早酥梨及其紅色芽變Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的克隆與分析

周 鵬，仇宗浩，翟 銳，梁 東，徐凌飛

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，陜西 楊凌712100)

反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是植物基因組中可以自由移動的基因片段，轉(zhuǎn)座子通過DNA-RNA-DNA的方式，發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄后整合到基因組中的新位點，可以影響其他基因的表達(dá)和基因組的變化，創(chuàng)造穩(wěn)定的插入突變[1-2]。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在植物基因組分析[3]、連鎖作圖[4]、系統(tǒng)進(jìn)化[5-6]及生物多樣性研究[7]等方面具有廣泛的應(yīng)用前景。逆轉(zhuǎn)錄酶是反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座的重要調(diào)控因子，其序列的保守性影響著轉(zhuǎn)座的發(fā)生。

迄今為止，已有許多反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在果樹中被分離和鑒定，用以研究其對果樹基因組組成、系統(tǒng)進(jìn)化以及基因表達(dá)調(diào)控方面的重要作用[8-10]。孫俊等[11]應(yīng)用改良的Pearce方法，分離了蘋果Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RNaseH-LTRs序列；Tao等[12]發(fā)現(xiàn)，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是導(dǎo)致柑橘基因組突變和進(jìn)化的重要原因，芽變的逆轉(zhuǎn)錄酶序列存在移框、缺失等多種突變情況；Rico-Cabanas等[13]首次從柑橘中獲得完整的copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子CIRE1，并發(fā)現(xiàn)其在根中特異表達(dá)。另有研究表明，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的插入導(dǎo)致果樹性狀發(fā)生了改變，如Harada等[14]研究發(fā)現(xiàn)，蘋果一個耐貯藏突變品種可能是ACC合成酶基因啟動子-781 bp處插入了一個162 bp的類似反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子片段所致；Yao等[15]研究發(fā)現(xiàn)，RaeIme等單性結(jié)實的蘋果芽變是由于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入MdPI基因內(nèi)含子影響其表達(dá)而產(chǎn)生的性狀；Kobayashi等[16]研究表明，紅皮葡萄芽變Ruby Okuyama和Flame Muscaty，分別是由Gret1反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入白皮葡萄Italia和Muscat of Alexandria的Vvmyb1基因中所致。Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶具有異質(zhì)性和高拷貝的特點，已經(jīng)在火龍果[17]、蘋果[18]、草莓[19]、黃瓜[20-21]、白菜[22]等植物中得到驗證。目前，只有Shi等[23]和Kim等[24]對日本梨Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子進(jìn)行了鑒定分析，但從梨母本和芽變基因組中分離逆轉(zhuǎn)錄酶序列并進(jìn)行分析的研究卻鮮見報道。本研究擬從早酥梨及其紅色芽變基因組中克隆Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列，并運用生物信息學(xué)技術(shù)對其進(jìn)行對比分析，以期通過研究Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子探索早酥梨與其紅色芽變的遺傳關(guān)系，進(jìn)而為早酥梨的遺傳進(jìn)化提供信息支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

以白梨品種“早酥”及其紅色芽變?nèi)~片為試材，2011-04從西北農(nóng)林科技大學(xué)梨種質(zhì)資源圃采集幼葉，立即用液氮速凍后，-70 ℃保存?zhèn)溆?。試驗在農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室進(jìn)行。采用改良的SDS酚法提取葉片總DNA[25]，用8 g/L瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000(Thermo)儀器檢測DNA質(zhì)量濃度和純度。用TE緩沖液稀釋DNA至100 ng/μL，保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.2 逆轉(zhuǎn)錄酶序列的克隆

根據(jù)Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶保守基序Ⅰ(TAFLHG)和Ⅲ(YVDDML)設(shè)計擴(kuò)增基因片段的簡并引物[26]，上游引物NM1的序列為5′-ACNGCNTTPyPyTNCAPyGG-3′，下游引物NM2的序列為5′-APuCATPuTCPuTCNACPuTA-3′，其中N=A+T+C+G，Pu=A+G，Py=T+C。

PCR反應(yīng)體系25 μL：10×TaqBuffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL，5 U/μLTaq聚合酶(Fermentas) 0.2 μL，10 μmol/L引物各1 μL，ddH2O補(bǔ)足至25 μL。以早酥梨DNA為模板，建立并優(yōu)化梨Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列的PCR反應(yīng)體系。將PCR反應(yīng)體系中的MgCl2、dNTP、引物、Taq酶等成分設(shè)置不同的用量(表1)，當(dāng)一種成分的用量發(fā)生改變時，保持其他成分用量不變，通過擴(kuò)增效率的對比分析確定各成分的最佳用量。

表1 早酥梨Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列PCR體系的優(yōu)化

PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性1 min，設(shè)置不同的退火溫度(45.9，47.5，49.5，51.5，53.2，55.0，57.0 ℃)復(fù)性50 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。整個反應(yīng)在Life-Express PCR反應(yīng)儀中完成。PCR產(chǎn)物用15 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄酶序列的獲得及分析

在紫外燈下對凝膠拍照后，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Biomiga)回收目的片段，與pGM-T (TIANGEN)載體于16 ℃連接8～10 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂于含有Amp/X-gal/IPTG 的LB 固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)后，挑取白色克隆，在含有100 mg/L氨芐青霉素的 LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將每個經(jīng)過檢測的陽性克隆分裝成2個，送往北京奧科鼎盛生物科技有限公司利用T7或SP6引物測序，獲得目的基因序列。

在NCBI網(wǎng)站對測序結(jié)果進(jìn)行BLASTN，用BLASTX程序進(jìn)行同源比對，搜索庫中已知物種的逆轉(zhuǎn)錄酶序列，利用DNAStar軟件對序列進(jìn)行聚類分析，用Mega 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄活性的檢測

采用改良的SDS酚法提取葉片RNA，利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)試劑盒去除基因組DNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，分別以RNA和cDNA為模板PCR擴(kuò)增Actin(GU830958)基因用以檢測樣品質(zhì)量。以cDNA為模板，利用已經(jīng)優(yōu)化好的體系擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄酶序列，檢測早酥梨及其紅色芽變Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 早酥梨逆轉(zhuǎn)錄酶序列PCR擴(kuò)增體系的建立與優(yōu)化

以早酥梨DNA為模板，根據(jù)表1將PCR反應(yīng)體系中的MgCl2、dNTP、引物、Taq酶等成分設(shè)置不同用量進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同組分PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增早酥梨逆轉(zhuǎn)錄酶的檢測結(jié)果

由圖1可以看出，不同的PCR擴(kuò)增體系中，隨組分及用量的變化，PCR擴(kuò)增效率亦會隨之改變。隨著dNTP用量的增加，PCR產(chǎn)物增多，以1.2 μL dNTP時的擴(kuò)增產(chǎn)物最多；雖然取用0.3 μLTaq酶時逆轉(zhuǎn)錄酶的擴(kuò)增效率較高，但同時出現(xiàn)了非特異性產(chǎn)物，故選用0.2 μLTaq酶進(jìn)行擴(kuò)增；不同的引物用量對逆轉(zhuǎn)錄酶序列的擴(kuò)增也有影響，隨著引物用量增大擴(kuò)增產(chǎn)物減少，故確定引物用量為0.8 μL；當(dāng)MgCl2用量為 1.5 μL時，擴(kuò)增產(chǎn)物具有特異性。所以，經(jīng)過優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系為：10×TaqBuffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.2 μL，5 U/μLTaq聚合酶0.2 μL，10 μmol/L 引物各0.8 μL。

同時，為進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)程序，設(shè)置不同的退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增試驗，結(jié)果(圖2)顯示，不同退火溫度時的PCR擴(kuò)增效率不同，51.5 ℃為逆轉(zhuǎn)錄酶PCR擴(kuò)增體系的最佳退火溫度。

圖2 退火溫度對早酥梨逆轉(zhuǎn)錄酶PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響

2.2 早酥梨及其紅色穿變逆轉(zhuǎn)錄酶的擴(kuò)增與檢測

利用優(yōu)化后的PCR體系在早酥梨及其紅色芽變基因組中都能得到擴(kuò)增產(chǎn)物(圖3)，長度約為260 bp，從片段大小尚未看出二者有何差異。經(jīng)過測序比對，成功從早酥梨基因組中獲得45條逆轉(zhuǎn)錄酶序列，從芽變基因組中獲得60個克隆。所得序列中，除早酥梨2個序列的BLASTX比對結(jié)果與一種轉(zhuǎn)座酶相似外，其余序列均與Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列有很高的相似性。經(jīng)聚類分析，將小于200 bp的序列去掉，并將相同的序列歸為1個，最后按照順序，將所得的29條早酥梨Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列命名為PbRTzs1～PbRTzs29，將30條紅色芽變逆轉(zhuǎn)錄酶序列命名為PbRTyb1～PbRTyb30?，F(xiàn)已將59條序列全部提交到NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號見表2。

圖3 早酥梨及其紅色芽變逆轉(zhuǎn)錄酶序列的 PCR 擴(kuò)增

表2 早酥梨及其紅色芽變逆轉(zhuǎn)錄酶序列的組成

2.3 早酥梨及其紅色芽變Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的序列對比

從早酥梨及其紅色芽變基因組中克隆到的逆轉(zhuǎn)錄酶，序列大小與前人的報道一致[18,22]。其中，PbRTyb8和PbRTyb9的長度分別為272和274 bp，雖比較特殊，但在Voytas等[26]的研究中也有發(fā)現(xiàn)。從表2可以看出，早酥梨基因組中的逆轉(zhuǎn)錄酶序列大小為212～268 bp，AT/GC為1.12～1.61，而紅色芽變的逆轉(zhuǎn)錄酶序列大小為217～274 bp，AT/GC為1.12～1.90。將2組序列分別導(dǎo)入DNAStar軟件運用ClustalW[27]方法計算序列之間的差異性和同源性，結(jié)果顯示，早酥梨逆轉(zhuǎn)錄酶序列的差異度為0.4%～89.8%，相似性為48.3%～99.6%；其芽變逆轉(zhuǎn)錄酶序列之間的差異度為 1.5%～96.3%，相似性為45.8%～98.5%。2種材料逆轉(zhuǎn)錄酶序列的大小及堿基變化，反映了梨基因組中的Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶同樣具有異質(zhì)性特點。

利用DNAStar軟件將逆轉(zhuǎn)錄酶序列模擬合成氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)均不含內(nèi)含子。參考BLASTX比對結(jié)果中的Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列，對早酥梨及其紅色芽變逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果(圖4和圖5)發(fā)現(xiàn)，早酥梨Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶保守氨基酸的一致性為62.22%，芽變的一致性為53.30%，且均可以找到逆轉(zhuǎn)錄酶序列的3段保守區(qū)域“TAFLHG”、“KSLYGLKQ”、“LLYVDDM”以及相對保守的“QP”、“GF”片段。

對早酥梨及其紅色芽變逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列突變情況進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。由表3可知，各序列發(fā)生了不同種類的突變，主要包括終止子突變、缺失突變和替換突變。具體而言，早酥梨逆轉(zhuǎn)錄酶序列PbRTzs3由于堿基的替換，出現(xiàn)1個終止子突變(第46個氨基酸)，而且發(fā)生在“KSLYGLKQ”保守區(qū)域；序列PbRTzs19由于1個堿基的插入，導(dǎo)致后面的序列發(fā)生移框，出現(xiàn)了2個終止子突變(第16和86個氨基酸)；PbRTzs28第38個氨基酸發(fā)生缺失突變；PbRTzs1和PbRTzs4的保守區(qū)域均發(fā)生了1個氨基酸替換突變(L變?yōu)镕)，但未發(fā)現(xiàn)缺失突變和移框突變情況。而在紅色芽變的逆轉(zhuǎn)錄酶序列中，由于堿基替換序列PbRTyb7(第80個氨基酸)、PbRTyb14(第15個氨基酸)、PbRTyb24(第54個氨基酸)、PbRTyb25(第30個氨基酸)存在1個終止子突變，同時序列PbRTyb7由于堿基的替換導(dǎo)致后面序列的移框突變，PbRTyb4(第41和46個氨基酸)存在2個終止子突變，PbRTyb15(第53，55和61個氨基酸)、PbRTyb26(第53，55和61個氨基酸)存在3個終止子突變，PbRTyb9(第9，33，53，67和73個氨基酸)、PbRTyb17(第39，57，78，81和84個氨基酸)、PbRTyb19(第64，65，70，76和84個氨基酸)序列存在5個終止子突變；PbRTyb9序列由于第37位堿基“A”的插入，導(dǎo)致后面序列發(fā)生移框突變，PbRTyb7由于缺失突變(第71個氨基酸處)導(dǎo)致隨后的序列發(fā)生移碼喪失基因功能，PbRTyb27由于第153處單堿基的插入導(dǎo)致后面的序列發(fā)生了移框突變；PbRTyb15(第51個氨基酸開始)、PbRTyb17(第33個氨基酸)、PbRTyb19(第63個氨基酸處)序列同樣發(fā)生了缺失突變；PbRTyb1(第1個氨基酸)、PbRTyb4(第34個氨基酸)、PbRTyb6(第4個氨基酸)、PbRTyb9(第34個氨基酸)、PbRTyb11(第4個氨基酸)、PbRTyb17(第34個氨基酸)、PbRTyb19(第34個氨基酸)都發(fā)生了替換突變。由此推測，逆轉(zhuǎn)錄酶序列的異質(zhì)性是由于終止子突變、缺失突變、替換和移框突變造成的，并且紅色芽變的變異程度明顯高于早酥梨。

圖5 早酥梨紅色芽變Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列的同源性比較

表3 早酥梨及其紅色芽變逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列突變情況的比較

2.4 早酥梨及其紅色芽變逆轉(zhuǎn)錄酶基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹

為探明早酥梨基因組中克隆得到的59條序列之間的關(guān)系，利用Mega 5.0軟件以Kimura 2-parameter算法，采用鄰接法構(gòu)建反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖6)。根據(jù)進(jìn)化樹分枝程度可將所有序列分為7個家族(Family 1～7)，代表了來自同一祖先的7個獨立的遺傳家系。其中家族1包括15條序列，家族2包括1條序列，家族3包括14條序列，家族4包括1條序列，家族5包括12條序列，家族6包括2條序列，家族7包括14條序列。

通過進(jìn)化樹分析，可以找到親緣關(guān)系相近的早酥梨及其紅色芽變的逆轉(zhuǎn)錄酶序列。在各家族的核苷酸序列當(dāng)中，都有不同程度的突變情況發(fā)生。第1家族的序列主要來自于早酥梨，第5家族的序列主要來自于紅色芽變，而在第3和第7家族中，早酥梨和紅色芽變的逆轉(zhuǎn)錄酶序列各占1/2，第2、第4和第6家族所包含的序列較少且均來自于紅色芽變材料，這3類與其余家族序列的遺傳距離較大，而且第6家族的PbRTyb15和PbRTyb26均是含有3個終止子突變的序列。在這些家族中，由于缺失突變造成序列嚴(yán)重不完整，可能已經(jīng)不具有轉(zhuǎn)錄活性。

為研究早酥梨與其他物種Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的進(jìn)化關(guān)系，從NCBI網(wǎng)站上下載參考序列，包括蘋果(Malus×domestica)ABD76549.1、擬南芥(Arabidopsisthaliana)AAF02855.1、鷹嘴豆(Cicerarietinum)CAD59770.1、柑橘(Citrussinensis)CAJ09951.2、果蠅(Drosophilamelanogaster)CAD27357.1、番薯(Ipomoeabatatas)AAV88069.1、粳稻(OryzasativaJaponica Group)ABA98656.1、楊(Populusdeltoides)CAC95126.1、李(Prunusmume)ACZ36927.1、豇豆(Vignaradiata)AAT90460.1、茄屬(Solanumchilense)AAK29467.1、煙草(Tobacco)P10978.1和玉米(Zeamays)T02087。從每個家族中各選取早酥梨及其紅色芽變的逆轉(zhuǎn)錄酶序列與其他植物建立進(jìn)化樹，結(jié)果見圖7。從圖7可以看出，早酥梨不同家族的逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列與其他物種的遺傳距離為0.023～1.020。第1，2，4，5和6家族與其他物種的遺傳距離較遠(yuǎn)，第3家族的序列與擬南芥(Arabidopsisthaliana)AAF02855.1的序列和玉米(Zeamays)T02087的序列遺傳距離較近；第7家族的氨基酸序列與蘋果(Malus×domestica)和李(Prunusmume)的進(jìn)化關(guān)系非常近，PbRTzs6與二者的遺傳距離分別為 0.023 和 0.035，PbRTyb11與二者的遺傳距離分別為0.083和0.095。不同逆轉(zhuǎn)錄酶序列與不同物種遺傳距離的差異，可能是由于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在進(jìn)化過程中發(fā)生橫向傳遞所致。

圖6 早酥梨及其紅色芽變Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖7 早酥梨及其紅色芽變與其他植物Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶氨基酸序列的進(jìn)化樹

2.5 早酥梨及其紅色芽變Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄活性的檢測

由圖8可知，Actin內(nèi)參基因在早酥梨及其紅色芽變中擴(kuò)增條帶明亮、無雜帶，說明反轉(zhuǎn)錄合成的品質(zhì)很好；以RNA為模板無任何擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生，說明DNA雜質(zhì)去除徹底。以cDNA為模板擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄酶序列，則無擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，說明Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在早酥梨及其紅色芽變植物中已經(jīng)失去轉(zhuǎn)錄活性，從而穩(wěn)定地存在于植物基因組中。

圖8 早酥梨及其紅色芽變Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄活性的檢測

3 討 論

Liu等[28]利用早酥梨及其紅色芽變材料構(gòu)建SSH文庫，發(fā)現(xiàn)了與蘋果(NCBI Accession No.AEX97092.1)、麝香百合(NCBI Accession No.ABM68560.1)和水稻(NCBI Accession No.ABA95643.1)Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子具有較高同源性的EST序列(NCBI Accession No.HO774934)，并以此為切入點探索反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子與芽變發(fā)生的關(guān)系。前人對蘋果[15]、葡萄[16]等果樹芽變機(jī)理的研究結(jié)果，已為反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入是果樹芽變的重要原因提供了一些證據(jù)。已有大量相關(guān)報道指出，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在植物基因組中發(fā)生轉(zhuǎn)座，是對各種生物或非生物逆境的響應(yīng)[29-30]。

本研究建立并優(yōu)化了逆轉(zhuǎn)錄酶的PCR擴(kuò)增體系，并成功從早酥梨及其紅色芽變基因組中分離克隆了反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列。序列分析顯示，堿基替換、插入、缺失所導(dǎo)致的突變，是其具有很高異質(zhì)性的重要原因，與其他物種逆轉(zhuǎn)錄酶序列的特點相似[20,22,31]。這可能是由于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座時，逆轉(zhuǎn)錄酶無錯讀校對功能，從而在轉(zhuǎn)座過程中易發(fā)生高頻突變造成的[30]。另外，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子之間的同源重組也是導(dǎo)致反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子變異的原因之一[32]。

對逆轉(zhuǎn)錄酶序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)紅色芽變逆轉(zhuǎn)錄酶序列突變的復(fù)雜程度明顯高于早酥梨，以致大多序列都已經(jīng)不具有轉(zhuǎn)錄活性。由于在反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座過程時，序列很容易突變喪失活性，所以這可作為早酥梨紅色芽變反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子發(fā)生了轉(zhuǎn)座的證據(jù)。序列突變導(dǎo)致反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子喪失活性是有積極意義的，可以保證物種的穩(wěn)定遺傳。植物一方面抑制反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座，防止產(chǎn)生致死突變；另一方面，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在逆境中的不斷轉(zhuǎn)座為基因組的多樣性和遺傳變異奠定了基礎(chǔ)[25]。

利用軟件建立進(jìn)化樹，分析早酥梨及紅色芽變的逆轉(zhuǎn)錄酶序列與其他物種逆轉(zhuǎn)錄酶序列的進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)只有個別序列(家族7)與蘋果和李具有較近的遺傳距離，甚至小于同一物種逆轉(zhuǎn)錄酶序列之間的遺傳距離，這可能是反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子橫向傳遞的結(jié)果，不同物種可能來自于同一祖先，而縱向傳遞的不穩(wěn)定性導(dǎo)致同一物種的序列產(chǎn)生了較大的差異。

4 結(jié) 論

本研究利用簡并引物首次從早酥梨及其紅色芽變基因組中成功克隆了Ty1-copia反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子逆轉(zhuǎn)錄酶序列。序列分析結(jié)果表明，二者的逆轉(zhuǎn)錄酶序列都具有高拷貝數(shù)和異質(zhì)性的特點，這主要是由于終止子突變、缺失突變和移框突變所致，而且紅色芽變的逆轉(zhuǎn)錄酶序列的突變情況更為復(fù)雜。根據(jù)進(jìn)化樹分析可知，早酥梨及其紅色芽變與蘋果和李具有很近的遺傳距離，這可能是反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子橫向傳遞的結(jié)果。

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