HIV-1可溶性單鏈抗體b12-scFv的表達(dá)與活性分析

楊 雄，劉秀俠，南 昊，許曉東，陳紅英

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

艾滋病(AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(HIV-1)引起的一種病毒性傳染病。自1981年發(fā)現(xiàn)以來(lái)，該病已經(jīng)肆虐全球，嚴(yán)重危害到人類生命與健康。目前普遍采用聯(lián)合使用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物來(lái)控制AIDS的進(jìn)程，延長(zhǎng)病人的存活時(shí)間，但這些藥物不能徹底清除感染者體內(nèi)的病毒，而且治療費(fèi)用昂貴，存在不同程度的副作用。加上HIV-1具有變異率高的特點(diǎn)，為了控制病毒突變體的產(chǎn)生和積累，需要換用不同的藥物，增加了艾滋病治療的成本與難度。因此，迫切需要研制一種安全、有效、廉價(jià)并能廣泛使用的HIV-1疫苗，來(lái)預(yù)防和控制HIV-1的流行[1]。一些具有廣譜中和性作用的抗體的發(fā)現(xiàn)、分離及對(duì)其相應(yīng)抗原表位的鑒定，為HIV-1疫苗的研究帶來(lái)了新的希望。近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)了幾種廣譜中和性抗體，如b12、2F5、4E10、2G12、PG9和PG16，以及最近發(fā)現(xiàn)的VRC01、VRC02和VRC03等，能夠識(shí)別HIV-1病毒包膜蛋白上相對(duì)保守的表位，在體外能有效中和HIV-1病毒各亞型的毒株[2]。這些廣譜中和性單抗的發(fā)現(xiàn)為研制可誘導(dǎo)中和性抗體產(chǎn)生的疫苗提供了思路[3]。對(duì)這些抗體分子進(jìn)行深入研究，闡明其識(shí)別的HIV-1抗原表位，對(duì)于可誘發(fā)保護(hù)性抗體的抗原表位設(shè)計(jì)具有重要意義。

b12是第1個(gè)被證明具有廣譜中和活性的單抗，它的Fab片段來(lái)源于噬菌體展示文庫(kù)[4]，為人源化的單抗，其可識(shí)別HIV-1 gp120上與CD4受體分子結(jié)合部位部分重疊的高度保守的構(gòu)象依賴型表位[5]。b12可以通過(guò)伸出的較長(zhǎng)的CDRH3(18aa)環(huán)結(jié)合HIV-1 gp120的CD4識(shí)別位點(diǎn)，阻止HIV-1與靶細(xì)胞上受體的結(jié)合，表現(xiàn)出病毒中和作用，從而抑制HIV-1的感染。b12可以中和約75%的B亞型的HIV-1分離株[5]，是目前已知的在體內(nèi)和體外均能特異性結(jié)合HIV-1 gp120保守區(qū)域的廣譜中和性抗體[6]。

單鏈抗體(Single chain variable fragments，scFv)是一種基因工程抗體，是用一段連接肽將抗體輕鏈可變區(qū)(VL區(qū))和重鏈可變區(qū)(VH區(qū))連接而成的重組蛋白，它保留了親本抗體的全部抗原結(jié)合特異性，連接肽通常使用3次重復(fù)的GlyGlyGlyGlySer[(G4S)3]。與完整抗體相比，scFv具有分子質(zhì)量小、免疫原性低、組織穿透性好、易與靶點(diǎn)結(jié)合等優(yōu)點(diǎn)[7]。Jiang等[8]和Mason等[9]的研究證明，scFv與完整單克隆抗體一樣具有中和病毒的能力。

基因從頭合成技術(shù)已經(jīng)成熟，該技術(shù)是目前快速獲得已知基因序列的可靠方法。本研究根據(jù)文獻(xiàn)[10]報(bào)道的b12抗體的輕鏈和重鏈氨基酸序列，依照大腸桿菌密碼子偏愛性，將氨基酸序列轉(zhuǎn)換、優(yōu)化成DNA序列，再設(shè)計(jì)2對(duì)引物Ncob12L-F、G4SLight-R和G4SH-F、XhoH-R，分別擴(kuò)增其輕鏈和重鏈可變區(qū)基因，然后用引物Ncob12L-F和XhoH-R通過(guò)重疊PCR的方法將二者人為拼接起來(lái)，并克隆到原核表達(dá)載體上，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，并用Ni-NTA金屬螯合層析柱的方法從大腸桿菌細(xì)胞破碎液的上清中純化獲得了可溶性的b12單鏈抗體，檢測(cè)其與HIV-1 gp120的結(jié)合活性，以期為深入研究b12單鏈抗體與HIV-1抗原分子的相互作用及設(shè)計(jì)新型有效的HIV-1疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 原核表達(dá)載體pET28a、大腸桿菌(Escherichiacoli) Top10、大腸桿菌BL21 StarTM(DE3)來(lái)自Novagen公司。Sf9細(xì)胞來(lái)自Invitrogen公司。b12抗體輕鏈和重鏈全基因由上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司合成。

1.1.2 工具酶及生化試劑Pfu高保真DNA聚合酶、dNTPs、限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ， 均購(gòu)自Fermentas公司；T4 DNA連接酶和SDS-PAGE電泳標(biāo)準(zhǔn)蛋白，為Takara公司產(chǎn)品；凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒和質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、ELISA顯色試劑盒，均購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司；Ni-NTA金屬螯合層析柱，購(gòu)自Merck公司；抗組氨酸(His)標(biāo)簽鼠單克隆抗體、HRP和FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，購(gòu)自康為世紀(jì)生物公司；PVDF膜，購(gòu)自Millipore公司；DNA Marker，購(gòu)自Biomed公司。

1.2 方 法

1.2.1b12-scFv基因片段的合成 依據(jù)b12的輕鏈及重鏈基因序列，設(shè)計(jì)2對(duì)引物，交由生工生物工程(上海)有限公司合成。輕鏈上游引物Ncob12L-F：5′-TTGTCCATGGAGATCGTGCTGACCCAATC-3′，5′端下劃線部分為引入的NcoⅠ酶切位點(diǎn)；下游引物G4SLight-R：5′-GCTCCCGCCACCTCCAGA-GCCTCCGCCACCAGATGGTGCGGCCAC-3′。重鏈上游引物G4SH-F：5′-GGAGGTGGCGGGAGCGGCGGTGGAGGGTCTCAGGTGCAGCT-GGTGCAG-3′；下游引物XhoH-R：5′-TTGTCTCGAGAGAGGCGCTGCTCACGATCAC-3′，5′端下劃線部分為引入的XhoⅠ酶切位點(diǎn)。分別用對(duì)應(yīng)引物從合成的輕鏈與重鏈基因上擴(kuò)增出其可變區(qū)基因片段，通過(guò)G4SLight-R和G4SH-F引物在輕鏈和重鏈之間引入編碼(G4S)3間隔序列基因(Linker)，最后通過(guò)重疊PCR的方法拼接得到完整的b12-scFv基因序列。PCR反應(yīng)體系為20 μL，內(nèi)含2 μL 10×Buffer，2 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTP，上、下游引物各0.2 μmol/L，模板DNA 20 ng和1 U的Pfu高保真DNA聚合酶。PCR擴(kuò)增輕鏈和重鏈可變區(qū)的反應(yīng)條件為:94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，46 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。重疊PCR擴(kuò)增單鏈抗體全長(zhǎng)基因時(shí)，延伸時(shí)間為90 s，其他反應(yīng)條件與可變區(qū)片段的擴(kuò)增條件相同。PCR產(chǎn)物用試劑盒純化后，用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ(10 U/μL)和XhoⅠ(10 U/μL)進(jìn)行雙酶切，酶切體系為50 μL，其中10×Buffer R 5 μL、PCR產(chǎn)物25 μL、NcoⅠ 0.5 μL、XhoⅠ 0.5 μL、雙蒸水19 μL，混勻后于37 ℃水浴酶切4 h。取全部酶切產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，按照凝膠回收試劑盒說(shuō)明書回收目的基因片段，即得b12-scFv基因，其結(jié)構(gòu)表示為：scFv-VL-Linker-VH。

1.2.2 重組質(zhì)粒pETb12-scFv的構(gòu)建 用限制性內(nèi)切酶NcoⅠ(10 U/μL)和XhoⅠ(10 U/μL)對(duì)載體pET28a進(jìn)行雙酶切，電泳回收大片段。將b12-scFv基因片段與載體pET28a大片段按照物質(zhì)的量比約為3∶1混合，在T4 DNA連接酶的作用下16 ℃過(guò)夜連接。用1 μL的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，在含有50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。將鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的菌落接種到含有50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，按照質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒，進(jìn)行NcoⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序由生工生物工程(上海)有限公司完成。將測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的DNA序列進(jìn)行比對(duì)分析。將獲得的陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pETb12-scFv。

1.2.3 重組b12-scFv蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pETb12-scFv轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 StarTM(DE3)原核表達(dá)宿主感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取陽(yáng)性克隆至含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)過(guò)夜。將過(guò)夜菌液按體積比1∶50轉(zhuǎn)接入含50 μg/mL 卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，擴(kuò)大培養(yǎng)，37 ℃、250 r/min條件下培養(yǎng)至菌液OD600=0.6～1.0(大約需要2.5 h)，留取部分菌液做未誘導(dǎo)對(duì)照，其余菌液加入IPTG使其終濃度為0.5 mmol/L，在室溫下誘導(dǎo)4 h。誘導(dǎo)表達(dá)后將菌液于4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，收集菌體，用PBS (pH 7.4) 緩沖液懸浮。

用超聲破碎儀在冰浴條件下破碎懸浮菌體，超聲功率為30 W，超聲時(shí)間5 s，間隔時(shí)間5 s，破碎10 min。超聲破碎后，將裂解的菌液于4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，分別收集上清液和沉淀(沉淀用1/6 上清液體積的PBS緩沖液重懸)，加入2×蛋白上樣緩沖液，進(jìn)行100 g/L SDS-PAGE電泳，檢測(cè)蛋白表達(dá)及分布情況。

1.2.4 重組b12-scFv蛋白的親和純化 取1 mL固化Ni-NTA樹脂裝入層析柱中，樹脂沉降后的體積定義為1個(gè)柱床體積。用3倍柱床體積的無(wú)菌水沖洗樹脂，再加3倍柱床體積的結(jié)合緩沖液(20 mmol/L磷酸鈉，500 mmol/L氯化鈉，pH 7.8)平衡樹脂，然后將超聲波處理的細(xì)胞裂解液上清上柱，依次用6倍柱床體積的結(jié)合緩沖液、4倍柱床體積的洗滌緩沖液(20 mmol/L磷酸鈉，500 mmol/L氯化鈉，pH 6.0)分別洗柱，最后用50，100，200和300 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫結(jié)合蛋白，分步收集，每個(gè)濃度梯度收集約1.5 mL。將純化獲得的蛋白做梯度稀釋后，與已知濃度的蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比估測(cè)濃度，計(jì)算純化蛋白的產(chǎn)量。

1.2.5 重組b12-scFv蛋白與HIV-1 gp120結(jié)合活性的ELISA檢測(cè) 真核分泌表達(dá)的HIV-1 gp120蛋白的制備方法如文獻(xiàn)[11]所述。用包被緩沖液(0.05 mol/L Na2CO3，0.05 mol/L NaHCO3，pH 9.6)稀釋HIV-1 gp120蛋白(稀釋度1∶10)，將稀釋的HIV-1 gp120蛋白溶液加入96孔酶標(biāo)板中，每孔100 μL，4 ℃包被過(guò)夜。TBST(含1 mL/L Tween-20的TBS)洗板3次，每次5 min；每孔加入100 μL含50 g/L脫脂奶粉的TBST,于37 ℃封閉2 h，TBST洗板3次，每次5 min；每孔加入100 μL 2倍倍比稀釋(從1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64，1/128，1/256，總共8個(gè)質(zhì)量濃度梯度，初始蛋白質(zhì)量濃度為250 μg/mL)的待測(cè)b12-scFv，每個(gè)稀釋度做2個(gè)復(fù)孔，37 ℃孵育2 h，同時(shí)設(shè)立不加單鏈抗體的陰性對(duì)照，TBST洗板3次，每次5 min。然后加入100 μL抗組氨酸(His)標(biāo)簽鼠單克隆抗體(稀釋度1∶1 000)，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次5 min；再加入100 μL HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(稀釋度1∶2 000)，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次5 min。最后加入TMB顯色底物，顯色5 min后，加2 mol/L H2SO4終止顯色，450 nm測(cè)定吸光值(OD450)。

1.2.6 重組b12-scFv蛋白與HIV-1 gp120結(jié)合活性的熒光顯微鏡觀察和流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè) 細(xì)胞表面錨定表達(dá)有HIV-1 gp120的Sf9細(xì)胞的獲得方法參見文獻(xiàn)[12]，以不表達(dá)HIV-1 gp120的Sf9細(xì)胞作為陰性對(duì)照。1 000 r/min離心15 min收集細(xì)胞，用重組b12-scFv蛋白(稀釋度1∶50)室溫孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min；然后加入抗組氨酸(His)標(biāo)簽鼠單克隆抗體(稀釋度1∶200)，室溫孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min；再加入FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(稀釋度1∶100)，室溫孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min；最后加入40 g/L多聚甲醛固定10 min后，1 000 r/min離心15 min收集沉淀，用PBS (pH 7.4) 緩沖液懸浮，在熒光顯微鏡下觀察。

流式細(xì)胞分析使用CyFlow?Cube 6型流式細(xì)胞儀，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，綠色熒光信號(hào)在FL1通道檢測(cè)(發(fā)射波長(zhǎng)530 nm)，收集數(shù)據(jù)使用CyView 8.5 軟件。每個(gè)樣品至少使用4×104個(gè)細(xì)胞收集數(shù)據(jù)，離線數(shù)據(jù)分析用FCS Express 4軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 b12-scFv基因的合成

PCR擴(kuò)增獲得的輕鏈和重鏈基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，得到約400 bp的特異性條帶(圖1-A，B)，片段長(zhǎng)度與預(yù)期結(jié)果相符。重疊PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCR產(chǎn)物有非特異擴(kuò)增條帶和拖尾現(xiàn)象，但最主要的擴(kuò)增條帶長(zhǎng)約768 bp(圖1-C)，與預(yù)期的b12-scFv基因全長(zhǎng)相符。

圖1 b12-scFv基因的PCR擴(kuò)增

2.2 重組質(zhì)粒pETb12-scFv的鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切后，經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，可檢測(cè)到除載體片段外，還有1條約800 bp的插入片段(圖2)，長(zhǎng)度與預(yù)期相符，表明目的基因已成功插入表達(dá)載體中。測(cè)序結(jié)果證實(shí)，pETb12-scFv的大小、讀碼框均正確，表明克隆得到了正確的重組質(zhì)粒。

2.3 b12-scFv的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析

用重組質(zhì)粒pETb12-scFv轉(zhuǎn)化BL21 StarTM(DE3)菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4 h后，超聲破碎，100 g/L SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果(圖3)表明，破碎全菌、破碎上清液和沉淀均出現(xiàn)1條分子質(zhì)量約為29 ku的條帶，其大小與b12-scFv蛋白理論值相符，而未誘導(dǎo)對(duì)照則沒有該條帶，表明目的蛋白得到了表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物大部分在上清液中，以可溶性蛋白形式存在，也有少部分以包涵體的形式存在。

圖2 重組質(zhì)粒pETb12-scFv的NcoⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定

2.4 b12-scFv蛋白的親和純化

采用Ni-NTA親和柱純化上清液中的可溶性蛋白，依次用50，100， 200和300 mmol/L咪唑洗脫緩沖液洗脫結(jié)合蛋白，分步收集，取部分洗脫蛋白樣品加入2×蛋白上樣緩沖液，100 g/L SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果(圖4)顯示，大量目的蛋白存在于200和300 mmol/L咪唑洗脫組分中。將這2個(gè)洗脫組分合并，從300 mL培養(yǎng)液菌體中純化獲得了總體積為3 mL的b12-scFv蛋白；取純化蛋白小樣進(jìn)行梯度稀釋，與已知濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比，估測(cè)其質(zhì)量濃度約為0.2 mg/mL。通過(guò)計(jì)算得出純化蛋白的產(chǎn)量約為2 mg/L。

圖4 單鏈抗體b12-scFv表達(dá)產(chǎn)物的純化

2.5 b12-scFv與HIV-1 gp120結(jié)合活性的ELISA檢測(cè)

ELISA檢測(cè)結(jié)果(圖5)表明，當(dāng)b12-scFv的稀釋度達(dá)到1/64，即蛋白質(zhì)量濃度約為4 μg/mL時(shí)，其OD450數(shù)值仍為陰性對(duì)照的2.1倍以上，可以認(rèn)為其為陽(yáng)性， 表明b12-scFv與HIV-1 gp120具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。

圖5 b12-scFv與HIV-1 gp120結(jié)合活性的ELISA檢測(cè)

2.6 b12-scFv與HIV-1 gp120蛋白結(jié)合活性的熒光觀察及流式細(xì)胞儀檢測(cè)

在熒光顯微鏡下可觀察到，表達(dá)HIV-1 gp120的細(xì)胞表面發(fā)綠色熒光(圖6-A，B)。FCM檢測(cè)結(jié)果顯示，表達(dá)HIV-1 gp120的細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯高于不表達(dá)HIV-1 gp120的對(duì)照細(xì)胞(圖6-C)，說(shuō)明b12-scFv可以特異性地識(shí)別細(xì)胞膜表面的HIV-1 gp120。

圖6 b12-scFv與細(xì)胞膜表面表達(dá)的HIV-1 gp120蛋白結(jié)合活性的檢測(cè)

3 討 論

用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛋白具有成本低、表達(dá)效率高等特點(diǎn)[12]，scFv一般都采用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得。盡管大腸桿菌不能進(jìn)行糖基化修飾，但這對(duì)scFv的表達(dá)沒有影響，因?yàn)閟cFv沒有抗體穩(wěn)定區(qū)，不需要糖基化來(lái)獲得生物學(xué)活性。但是由于scFv是將抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)人為拼接獲得的重組蛋白，在高效的原核表達(dá)系統(tǒng)中往往以不溶性的包涵體形式存在，需要在變性劑存在的條件下溶解、純化，然后經(jīng)復(fù)性才能得到可溶性的具有抗原結(jié)合能力的單鏈抗體蛋白，而經(jīng)過(guò)變性、復(fù)性過(guò)程獲得的單鏈抗體一般產(chǎn)量較低，活性也會(huì)受到影響。已有的文獻(xiàn)報(bào)道，b12的scFv也是從包涵體中經(jīng)溶解、純化和復(fù)性獲得的[13]。本研究采用化學(xué)合成的方法獲得了b12抗體重鏈和輕鏈的基因序列，用重疊PCR的方法拼接得到了b12-scFv基因，利用原核表達(dá)系統(tǒng)，在室溫和IPTG終濃度為0.5 mmol/L的條件下，誘導(dǎo)表達(dá)的b12-scFv主要以可溶性蛋白的形式存在，從1 L培養(yǎng)液中能純化獲得大約2 mg可溶性蛋白。純化的蛋白具有良好的HIV-1 gp120結(jié)合活性。降低誘導(dǎo)溫度與IPTG的濃度，延長(zhǎng)表達(dá)時(shí)間，可能有助于增加可溶性蛋白的產(chǎn)量，最佳的表達(dá)條件有待于進(jìn)一步研究。

本研究中報(bào)道的b12單鏈抗體可溶性較好，表達(dá)量較高，純化過(guò)程簡(jiǎn)單，抗原結(jié)合能力好。用基因工程的方法在體外大量制備該抗體，可用于艾滋病的被動(dòng)免疫防治[14]；在基于包膜蛋白的HIV-1重組疫苗的設(shè)計(jì)中，可用于b12抗原表位的檢測(cè)，在HIV-1的被動(dòng)免疫治療和免疫原檢測(cè)中具有一定的應(yīng)用前景。

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