僵蠶乙醇提取物對HearNPV的增效作用研究

張瑞鳳，馬 賀，趙思楠，牛敏敏，邢瑩瑩，王 敦

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室, 陜西 楊凌 712100)

僵蠶 (Bombyxbatryticatus)是蠶蛾科(Bombycidae)昆蟲家蠶(Bombyxmori)幼蟲感染白僵菌(Beauveriabassiana(Bals.) Vuill.) 后僵死的干燥全蟲，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有退熱、止咳、化痰、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)驚、消腫等功效，可用于癲癇、高熱驚厥、流行性腮腺炎、上呼吸道感染、遺尿等癥的治療[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，僵蠶具有抗驚厥、抗感染、抑瘤、降血糖和降血脂等作用[3-5]。曹軍等[6]還發(fā)現(xiàn)，僵蠶乙醇提取物對棉鈴蟲幼蟲具有很強的胃毒作用，且其殺蟲作用與試蟲中腸堿性磷酸酶(ALP)活性被抑制有關(guān)。

害蟲中腸的ALP是Bt毒素蛋白結(jié)合至中腸的靶點之一，在Bt毒素蛋白對昆蟲中腸圍食膜結(jié)構(gòu)造成破壞的過程中發(fā)揮著重要作用[7]。眾所周知，昆蟲病毒作為專一性非常強的病原微生物，其對昆蟲的感染均通過突破昆蟲中腸防御而實現(xiàn)，侵染效率高低與宿主昆蟲中腸的防御功能密切相關(guān)。HearNPV感染棉鈴蟲的過程中，病毒成功感染后即對宿主ALP基因的表達及ALP的活性產(chǎn)生明顯抑制，從而利于病毒的進一步侵染和增殖[8]?；诮┬Q乙醇提取物對ALP的抑制作用，嘗試利用僵蠶乙醇提取物來降低害蟲中腸防御能力、提高病毒毒力。為此，本研究將僵蠶乙醇提取物添加到病毒制劑中，分析其在病毒感染棉鈴蟲過程中的增效作用，以期為今后深入研究生物源病毒增效劑和研發(fā)相關(guān)增效劑產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒與試蟲

棉鈴蟲核型多角體病毒(HearNPV)由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院分子病毒學(xué)實驗室提供。棉鈴蟲(H.armigera)購自河南省濟源白云實業(yè)有限公司。

1.2 僵蠶及其提取物

僵蠶(產(chǎn)地：江蘇)購自西安藥材公司，將僵蠶揀選除雜，然后置于60 ℃干燥箱中恒溫干燥8 h，取出后粉碎過篩(孔徑0.25 mm)，混合均勻，稱量，備用。體積分數(shù)95%乙醇僵蠶乙醇提取物(簡稱BB extract)采用冷浸提取法提取，提取過程均保持常溫常壓條件，具體步驟參考曹軍等[6]的方法，制備的浸膏干燥后溶解于丙酮中作為后續(xù)生測的母液。

1.3 生物測定

在HearNPV病毒懸浮液(5×105PIB/mL)中分別添加質(zhì)量濃度為20，40，60和80 μg/mL的僵蠶乙醇提取物，添加濃度均低于亞致死質(zhì)量濃度 0.5 mg/mL[6]；以相同滴度病毒懸浮液中加等體積的僵蠶乙醇提取物溶劑(丙酮和無菌水)為對照CK。每個質(zhì)量濃度處理重復(fù)3次，每處理60頭3齡棉鈴蟲，即每個質(zhì)量濃度計180只試蟲，共計900只試蟲。挑選大小接近、2齡末期蛻皮后的棉鈴蟲饑餓12 h，分別用滴加2 μL不同處理病毒懸浮液的飼料塊(約2 mm3)喂食。待完全取食后，補充新鮮的無毒人工飼料喂養(yǎng)；剔除未完全取食給毒飼料塊的試蟲，確保試驗組每重復(fù)有效試蟲達50只。逐日統(tǒng)計死亡率，試驗結(jié)束后計算各組的LT50和LT90。

1.4 ALP活性測定

1.3節(jié)中各處理組幼蟲取食完全帶毒飼料換為新鮮無毒飼料后，即按感染后計時。在感染病毒后12，24 h分別隨機取試蟲10只，取出中腸后冰浴勻漿，制備粗酶液用于測定ALP活性，具體操作參照于歡等[8]的方法進行。按不同處理組且每組3個重復(fù)分別求出每個單獨處理的ALP活性，最后計算不同處理組的平均值。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有測定數(shù)據(jù)應(yīng)用DPS軟件[9]進行分析，計算校對死亡率和LT50、LT90值，并進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 HearNPV添加僵蠶乙醇提取物對棉鈴蟲致死率的影響

由表1可以看出，試蟲感染HearNPV病毒后第4天，僵蠶乙醇提取物的質(zhì)量濃度達到40 μg/mL，即可產(chǎn)生顯著的增效作用，試蟲的校正死亡率超過20%。從HearNPV病毒感染試蟲第5天起，20 μg/mL的僵蠶乙醇提取物即表現(xiàn)出明顯的增效作用，導(dǎo)致試蟲的校正死亡率超過50%，與CK相比差異顯著(P≤0.05)；當(dāng)僵蠶乙醇提取物的質(zhì)量濃度高于40 μg/mL，飼毒第5天導(dǎo)致試蟲的校正死亡率上升至60%以上，與CK相比差異極顯著(P≤0.01)。在HearNPV病毒感染試蟲第6天，添加40～80 μg/mL僵蠶乙醇提取物均可使試蟲的校正死亡率達90%以上，而CK的死亡率只有67.9%，差異均達極顯著水平(P≤0.01)；感染HearNPV病毒第7天，除對照外，所有僵蠶乙醇提取物劑量都能夠使試蟲死亡率達到90%以上，而對照的死亡率只有85.7%，表明僵蠶乙醇提取物對HearNPV具有顯著的增效作用。

表1 僵蠶乙醇提取物對HearNPV的增效作用

2.2 HearNPV添加僵蠶乙醇提取物對棉鈴蟲致死時間的影響

為了進一步明確僵蠶乙醇提取物對棉鈴蟲核型多角體病毒的增效作用，本研究分析了僵蠶乙醇提取物對HearNPV LT50、LT90的影響。表2顯示，與對照相比，在各僵蠶乙醇提取物添加組，HearNPV病毒對試蟲的毒力均有所提高，LT50值與CK相比存在顯著差異，20 μg/mL劑量組的LT50值較對照縮短16.1%，最高劑量80 μg/mL的LT50較對照縮短了23.2%。僵蠶乙醇提取物添加組的LT90值與對照HearNPV病毒組相比差距進一步加大，60和80 μg/mL劑量組的LT90值較對照縮短了27.8%，差異達極顯著水平(P≤0.01)。以上結(jié)果表明，僵蠶乙醇提取物能夠顯著縮短HearNPV病毒的LT50和LT90值，對HearNPV有極顯著的增效作用(P≤0.01)。

表2 僵蠶乙醇提取物對HearNPV LT50和LT90的影響

2.3 HearNPV添加僵蠶乙醇提取物對棉鈴蟲ALP活性的影響

從圖1可知，棉鈴蟲感染HearNPV后12 h，與CK相比，添加40 μg/mL的僵蠶乙醇提取物可導(dǎo)致試蟲中腸ALP活性顯著下降(P<0.05)，隨著僵蠶乙醇提取物劑量的增加，ALP活性下降程度加劇，在80 μg/mL劑量下ALP活性較CK極顯著下降(P<0.01)。

圖1 僵蠶提取物與HearNPV共同作用對棉鈴蟲ALP活性的影響

圖1顯示，在試蟲感染HearNPV后24 h，與CK相比，僵蠶乙醇提取物添加組ALP活性均顯著下降(P<0.05)，40 μg/mL以上的劑量導(dǎo)致試蟲中腸ALP活性極顯著下降(P<0.01)。說明棉鈴蟲在受HearNPV感染過程中，添加僵蠶乙醇提取物能夠顯著降低試蟲中腸的ALP活性，且ALP活性的降低程度隨感染時間的延長進一步加大。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

在HearNPV病毒懸浮液濃度為5×105PIB/mL 時，僵蠶乙醇提取物對棉鈴蟲核型多角體病毒具有顯著的增效作用，能夠顯著提高病毒的毒力，40 μg/mL的劑量水平就能使病毒感染試蟲第6天的死亡率達到90%，第7天的死亡率達到100%。

本研究表明，20 μg/mL劑量的僵蠶乙醇提取物就能夠顯著提高HearNPV病毒的毒力、縮短病毒對棉鈴蟲的致死時間， 其LT50和LT90值分別較對照縮短16.1%和20.3%；在80 μg/mL的劑量水平下，LT50和LT90值分別較對照縮短23.2%和27.8%，說明僵蠶乙醇提取物能夠顯著縮短病毒對害蟲的致死時間。

棉鈴蟲在受病原病毒感染過程中，添加僵蠶乙醇提取物能夠顯著降低試蟲中腸ALP的活性，40 μg/mL以上的劑量可導(dǎo)致試蟲中腸ALP活性較對照極顯著下降，且ALP活性的降低程度隨感染時間的延長進一步加大。僵蠶乙醇提取物對HearNPV的增效作用與其對棉鈴蟲中腸ALP活性的抑制作用一致，說明僵蠶乙醇提取物對HearNPV的增效作用機理可能與其對試蟲中腸ALP活性的抑制作用相關(guān)，但確切作用途徑還有待進一步研究。

3.2 討 論

桿狀病毒在害蟲生物防治中的應(yīng)用始于20世紀40年代[10]，目前已經(jīng)有20余種桿狀病毒應(yīng)用于農(nóng)林害蟲生物防治[11-12]。昆蟲病毒作為生物殺蟲劑，能在害蟲種群中形成流行病而長期控制蟲口密度，因而昆蟲病毒殺蟲劑已經(jīng)受到人們越來越多的關(guān)注。然而，病毒殺蟲劑的應(yīng)用也存在一些弊端，最主要的是作用速度較慢、殺蟲效率較低，這大大束縛了病毒殺蟲劑的大面積生產(chǎn)應(yīng)用[11]。為此，如何通過增效劑的作用來提高天然昆蟲病毒的殺蟲效率成為昆蟲病毒研究的一個熱點。對于昆蟲病毒增效劑的研究，包括生物增效劑和化學(xué)增效劑兩個方面，但主要集中在生物增效劑中的病毒增強素及化學(xué)增效劑中的熒光增白劑上[13]。熒光增白劑等化學(xué)增效劑和化學(xué)農(nóng)藥一樣，存在環(huán)境污染的弊端，從而使其研發(fā)和使用受到限制，因此生物增效劑的研究近年來頗受關(guān)注[14-17]，包括來源于病毒自身的基因[18]、微生物多肽[19]等。本研究以僵蠶為對象，研究了其對昆蟲病毒的增效作用，與前人報道過的生物增效劑相比，僵蠶乙醇提取物與幾丁質(zhì)酶的增效作用類似，均能夠縮短病毒感染試蟲的致死時間，但在增效作用強度上略有不同：病毒感染后第5天，60 μg/mL 劑量的僵蠶乙醇提取物可導(dǎo)致棉鈴蟲的校正死亡率高達67.9%；而以病毒來源的幾丁質(zhì)酶[18]和細菌來源的幾丁質(zhì)酶[19]作為增效劑時，病毒感染后第5天棉鈴蟲的校正死亡率僅分別為49.4%和 48.6%，說明僵蠶乙醇提取物的增效作用與其他生物增效劑相比具有一定優(yōu)勢。盡管其作用機理尚不明確，但從ALP活性數(shù)據(jù)可以推測，僵蠶乙醇提取物的增效作用與其對試蟲中腸ALP活性的抑制作用相關(guān)。由于ALP是昆蟲中腸圍食膜上Bt毒素蛋白的作用靶標(biāo)之一，在Bt毒素蛋白對昆蟲中腸圍食膜結(jié)構(gòu)造成破壞的過程中發(fā)揮著重要作用[7]，因此僵蠶乙醇提取物對試蟲中腸ALP活性的抑制作用可能會導(dǎo)致害蟲中腸防御功能的削弱，從而提高病毒侵染的效率。

對于桿狀病毒而言，達到90%的死亡率通常需要7 d以上的時間，導(dǎo)致桿狀病毒使用受到一定的限制。本研究結(jié)果證明，僵蠶乙醇提取物能夠顯著縮短病毒對害蟲的致死時間，這無疑對提高病毒的防治效果、最大程度地挽回經(jīng)濟損失及促進昆蟲病毒的生物防治應(yīng)用具有重要的意義。同時，其也為將僵蠶作為病毒增效劑新材料提供了可能。

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