95, 0.90, 0.89, 0.75, 0.68(each s,3H,5×CH3).

1.5 28-O-(2-吡啶乙酰基)樺木醇溴化鹽(3)的制備

1.6 28-O-(吡啶乙?；?樺木醇鹽(4a-c)的制備

將化合物3 (0.22 g，0.35 mmol)和硝酸銀或醋酸銀、硫酸銀(0.70 mmol)溶解于乙醇(10 mL)中，用頻率為600 Hz的超聲波超聲震蕩1 h.抽濾，用大量乙醇沖洗，減壓除盡溶劑后分別得黃色固體(4a) 0.384 g、灰白色固體(4b) 0.384 g和棕色固體(4c) 0.384 g.

2 體外細(xì)胞活性測試

測試細(xì)胞為肝星狀細(xì)胞(HSC cell)、人肺癌細(xì)胞(A549 cell)和人肝癌細(xì)胞(HepG 2 cell).

細(xì)胞存活率測定采用MTT法：①將上述單細(xì)胞懸液分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(1×104cells/well)中. ② 在37 ℃及一定的濕度條件下培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)液換成5%血清；加藥，使化合物3、4a-c的終濃度為100 μg/mL和200 μg/mL，每個濃度設(shè)3個平行空，同時設(shè)陰性對照(僅含培養(yǎng)液)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h.③在培養(yǎng)結(jié)束前4 h摻入20 μL MTT (5 mg/mL)，培養(yǎng)結(jié)束后離心(4 ℃，2 000 r/min，5 min)，吸去上清液后，每個孔加入100 μL DMSO，并用微量振蕩器震蕩，使紫色晶體完全溶解；用酶標(biāo)儀在540 nm波長條件下測定光吸收OD值. ④計算細(xì)胞增殖抑制率(抑制率=(1-OD樣品/OD空白對照)×100%，然后根據(jù)不同待測物及其不同濃度的實驗數(shù)據(jù)，將抑制率與藥物濃度做圖，得出劑量反應(yīng)曲線，計算出半數(shù)抑制濃度(IC50)值.

樺木醇吡啶鹽衍生物對肝星狀細(xì)胞(HSC cell)、人肺癌細(xì)胞(A549 cell)和人肝癌細(xì)胞(HepG 2 cell)的生長存活率見圖2—圖4 (圖中數(shù)據(jù)為每組平行3次實驗數(shù)據(jù)的平均值).由圖2—圖4可見，除化合物4b外，化合物3、4a和4c均對上述3種細(xì)胞有明顯的抑制作用.由圖5可以看出，化合物3、4a和4c對人肝癌細(xì)胞(HepG 2 cell)的IC50值分別為19.43，18.95,24.83 μg/mL，均明顯小于樺木醇的IC50值(44.19 μg/mL)[14].這說明化合物3、4a和4c對人肝癌細(xì)胞(HepG 2 cell)的抑制作用強(qiáng)于樺木醇.

圖2 4種化合物對肝星狀細(xì)胞的活性測試結(jié)果

圖3 4種化合物對人肺癌細(xì)胞的活性測試結(jié)果

圖4 4種化合物對人肝癌細(xì)胞的活性測試結(jié)果

圖5 樺木醇與化合物3、4a、4c的IC50值對比

3 結(jié)論

本文以樺木醇為原料合成了4種樺木醇吡啶鹽化合物，并用IR和1H-NMR對這4種化合物進(jìn)行了表征.采用MTT比色法測試了這4種化合物對肝星狀細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞、人肺癌細(xì)胞的細(xì)胞活性，結(jié)果表明，化合物3、4a、4c對上述3種細(xì)胞有著較好的抑制作用.這3種化合物對其他癌細(xì)胞的活性價值還有待于進(jìn)一步研究.

參考文獻(xiàn)：

[1] Sun I C, Shen J K, Wang H K, et al. Anti-AIDS agents. 32.′ Synthesis and anti-HIV activity of betulin derivatives[J]. Bioorg Med Chem Lett, 1998,8(10):1267-1272.

[2] Qian K, Yu D, Chen C H, et al. Anti-AIDS agents. 78.+Design, synthesis, metabolic stability assessment, and antiviral evaluation of novel betulinic acid derivatives as potent anti-human immunodeficiency virus (HIV) agents[J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2009,52(10):3248-3258.

[3] Wei Ying, Ma Chaomei, Chen Deyuan, et al. Anti-HIV-1 protease triterpenoids fromStauntoniaobovatifoliolaHayata subsp.intermedia[J]. Phytochemistry, 2008,69(9):1875-1879.

[4] Kim J Y, Koo H M, Kim D S. Development of C-20 modified betulinic acid derivatives as antitumor agents[J]. Bioorg Med Chem Lett, 2001,11(17):2405-2408.

[5] Saxena B B, Zhu L, Hao M, et al. Boc-lysinated-betulonic acid: A potent, anti-prostate cancer agent[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2006,14(18):6349-6358.

[6] Chintharlapalli S, Papineni S, Ramaiah S K, et al. Betulinic acid inhibits prostate cancer growth through inhibition of specificity protein transcription factors[J]. Cancer Res, 2007,67(6):2816-2823.

[7] Recio M C, Giner R M, Mánez S, et al. Investigations on the steroidal anti-inflammatory activity of triterpenoids from Diospyros leucomelas[J]. Planta Medica, 1995,61(1):9-12.

[8] Honda T, Liby K T, Su X, et al. Design, synthesis, and anti-inflammatory activity both in vitro and in vivo of new betulinic acid analogues having an enone functionality in ring A[J]. Bioorg Med Chem Lett, 2006,16(24):6306-6309.

[9] Agnieszka S C, Martyna K S. Protective effects of betulin and betulinic acid against ethanol-induced cytotoxicity in HepG 2 cells[J]. Pharmacological Reports, 2005,57(5):588-595.

[10] Tang J J, Li J G, Qi W, et al. Inhibition of SREBP by a small molecule, betulin, improves hyperlipidemia and insulin resistance and reduces atherosclerotic plaques[J]. Cell Metabolism, 2011,13(1):44-56.

[11] Kommera H, Kaluderovic G N, Kalbitz J, et al. Synthesis and anticancer activity of novel betulinic acid and betulin derivatives[J]. Archiv der Pharmazie, 2010,343(8):449-457.

[12] 韓世巖,方桂珍,李珊珊.四氫呋喃-苯混合溶劑法分離純化樺木醇[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2005,25:129-132.

[13] 王石發(fā),張明光,李艷蘋.樺木醇提取及純化工藝的研究[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2007,27:22-26.

[14] 隋若君,張小麗,方桂珍,等.樺木醇丁二酸酯氨基酸叔丁酯的合成及對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響[J].林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè),2013,33(1):59-63.