石菖蒲、當歸揮發(fā)油的提取及β-環(huán)糊精包合工藝研究

楊玉霞，于秀華，劉競研，趙雅蔚，姜秀艷， 鄭菊花，尹建元，趙蕓浩，李政

(1．吉林大學a．藥學院；b．化學院，長春130012；2．東北師范大學附屬中學，長春130021)

石菖蒲是天南星科植物石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott)的干燥根莖，具有芳香開竅、醒神益智的功效[1]。其主要活性成分為石菖蒲揮發(fā)油，包括甲基丁香酚、α-細辛醚、β-細辛醚、γ-細辛醛等物質[2]；當歸為傘形科植物當歸[Angelicasinesis(Oliv.)Diels]的干燥塊根，具有活血補血、補氣調經等功效[3]。揮發(fā)油是其重要有效成分，主要有藁苯內酯、丁烯基酞內酯等[4]。

中藥揮發(fā)油氣味特異，難溶于水，揮發(fā)性強，穩(wěn)定性差，對光敏感。β-環(huán)糊精(β-CD)具有環(huán)形筒狀結構，內部以氧原子為主，具有疏水性；外部以羥基為主，具有親水性[5]。β-環(huán)糊精在中藥制劑中常用于揮發(fā)油的包合，以增加其穩(wěn)定性。

目前已有石菖蒲、當歸揮發(fā)油單獨提取及β-環(huán)糊精包合工藝研究報道[6，7]，但尚未見有關于石菖蒲、當歸混合揮發(fā)油的提取及包合工藝的研究報道。本試驗對石菖蒲、當歸混合揮發(fā)油的提取方法、包合工藝條件及包合物驗證方法進行了較為系統(tǒng)地研究，以期獲得最佳提取方法及包合工藝。

1 儀器與試藥

1.1儀器

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(上海豫康科教儀器設備有限公司)；KDM型電子調溫電熱套(金壇市金祥龍電子有限公司)；ZK-820型真空干燥箱(上海實驗儀器廠有限公司)；SHB-ⅢA 型循環(huán)水式多用真空泵(上海豫康科教儀器設備有限公司)；CAMAG型薄層色譜掃描儀(瑞士CAMAG公司)；硅膠G薄層板(青島海洋化工集團)；Lambda 25 UV/VIS Spectrometer(美國Perkin-Elmer公司)；Nicolet iS5傅立葉變換紅外光譜儀(上海萊睿科學儀器有限公司)。

1.2試藥

石菖蒲、當歸藥材均購自長春市仙草醫(yī)藥藥材有限公司，經吉林大學天然產物研究教研室尹建元教授鑒定為湖南產天南星科植物石菖蒲和甘肅產傘形科植物當歸。β-環(huán)糊精(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)；乙酸乙酯(色譜純，天津市光復精細化工研究所)；其它試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1揮發(fā)油提取條件篩選

按處方設計稱取石菖蒲、當歸藥材共計100g，按《中國藥典》2010年版一部附錄XD揮發(fā)油測定法(甲法)提取，收集揮發(fā)油，用無水硫酸鈉脫水，得淡黃色的混合揮發(fā)油，密閉保存?zhèn)溆谩?/p>

根據影響揮發(fā)油得率的主要影響因素[8]，選擇藥材的粉碎度、提取時間和浸泡時間3個因素為試驗因素，設計正交試驗表L9(34)進行試驗，按設計條件測定揮發(fā)油提取率。正交試驗設計及結果見表1、表2、表3。

表1蒸餾工藝考察因素及水平表

Table1Thefactor-leveloforthogonaldesign

水平Level因素 Factor粉碎度AShatterdegrees提取時間B(h)Extractiontime浸泡時間C(h)Dippingtime1藥材飲片Medicinalslices4002粗粉10目Coarsepowder10Mu6053細粉40目Finepowder40Mu810

表2蒸餾工藝L9(34)正交實驗結果

Table2Orthogonaldesignandresultsofextractionprocedure

實驗組Group因 素 FactorABCD提取率(%)Extractionratio111110750121222084553133308937421230787052231099256231210922731320772783213095729332109835K124893230982799527261K228717279522616027104K327134296942658926379R03824065960183500882

表3蒸餾工藝方差分析

Table3

Variance analysis of extraction procedure

注：F0.05(2，2)=19.00。Note:F0.05(2，2)=19.00.

由各表分析可知，各因素作用的主次為B>A>C(表2)。方差分析表明，B因素對揮發(fā)油的提取率影響顯著，A、C因素的影響不顯著(表3)。因此，可確定最佳提取工藝條件為A2B3C1，即藥材粉碎度粗粉10目、無需浸泡、提取時間8h。以上最佳工藝進行驗證實驗3次得提取率分別為1.1533%、1.1051%、1.0984%，揮發(fā)油的平均提取率為1.1189%(n=3)，因此，確定該工藝為最佳提取條件。

2.2揮發(fā)油包合工藝篩選

2.2.1包合物的制備經查閱文獻[5]，采用飽和水溶液法制備混合揮發(fā)油包合物，即取一定量β-CD，加蒸餾水適量配成飽和溶液，加入1mL混合揮發(fā)油(預先配成50%的無水乙醇溶液)，于磁力攪拌器上恒溫攪拌一定時間，冷卻至室溫，置冰箱中冷藏24h，抽濾，用石油醚洗滌濾渣3次(每次10mL)，濾渣置真空干燥箱中50℃干燥4h，即得。

2.2.2包合物評價指標的測定取干燥包合物，置500mL圓底燒瓶中，加入蒸餾水300mL，采用揮發(fā)油測定法(中國藥典2010版一部附錄XD)收集揮發(fā)油，計算包合物的揮發(fā)油包合率[9]。同時，取混合揮發(fā)油1mL，置500mL圓底燒瓶中，加入蒸餾水300mL，收集揮發(fā)油，計算揮發(fā)油空白回收率為81%。

2.2.3正交試驗優(yōu)選包合工藝條件經預實驗，選擇揮發(fā)油與β-CD的投料比、包合溫度、包合時間作為考察因素，以揮發(fā)油包合率作為評價指標，用L9(34)正交表進行試驗。所選因素水平及正交試驗見表4、表5。

表4混合揮發(fā)油β-CD包合工藝因素水平

Table 4The factor-level table of orthogonal design

分析可知，各因素作用的主次為B>A>C(表5)。方差分析表明，B因素為顯著因素(表6)。因此，確定最佳包合工藝條件為A2B3C2，即混合揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的投料比為1∶8、包合溫度為60℃、攪拌時間2h。以上最佳工藝進行驗證實驗3次得包合率分別為80.28%、82.15%、82.08%，包合率平均達81.50%(n=3)，因此，確定該條件為最佳包合工藝。

表5混合揮發(fā)油β-CD包合工藝正交試驗結果

Table5Orthogonaldesignandresultsofinclusionprocedure

實驗組Group因 素 FactorABCD包合率(%)Inclusionrate111114897212225875313337346421235126522315305623128112731324540832134944933217535K118118145631795317737K218543161241853618527K317019229931719117416R1524843013451111

2.3包合物的定性分析

2.3.1薄層色譜鑒別量取當歸、石菖蒲及二者混合的揮發(fā)油各0.05mL，置于5mL量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，搖勻，作為對照品溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ。取包合物1g，共2份，一份加乙酸乙酯5mL，超聲處理30min，過濾，取續(xù)濾液作為包合物供試品溶液Ⅳ；另一份加石油醚5mL，冷浸1h，過濾，取續(xù)濾液作為包合物供試品溶液Ⅴ[10]。取β-CD 1g，按供試品溶液Ⅳ的方法制備陰性對照品溶液Ⅵ。吸取對照品溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ各2μL，吸取包合物供試品溶液Ⅳ、溶液Ⅴ及陰性對照品溶液Ⅵ各5μL，點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(17∶3)為展開劑展開，取出，晾干，置于365nm紫外光燈下檢視(圖1)。

表6混合揮發(fā)油β-CD包合工藝正交試驗方差分析

Table 6Variance analysis of β-CD inclusion procedure

注：F0.05(2，2)=19.00。Note:F0.05(2，2)=19.00.

結果顯示，供試品溶液Ⅳ在與對照品色譜相應的位置具有相同的熒光斑點，而供試品溶液Ⅴ與陰性對照品溶液Ⅵ色譜中均未見任何斑點，表明當歸、石菖蒲揮發(fā)油進入了β-CD分子內部，形成了新的包合物，而且β-CD對揮發(fā)油沒有干擾，包合前、后揮發(fā)油成分基本不變。

2.3.2紫外光譜分析量取β-CD、包合物各0.5g，加5mL乙酸乙酯，超聲30min，過濾，濾液置100mL容量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，作為樣品1、樣品2。取石菖蒲、當歸混合揮發(fā)油10mg，置100mL容量瓶中，加乙酸乙酯稀釋至刻度，作為樣品3。以乙酸乙酯為空白，在190nm～800nm范圍內進行紫外光譜掃描(圖2)。

結果顯示，β-CD的乙酸乙酯溶液無混合揮發(fā)油的特征吸收，而經超聲破壞的包合物與混合揮發(fā)油顯示的吸收譜圖峰形一致，說明混合揮發(fā)油-β-CD包合物已形成，包合前、后化學成分基本不變。

2.3.3紅外光譜分析分別取包合前、后的混合揮發(fā)油、β-CD、包合物作為樣品，采用KBr壓片法進行紅外光譜掃描(圖3)。在包合前揮發(fā)油圖譜中3440.66cm-1處為石菖蒲、當歸2種揮發(fā)油的疊加吸收峰。石菖蒲揮發(fā)油化學成分較復雜，其在2932.80cm-1、1511.36cm-1、1213.94cm-1、1.07.47cm-1處有尖峰，當歸揮發(fā)油在1767.21cm-1處有尖峰。

包合物的圖譜中觀察不到這些特征峰，證明包合過程中形成新物象。β-CD在3422.70cm-1處有寬峰，1029.24cm-1處有尖峰；包合物3422.70cm-1峰移至3400.36cm-1，峰變窄，1030.49cm-1處尖峰也變窄，說明混合揮發(fā)油和環(huán)糊精之間產生作用。包合前、后的揮發(fā)油紅外圖譜比較說明，包合前、后混合揮發(fā)油的主要化學成分未發(fā)生顯著變化。

3 討論

β-環(huán)糊精可選擇性地與多種芳香化合物形成環(huán)糊精包合物，它的包合作用在增加藥物的溶解度、穩(wěn)定性、掩蓋藥物的臭味等方面具有良好效果[11]。本實驗利用β-環(huán)糊精對揮發(fā)油進行包合可有效減少揮發(fā)油在制劑生產貯存運輸過程中受光線高溫的影響，明顯提高藥物制劑的穩(wěn)定性，改善藥物溶解度，提高生物利用度，促進藥物療效的發(fā)揮。

本實驗采用水蒸汽蒸餾法提取石菖蒲、當歸混合揮發(fā)油，得到最佳提取工藝，即將藥材粉碎為粗粉10目、無需浸泡、提取時間8h。本研究單獨提取當歸、石菖蒲藥材的出油率分別為0.4357%、1.1316%，而混合揮發(fā)油提取率達到1.1189%，按處方量計算，混合提取比單獨提取出油率增加，還節(jié)省成本。因此，本研究采用混合提取揮發(fā)油的方法。

本實驗采用飽和水溶液法得到最佳包合工藝，即揮發(fā)油與β-環(huán)糊精的投料比為1∶8、包合溫度60℃、攪拌時間2h。包合物包合率平均達81.50%(n=3)，驗證實驗表明本工藝重現(xiàn)性好、質量穩(wěn)定。

本實驗采用薄層、紫外、紅外法對包合物的驗證結果表明，包合前、后揮發(fā)油的主要化學成分未發(fā)生顯著變化，并且揮發(fā)油與β-環(huán)糊精形成新的穩(wěn)定化合物。

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