血管緊張素Ⅱ受體及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵酶在宮頸癌中的表達(dá)

于娟 高國(guó)蘭 余立群▲ 吳乾鳳 張菊新

1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)航空總醫(yī)院婦科，北京100012；2.河南省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南鄭州450003

血管緊張素Ⅱ受體及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵酶在宮頸癌中的表達(dá)

于娟1高國(guó)蘭1余立群1▲吳乾鳳1張菊新2

1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)航空總醫(yī)院婦科，北京100012；2.河南省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南鄭州450003

目的探討血管緊張素Ⅱ-1型受體（AT1R）和血管緊張素Ⅱ-2型受體（AT2R）及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵酶在宮頸癌中的表達(dá)。方法收集2013年3月～2014年2月河南省人民醫(yī)院及中國(guó)醫(yī)科大學(xué)航空總醫(yī)院手術(shù)切除正常宮頸組織47例（對(duì)照組）、宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）組織36例（CIN組）及65例宮頸癌組織標(biāo)本（宮頸癌組）。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)AT1R和AT2R mRNA水平；蛋白質(zhì)印記法檢測(cè)AT1R和AT2R蛋白表達(dá)水平。激活A(yù)T1R，測(cè)定酪氨酸激酶（PTK）活性；激活A(yù)T2R，測(cè)定胞漿型磷脂酶A2（cPLA2）活性。結(jié)果與對(duì)照組比較，CIN組及宮頸癌組AT1R、AT2R的mRNA水平以及蛋白表達(dá)水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。激活A(yù)T1R后，CIN組與宮頸癌組的PTK活性與對(duì)照組比較均明顯升高[（64.00±16.23），（89.00±20.76）比（50.00± 12.16）]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與CIN組比較，宮頸癌組進(jìn)一步升高（P＜0.05）。激活A(yù)T2R后，CIN組和宮頸癌組的cPLA2活性與對(duì)照組比較均明顯升高[（137.00±19.72）、（181.00±30.83）比(104.00± 21.46)]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與CIN組比較，宮頸癌組進(jìn)一步升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論AT1R、AT2R與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有望成為宮頸癌潛在的診斷和治療靶點(diǎn)。

血管緊張素Ⅱ-1型受體；血管緊張素Ⅱ-2型受體；宮頸癌；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性生命健康的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病確切原因目前仍不清楚。血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是血管緊張素最重要的組成部分，與血管緊張素Ⅱ-1型受體（AT1R）和血管緊張素Ⅱ-2型受體（AT2R）結(jié)合，調(diào)節(jié)血壓和電解質(zhì)平衡，并且在腫瘤血管生成以及腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、浸潤(rùn)中起重要作用。血管緊張素受體（ATR）Ⅱ在宮頸癌細(xì)胞的表達(dá)及意義并未見(jiàn)系統(tǒng)研究。因此，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及蛋白質(zhì)印記法分別檢測(cè)不同臨床分期的宮頸癌患者癌組織中ATR的表達(dá)，探討ATR與宮頸癌發(fā)病的相關(guān)性，為找尋宮頸癌的有效治療方法提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年3月～2014年2月河南省人民醫(yī)院及中國(guó)醫(yī)科大學(xué)航空總醫(yī)院手術(shù)切除的病變宮頸標(biāo)本101例。其中宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）36例（CIN組），年齡29～73歲，平均（47.7±11.6）歲；按2003年WHO腫瘤組織學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，CINⅠ10例，CINⅡ14例，CINⅢ12例。宮頸癌65例（宮頸癌組），年齡34～71歲，平均（49.5±10.1）歲，按2009年國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟的臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期24例，Ⅱ期27例，Ⅲ期9例，Ⅳ期5例。選取同期因子宮肌瘤行全子宮切除的正常宮頸組織47例作為對(duì)照組，年齡42～66歲，平均（46.7±5.9）歲。所有患者均簽署知情同意書，且經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)。所有患者均未接受化療、放療或其他針對(duì)腫瘤的治療，無(wú)嚴(yán)重心肺疾病、肝炎及伴發(fā)其他臟器惡性腫瘤，臨床及病理資料完整。三組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 試劑及藥品

Trizol試劑購(gòu)自于美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒A3500購(gòu)自美國(guó)Promega公司；SYBR熒光實(shí)時(shí)PCR試劑盒購(gòu)自日本Katara生物公司；鼠抗人AT1R、鼠抗人AT2R和羊抗鼠IgG-HRP二抗均購(gòu)自Santa Crus公司。AngⅡ、PDl23319、PTK活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，磷脂酶A2（cPLA2）活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Cayman公司，氯沙坦購(gòu)自美國(guó)默沙東公司。其他試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)AT1R、AT2R mRNA水平提取各組樣本采用Trizol法提取總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（A3500）將總RNA（2 μg）反轉(zhuǎn)錄為cDNA（20 μL體系）及實(shí)時(shí)定量PCR,引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。采用Livak等[1]報(bào)道的2-ΔΔCt方法計(jì)算mRNA表達(dá)水平。

表1 引物序列表

1.3.2 Western blot檢測(cè)AT1R、AT2R蛋白表達(dá)組織經(jīng)處理后，按文獻(xiàn)方法裂解組織提取蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，取100 μg蛋白加入2×十二烷基硫酸鈉（SDS）凝膠加樣緩沖液中，100℃加熱10 min以使蛋白變性。10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳分離蛋白，再將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜，根據(jù)抗體說(shuō)明書加入稀釋的一抗鼠抗人AT1R、鼠抗人AT2R，4℃孵育8 h，TBST洗膜3次，按1∶2000加入辣根過(guò)氧化物酶藕聯(lián)熒光二抗，室溫避光孵育1 h，TBST避光洗膜3次，采用Odyssey 13.0掃描儀對(duì)硝酸纖維素膜進(jìn)行掃描成像，采用Quantity one軟件對(duì)圖像進(jìn)行面積灰度值計(jì)算，以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度比值做半定量分析。

1.3.3 酪氨酸激酶活性測(cè)定取各組組織剪成重約100mg，加入AngⅡ（1×10-8mol/L）、AT2R抑制劑PDl23319（5×10-7mol/L），在持續(xù)通入95%O2和5%CO2混合氣體的Krebs液中37℃搖床環(huán)境溫育15 min，嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行PTK活性測(cè)定。每一標(biāo)本分別測(cè)2次，取平均值。

1.3.4 cPLA2活性測(cè)定取各組組織剪成重約100 mg，加入AngⅡ、AT1R抑制劑氯沙坦（1×10-7mol/L），在持續(xù)通入95%O2和5%CO2混合氣體的Krebs液中，37℃搖床環(huán)境溫育15 min，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行cPLA2活性測(cè)定。每一標(biāo)本分別測(cè)2次，取其平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間比較采用Bonferroni t檢驗(yàn)（方差齊）或Dunn＇s多組檢驗(yàn)（方差不齊），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組AT1R、AT2R mRNA水平比較

與對(duì)照組相比較，CIN組（1.35±0.13）及宮頸癌組（1.74±0.21）AT1R的mRNA水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與CIN組相比較宮頸癌組AT1R的mRNA水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組相比較，CIN組（1.55± 0.19）及宮頸癌組（2.40±0.27）AT2R的mRNA水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；與CIN組比較，宮頸癌組AT2R mRNA水平均明顯升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖1。

2.2 三組AT1R、AT2R蛋白表達(dá)水平比較

圖1 三組AT1R、AT2R mRNA水平比較

與對(duì)照組AT1R的蛋白表達(dá)水平（0.89±0.15）比較，CIN組（1.60±0.22）及宮頸癌組（2.61±0.28）均明顯升高，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與CIN組比較，宮頸癌組AT1R的蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組AT2R的蛋白表達(dá)水平（0.71±0.12）比較，CIN組（1.92±0.27）及宮頸癌組（3.42±0.33）均明顯升高，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與CIN組比較，宮頸癌組AT2R的蛋白表達(dá)水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2AT1R、AT2R蛋白表達(dá)水平比較

2.3 酪氨酸激酶活性

激活A(yù)T1R后，CIN組與宮頸癌組的PTK活性與對(duì)照組相比均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），與CIN組比較，宮頸癌組進(jìn)一步升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。激活A(yù)T2R后，CIN組與宮頸癌組的cPLA2活性與對(duì)照組相比均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），與CIN組比較，宮頸癌組進(jìn)一步升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 酪氨酸激酶與磷脂酶A2表達(dá)水平變化[mmol/（min·mg），x±s]

3 討論

宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性生命健康的婦科惡性腫瘤之一，病死率居女性腫瘤死亡第2位，近年我國(guó)女性宮頸癌發(fā)病率逐年上升，并且呈年輕化的趨勢(shì)[2-3]。宮頸癌的發(fā)生與許多因素有關(guān)，但目前我們對(duì)宮頸癌發(fā)病的具體分子機(jī)制尚缺乏全面和深入的了解。AngⅡ作為一種細(xì)胞效應(yīng)因子，主要通過(guò)與其受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。ATR主要分為AT1R、AT2R兩種亞型，AT1R、AT2R均屬于G蛋白偶聯(lián)受體，AT1R與Gq蛋白相偶聯(lián)，促進(jìn)細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)、促進(jìn)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。AngⅡ與AT2R結(jié)合具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)及血管內(nèi)皮產(chǎn)生、抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，拮抗AT1R的作用[4-5]。

研究表明，ATR參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展，激活A(yù)T1R刺激肺癌細(xì)胞增殖，抑制癌細(xì)胞凋亡。激活A(yù)T2R對(duì)肺癌、前列腺癌、胰腺癌等具有抑制癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的作用[6-7]。ATR在正常宮頸組織表達(dá)，然而ATR對(duì)宮頸癌發(fā)生發(fā)展的影響尚未見(jiàn)系統(tǒng)研究。本研究結(jié)果表明，在由正常宮頸組織向CIN及宮頸癌發(fā)展過(guò)程中，AT1R和AT2R的mRNA及蛋白表達(dá)均逐漸增強(qiáng)。表明ATR可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程有關(guān)。有研究報(bào)道在子宮內(nèi)膜癌及卵巢癌組織中ATR的表達(dá)升高[8-9]，與本研究結(jié)果一致。表明在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中，與其他腫瘤一樣，ATR與癌細(xì)胞的增生增殖、腫瘤血管的形成密切相關(guān)。

AT1R與AT2R的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑不同，目前研究表明AT1R常見(jiàn)有兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，第一條確定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為Gq蛋白激活蛋白磷脂酶進(jìn)而生成第二信使肌醇磷脂，進(jìn)一步水解為肌醇三磷酸、二脂酰甘油；第二條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為AT1R通過(guò)激活酪氨酸激酶，使酪氨酸磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)酶的激活[10]。AT2R的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑目前仍在研究中，迄今為止尚未定論，其途徑主要有AT2R激活PLA2，進(jìn)而激活花生四烯酸的途徑、NO/cGMP參與的途徑以及激活蛋白磷酸酶等途徑[11]。本研究對(duì)AT1R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵酶PTK及AT2R信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵酶PLA2進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，激活A(yù)T1R后，CIN組與宮頸癌組的PTK活性與對(duì)照組相比均明顯升高，與CIN組相比宮頸癌組進(jìn)一步升高。激活A(yù)T2R后，CIN組與宮頸癌組的cPLA2活性與對(duì)照組相比均明顯升高，與CIN組相比宮頸癌組進(jìn)一步升高。說(shuō)明在宮頸癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，AT1R、AT2R的表達(dá)水平增加的同時(shí)，其活性也隨之增加。有研究表明，激活A(yù)T1R后刺激癌細(xì)胞增殖，抑制癌細(xì)胞凋亡；激活A(yù)T2R后抑制癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。癌細(xì)胞的增殖與凋亡是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，只有癌細(xì)胞的增殖大于凋亡，腫瘤才表現(xiàn)出高度增長(zhǎng)活性[12-15]。如果能利用AT1R、AT2R在宮頸癌中的表達(dá)及活性特點(diǎn)，抑制AT1R活性，激活A(yù)T2R活性，不失為一種治療宮頸癌的新方向。

綜上所述，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中，AT1R、AT2R的表達(dá)逐漸增高，活性逐漸增強(qiáng)，抑制AT1R活性，激活A(yù)T2R活性，可能為治療宮頸癌的一種新思路。

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Expressions of AngiotensinⅡreceptor and the key signal transduction enzymes in the cervical cancer

YU Juan1GAO Guolan1YU Liqun1▲WU Qianfeng1ZHANG Juxin2
1.Department of Gynecology,Aviation General Hospital of China Medical University,Beijing100012,China;2.Department of Gynecology and Obstetrics,Henan Provincial People＇s Hospital,He＇nan Province,Zhengzhou450003,China

Objective To investigate the expressions of angiotensinⅡreceptor(ATR)and the key signal transduction enzymes in cervical cancer.Methods Uterine cervical tissue specimens from the patients who treated in the Henan Province People＇s Hospital and Aviation General Hospital of China Medical University from March 2013 to February 2014 were collected.There were 47 cases of normal cervix(control group),36 cases of cervical intraepithelial neoplasia (CIN group)and 65 cases of cervical cancer(cervical cancer group).The levels of AT1R and AT2R mRNA were detected by real-time quantitative PCR and the protein expressions of AT1R and AT2R were determined by Western blot analysis.The activities of protein tyrosine kinase(PTK)were measured when the AT1R was activated by angiotensinⅡ. The activities of cytosolic phospho1ipase A2(cPLA2)were detected when the AT2R was activated.Results The levels of AT1R and AT2R mRNA in the CIN group and cervical cancer group were significantly increased compared with the control group.The levels of AT1R and AT2R protein expression in the CIN group and cervical cancer group were significantly increased compared with the control group(P＜0.05 or P＜0.01).The activities of PTK were increased significantly in the CIN group and cervical cancer group compared with control group[(64.00±16.23)vs(50.00±12.16),P＜0.05;(89.00±20.76)vs(50.00±12.16),P＜0.01].The activities of cPLA2were increased significantly in the CIN group and cervical cancer group compared with control group[(137.00±19.72)vs(104.00±21.46),(181.00±30.83)vs(104.00± 21.46)],the differences of two were statistically significant(P＜0.05 or P＜0.01),compared with the CIN group,cervical cancer group was further increased,the difference was statistically significant(P＜0.05).Conclusion AT1R and AT2R are closely associated with the development of cervical cancer and may become candidate markers for early diagnosis of cervical cancer and new targets for therapy.

AngiotensinⅡtype 1 receptor;AngiotensinⅡtype 2 receptor;Cervical cancer;Signal transduction

R711.74

A

1673-7210（2014）10（b）-0024-04

2014-07-08本文編輯：任念）

▲通訊作者