Cu(Ⅱ)對纖維蛋白原硝化影響的研究

史建龍，羅云敬，崔　爽，葉三仙，魯　緋

(1.北京工業(yè)大學生命科學與生物工程學院，北京 100124；2.北京市食品與釀酒產(chǎn)業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗一站，北京 100075)

纖維蛋白原是人體內(nèi)具有調(diào)節(jié)凝血、炎癥及組織修復功能的大分子糖蛋白，由3對非等同的多肽鏈α2β2γ2形成六聚體[1-2]。纖維蛋白原的損傷能夠增大血液黏滯度和細胞內(nèi)膽固醇的堆積、加速動脈粥樣硬化及其它心血管疾病的形成和發(fā)展[3-4]。纖維蛋白原的氧化會導致其α鏈間酪氨酸發(fā)生交聯(lián)[5]，金屬離子誘導的纖維蛋白原氧化修飾能誘發(fā)血纖維蛋白原異常癥，抑制血栓的形成[6-7]。

過氧亞硝酸根(ONOO-)是人體內(nèi)一種強氧化硝化細胞毒性物質(zhì)，能夠引發(fā)自由基鏈式反應[8]，對蛋白質(zhì)進行翻譯后修飾，引起一系列生理病理過程，最終導致癌癥[9]、帕金森癥、中風以及心血管疾病[10]。研究發(fā)現(xiàn)，一些金屬離子如Co(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)能夠催化ONOO-介導的纖維蛋白原硝化反應[11-12]。銅作為人體必需的微量元素，參與多種金屬酶的構(gòu)成，催化心血管基質(zhì)膠原蛋白的合成，對于維持心血管功能及凝血功能具有重要作用。

鑒于此，作者對Cu(Ⅱ)參與的ONOO-硝化損傷纖維蛋白原過程進行研究，采用衰減全反射傅立葉變換紅外光譜(ATR-FTIR)、SDS-PAGE電泳和馮克勞斯(Von Clauss)法對該過程中纖維蛋白原二級結(jié)構(gòu)以及凝聚活性的變化進行了分析。

1　實驗

1.1　試劑與儀器

纖維蛋白原、凝血酶，美國Sigma公司；蛋白Marker(board)，北京鼎國；ONOO-溶液，根據(jù)Uppu等[13]提出的兩相反應體系制備，-20 ℃保存?zhèn)溆?，實驗前用紫外分光光度計?02 nm處測定其吸光度，并根據(jù)ε302=1 670 L·mol-1·cm-1計算ONOO-濃度；其它試劑均為分析純；實驗用水為二次去離子水。

U3010型紫外分光光度計，日本日立公司；Vertex70型傅立葉變換紅外光譜儀，德國Bruker公司；J-KEM型平行合成儀，美國Thermo Scientific公司；DYY-12C型電泳儀，北京六一儀器廠。

1.2　纖維蛋白原的硝化

將纖維蛋白原溶于0.5 mol·L-1、pH值為7.4的Tris-HCl(含0.15 mol·L-1NaCl)緩沖溶液中。在比色管中分別加入3 mL濃度為3 mg·mL-1的纖維蛋白原溶液，然后加入不同量濃度為100 mmol·L-1的CuSO4溶液，使體系中Cu(Ⅱ)的終濃度(mmol·L-1)分別為0.00、0.17、0.30、0.50、0.67、0.83和1.66,37 ℃孵育5 min。將ONOO-以0.018 mmol·L-1·min-1的恒定速率注入到不斷攪拌的纖維蛋白原溶液中，37 ℃孵育30 min。

1.3　Cu(Ⅱ)對纖維蛋白原硝化的影響

1.3.1二級結(jié)構(gòu)變化實驗

將上述硝化后的纖維蛋白原溶液均勻地鋪滿ATR的ZeSe晶片，在4 cm-1分辨率、室溫敞開狀態(tài)下，掃描2 048次，采集紅外光譜。

同法采集纖維蛋白原溶液和緩沖溶液的紅外光譜。用纖維蛋白原溶液的紅外譜圖差減緩沖溶液的紅外譜圖，以差減譜圖在2 200～1 800 cm-1呈一條平滑直線作為終點。對差減譜圖在酰胺I帶(1 700～1 600 cm-1)內(nèi)進行兩點基線校正，采用9點Savits Golay函數(shù)平滑后，做二階導數(shù)和傅立葉去卷積。手動選定各子峰的峰位和峰寬，采用Gausse函數(shù)進行擬合，重復操作使殘差最小。當確定了各子峰與不同二級結(jié)構(gòu)的對應關系后，根據(jù)其積分面積計算各種二級結(jié)構(gòu)的相對百分含量。

1.3.2凝聚活性變化實驗

將凝血酶溶于0.05 mol·L-1的CaCl2溶液中，酶活力單位為0.5 U·mL-1。37 ℃孵育5 min后，向硝化后的纖維蛋白原反應溶液中以1∶1(體積比)的比例加入凝血酶，用帶鉤的小棒以一定速度上下鉤動溶液，當出現(xiàn)明顯纖維絲和凝聚塊時，記錄其凝聚時間，每個樣品重復測定3次[14]。

1.3.3SDS-PAGE電泳實驗

對硝化后的纖維蛋白原溶液進行SDS-PAGE電泳分析。電泳條件：采用8％的分離膠和5％的濃縮膠，加樣后，起始電壓設為80 V，待前沿指示到達分離膠后將電壓增加到120 V；當前沿指示距膠底端約1 cm時，切斷電源；染色1 h，脫色至背景色完全消失。

2　結(jié)果與討論

2.1　二級結(jié)構(gòu)變化實驗結(jié)果

2.1.1不同Cu(Ⅱ)濃度的硝化纖維蛋白原的紅外光譜(圖1)

由圖1可看出，硝化后的纖維蛋白原紅外光譜酰胺Ⅰ帶分別在1 657 cm-1、1 649 cm-1和1 644 cm-1處有吸收峰，酰胺Ⅱ帶在1 551 cm-1處有吸收峰，分別對應α-螺旋和無規(guī)卷曲。

對紅外光譜酰胺Ⅰ帶求二階導數(shù)，作平滑處理并進行差減，得到硝化纖維蛋白原酰胺Ⅰ帶紅外差減譜圖，如圖2所示。

a～g,Cu(Ⅱ)濃度(mmol·L-1)：0.00，0.17,0.30,0.50,0.67,0.83,1.66

a～g,Cu(Ⅱ)濃度(mmol·L-1)：0.00，0.17,0.30,0.50,0.67,0.83,1.66

由圖2可看出：隨著反應體系中Cu(Ⅱ)濃度由0.00 mmol·L-1增大到1.66 mmol·L-1，硝化纖維蛋白原殘基吸光度逐漸增大；二階求導并平滑處理前纖維蛋白原的峰形較平緩，處理后隨著Cu(Ⅱ)濃度的增加峰形越來越尖銳；酰胺Ⅰ帶的吸收峰由1 651 cm-1移動到了1 652 cm-1。

2.1.2不同濃度的Cu(Ⅱ)對硝化纖維蛋白原二級結(jié)構(gòu)的影響

硝化纖維蛋白原二級結(jié)構(gòu)的變化在一定程度上可以反映ONOO-對纖維蛋白原的損傷程度。定量分析顯示，天然纖維蛋白原中α-螺旋占38.03％、β-折疊占29.89％、β-轉(zhuǎn)角占12.6％、無規(guī)卷曲占15.84％，這與Azpiazu等[15]的研究結(jié)果一致。

不同Cu(Ⅱ)濃度下硝化纖維蛋白原二級結(jié)構(gòu)的變化見圖3。

由圖3可看出：不同濃度的Cu(Ⅱ)對硝化纖維蛋白原的二級結(jié)構(gòu)均有影響，但高濃度影響更明顯；隨著Cu(Ⅱ)濃度的增大，α-螺旋比例逐漸下降，β-折疊比例逐漸上升，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲比例僅發(fā)生較小的變化；當Cu(Ⅱ)濃度達1.66 mmol·L-1時，α-螺旋比例由最初的32.29％減少到25.15％，β-折疊比例由35.66％升高到44.47％，β-轉(zhuǎn)角比例由13.01％減少到12.63％，無規(guī)卷曲比例由15.94％減少到14.19％，α-螺旋和β-折疊變化顯著。

圖3　不同Cu(Ⅱ)濃度下硝化纖維蛋白原的二級結(jié)構(gòu)變化

2.2　凝聚活性實驗結(jié)果(圖4)

圖4　不同Cu(Ⅱ)濃度下硝化纖維蛋白原的凝聚活性

由圖4可知:硝化纖維蛋白原的凝聚活性隨著Cu(Ⅱ)濃度的增大不斷降低；當Cu(Ⅱ)濃度≤0.30 mmol·L-1時，凝聚活性隨著濃度的升高變化幅度較小，成絲時間稍微延長，成塊時間無明顯變化，此時的Cu(Ⅱ)對硝化纖維蛋白原生物學功能影響較??；當Cu(Ⅱ)濃度≥0.50 mmol·L-1時，凝聚活性急劇下降，凝聚時間延長，當Cu(Ⅱ)濃度達到1.66 mmol·L-1時，能看到少許細絲，不能形成凝塊，失去了凝聚活性，喪失了生物學功能。對照實驗中，Cu(Ⅱ)本身不能與纖維蛋白原作用。

2.3　不同Cu(Ⅱ)濃度的硝化纖維蛋白原的SDS-PAGE電泳圖譜(圖5)

圖5　不同Cu(Ⅱ)濃度下硝化纖維蛋白原的SDS-PAGE圖譜

由圖5可看出：未處理的纖維蛋白原有3條蛋白帶，自上而下分別為Aα、Bβ和γ[12]；硝化處理后(未添加CuSO4以及添加不同濃度CuSO4)，上述三條蛋白帶無明顯變化，且位置與未處理纖維蛋白原一致，證明ONOO-硝化方法較溫和，并未引起蛋白肽鏈的降解；但隨著Cu(Ⅱ)的加入，蛋白質(zhì)部分肽段發(fā)生了聚合，硝化纖維蛋白原新增一條分子量約為110 kDa的電泳條帶，且隨著Cu(Ⅱ)濃度的增大條帶越來越清晰。

2.4　討論

2.4.1Cu(Ⅱ)對硝化纖維蛋白原二級結(jié)構(gòu)的影響

纖維蛋白原的Aα鏈和Bβ鏈位于凝血酶的酶切位點，γ鏈只參與單體凝聚，與纖維蛋白原單體釋放無關。纖維蛋白原Aα鏈的α羧基端極性較強，是較易受損區(qū)域，有研究表明羥基自由基能夠誘導脂蛋白和纖維蛋白原單體間酪氨酸的交聯(lián)[8]，且纖維蛋白原中Aα的分子量為55 kDa，因此110 kDa的新增電泳條帶很可能是Aα鏈的酪氨酸發(fā)生了二聚。Cu(Ⅱ)的加入對硝化纖維蛋白原二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋和β-折疊產(chǎn)生了較大影響，導致α-螺旋向β-折疊轉(zhuǎn)變，當Cu(Ⅱ)濃度達1.66 mmol·L-1時，二者變化幅度分別為22.11％和24.71％。分子結(jié)構(gòu)中β-折疊比例的增加說明Cu(Ⅱ)的加入促進了纖維蛋白原分子內(nèi)部折疊骨架的展開，使蛋白質(zhì)變得更加松散，從而使折疊于蛋白質(zhì)內(nèi)部的芳香族氨基酸殘基暴露，最終加劇了纖維蛋白原的硝化失活。

2.4.2Cu(Ⅱ)對硝化纖維蛋白原凝聚活性的影響

纖維蛋白原的硝化損傷程度與凝聚時間呈負相關。凝聚實驗發(fā)現(xiàn)，Cu(Ⅱ)的添加對纖維蛋白原的硝化損傷表現(xiàn)了促進作用，且凝聚活性的降低與Cu(Ⅱ)濃度呈負相關。Cu(Ⅱ)可以在堿性條件下與ONOO-反應生成Cu(Ⅲ)和·NO2[16]，因此，在Cu(Ⅱ)存在下，ONOO-可能分解產(chǎn)生多種中間體損傷纖維蛋白原，但該過程較復雜，有待進一步研究。

3　結(jié)論

Cu(Ⅱ)的存在影響了硝化過程中纖維蛋白原分子二級結(jié)構(gòu)的變化，導致α-螺旋的減少和β-折疊的增加，α-螺旋向β-折疊的轉(zhuǎn)變促進了纖維蛋白原分子骨架的展開，從而加劇了ONOO-對纖維蛋白原的硝化損傷。同時二級結(jié)構(gòu)的變化影響了纖維蛋白原的凝聚活性，但只是抑制了凝聚過程中單體的凝聚，并未影響纖維蛋白單體的釋放。該結(jié)果對于了解Cu(Ⅱ)在纖維蛋白原硝化過程中的作用、揭示ONOO-的損傷機理以及有關疾病的預防和治療具有重要意義。

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