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    雙環(huán)醇對腎間質(zhì)纖維化大鼠的干預(yù)作用

    2014-11-17 16:57:29孟曉華董科
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2014年29期
    關(guān)鍵詞:雙環(huán)腎小管生長因子

    孟曉華++董科(等)

    [摘要] 目的 觀察單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型大鼠在雙環(huán)醇的干預(yù)下,肝細(xì)胞生長因子(HGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)表達(dá)的動態(tài)變化,探討雙環(huán)醇延緩腎間質(zhì)纖維化的可能機(jī)制。 方法 將60只雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組、模型組、雙環(huán)醇組,每組各20只,建立單側(cè)輸尿管梗阻模型。雙環(huán)醇組于術(shù)前2 d給予雙環(huán)醇[200 mg/(kg·d)]灌胃,假手術(shù)組、模型組給予等量自來水灌胃。每組分別在術(shù)后3、6、9、14 d時(shí)隨機(jī)處死5只大鼠并取左側(cè)腎組織,行HE染色觀察腎組織病理變化,免疫組織化學(xué)染色觀察HGF、TGF-β1蛋白的表達(dá),RT-PCR法檢測腎組織HGF mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果 模型組中HGF蛋白及mRNA表達(dá)均呈現(xiàn)早期升高后期降低的趨勢,在第6天表達(dá)量最高,隨后逐漸下降,表達(dá)量在術(shù)后3、9、14 d與術(shù)后6 d比較差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01)。而TGF-β1蛋白的表達(dá)量呈現(xiàn)隨梗阻時(shí)間延長逐漸升高趨勢,術(shù)后3、6、9 d與術(shù)后14 d比較,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01)。在相同時(shí)間點(diǎn),雙環(huán)醇組與模型組相比,HGF蛋白及mRNA表達(dá)量顯著升高,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01),而TGF-β1蛋白表達(dá)量顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01)。 結(jié)論 雙環(huán)醇通過上調(diào)HGF及下調(diào)TGF-β1的表達(dá)而發(fā)揮緩解腎間質(zhì)纖維化的作用。

    [關(guān)鍵詞] 肝細(xì)胞生長因子;雙環(huán)醇;腎間質(zhì)纖維化;轉(zhuǎn)化生長因子-β1

    [中圖分類號] R692.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210(2014)10(b)-0015-05

    Intervention effect of bicyclol for rats with renal interstitial fibrosis

    MENG Xiaohua DONG Ke XU Shichan FENG Xiaoming TIAN Xiao SHI Guohui

    Department of Nephrology, Affiliated Hospital of Hebei United University, Hebei Province, Tangshan 063000, China

    [Abstract] Objective To observe the dynamic change of hepatocyte HGF and TGF-β1 of UUO rats intervened by bicyclol, in order to discuss the possible mechanism of renal interstitial fibrosis delayed by bicyclol. Methods 60 male SD rats were randomly divided into sham-operated group (SOR), UUO model group and bicyclol-treated group (BIC), each group had 20 rats. Through ligating the left ureter, the unilateral ureteral obstructive rat model was established. 2 days before surgery, the rats in bicyclol-treated group were administed with bicyclol [200 mg/(kg·d)]. Rats in the sham-operated group and the model group were administed with tap water. Rats were sacrificed after the surgery for 3, 6, 9 and 14 days. The left kidney was taken. RT-PCR was used to detect the expression of HGF mRNA in renal tissue. The expression of HGF and TGF-β1 protein were measured by immunohistochemistry. HE stain was used to examine the area of pathological changes. Results In model group, the mRNA and protein expression levels of HGF increased markedly on day 3 and reached its peak value on day 6 after the surgery, then slowly fallen down, and the expression levels on day 6 were significantly different between on day 3, 9, 14 after the surgery, the differences were statistically significant (P < 0.01). However, the protein expression levels of TGF-β1 increased with extension of obstruction, and the expression levels on day 14 were significantly different from on day 3, 6, 9 after the surgery, the differences were statistically significant (P < 0.01). At each research point, the mRNA and protein expression levels of HGF were significantly higher in the bicyclol-treated group than those in the model group, the differences were statistically significant (P < 0.01). The protein expression level of TGF-β1 was significantly lower in the bicyclol-treated group than that in the model group, the difference was statistically significant (P < 0.01). Conclusion Bicyclol can alleviate the degree of renal interstitial fibrosis through increasing the expression of HGF and decreasing the expression of TGF-β1.

    [Key words] Hepatocyte growth factor; Bicyclol; Renal interstitial fibrosis; TGF-β1

    無論腎小球疾病還是腎間質(zhì)病變,其終極歸宿均為間質(zhì)纖維化,終將進(jìn)展為慢性腎功能衰竭,患者需終生依賴腎臟替代治療。尋找可能延緩、改善腎間質(zhì)纖維化的藥物是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。雙環(huán)醇是目前應(yīng)用在肝炎領(lǐng)域的國家Ⅰ類新藥,已有研究表明,雙環(huán)醇可以抑制肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展[1-2]。因?yàn)槟I間質(zhì)纖維化同肝纖維化的發(fā)生機(jī)制基本相同,所以本研究應(yīng)用雙環(huán)醇干預(yù)單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠,動態(tài)觀察其對肝細(xì)胞生長因子(HGF)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)表達(dá)的影響,研究雙環(huán)醇是否對腎間質(zhì)纖維化同樣具有抑制作用及其可能的機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    清潔級雄性SD大鼠60只(由河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供),體重180~220 g。雙環(huán)醇由北京協(xié)和藥廠生產(chǎn)(生產(chǎn)批號111122);Trizol試劑Invitrogen公司生產(chǎn),購自華美生物工程公司;AMV Reverse Transcriptase、4×dNTP、Rasine、Radom primer均為Promega公司生產(chǎn),購自華美生物工程公司;Taq DNA聚合酶購自北京賽百盛生物工程公司;引物由上海生物工程有限公司合成,HGF引物1:5′-GAGCCAGACGCTAGCAAGTT-3′,引物2:5′-AATCTGAGCCTTCAGGTCCAT-3′;β-actin引物1:5′-GCCATGTACGTAAGCCATCCA-3′,引物2:5′-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′;兔抗大鼠HGF多克隆抗體、兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體、SP系列試劑盒購自Boster公司;瓊脂糖、Marker 100 bp購自鼎國生物工程公司。

    1.2 方法

    1.2.1 動物分組、UUO模型的建立及標(biāo)本收集 將60只大鼠隨機(jī)分為3組(每組各20只):假手術(shù)組、模型組、雙環(huán)醇組。將大鼠用2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉,仰臥位固定,取下腹部正中切口,經(jīng)腹腔在左后腹壁分離沿腎門下行的左輸尿管,在其上1/3處結(jié)扎并切斷,使左腎完全梗阻。假手術(shù)組僅游離左側(cè)輸尿管,但不結(jié)扎和剪斷。雙環(huán)醇組于術(shù)前2 d給予雙環(huán)醇200 mg/(kg·d)[3]灌胃,假手術(shù)組、模型組給予等量自來水灌胃。各組分別在術(shù)后3、6、9、14 d隨機(jī)處死5只大鼠,迅速切取左腎,一部分立即置于液氮中冷凍保存,用于提取組織RNA,剩余部分用10%福爾馬林固定用于HE染色及免疫組織化學(xué)染色。

    1.2.2 常規(guī)病理學(xué)檢查(HE染色) HE染色后在真彩醫(yī)學(xué)圖像系統(tǒng)下計(jì)算腎間質(zhì)病變相對面積。每張切片在高倍鏡(200×)下分別選取10個不重疊視野,計(jì)算視窗內(nèi)腎間質(zhì)病變面積占1個視野的面積百分比,取平均值。再由2名觀察者進(jìn)行獨(dú)立雙盲觀察切片中腎小管間質(zhì)的病變程度。根據(jù)Banff分級[4]對病變程度進(jìn)行評定。

    1.2.3 免疫組織化學(xué)染色 采用SP法免疫組化染色檢測腎組織HGF、TGF-β1的表達(dá),操作步驟按照說明書進(jìn)行。光鏡下陽性反應(yīng)部位呈棕黃色。通過光學(xué)顯微鏡攝入圖像,放大400倍,隨機(jī)選取20個互不重疊視野,由2名觀察者進(jìn)行獨(dú)立雙盲觀察。以陽性細(xì)胞的百分率及陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度的乘積進(jìn)行評分。染色強(qiáng)度以多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色特性(染色深淺需與背景著色相對比)計(jì)分:無著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。陽性細(xì)胞百分率:0~5%為0分,6%~25%為1分,26%~50%為2分,51%~75%為3分,>75%為4分[5]。

    1.2.4 反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR) Trizol法提取各組腎組織總RNA,行純度、含量、完整性的鑒定后逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增cDNA。以cDNA為模板,根據(jù)Genebank提供的上下游引物,PCR擴(kuò)增mRNA。擴(kuò)增條件:94℃ 5 min;94℃ 45 s、48℃ 30 s、72℃ 30 s,32個循環(huán);72℃ 5 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳,并在紫外光下采集圖像進(jìn)行分析。HGF的相對表達(dá)量為特定性擴(kuò)增產(chǎn)物HGF電泳帶與β-actin電泳帶峰面積積分值之比。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 腎小管間質(zhì)的病理改變

    HE染色光鏡切片示:假手術(shù)組各時(shí)期腎小球腎小管間質(zhì)結(jié)構(gòu)未見異常。模型組術(shù)后3 d可見腎小管稍有擴(kuò)張,腎間質(zhì)明顯水腫,少量炎性細(xì)胞浸潤。隨著梗阻時(shí)間延長,腎小管管腔明顯擴(kuò)張,腎小管上皮細(xì)胞逐漸壞死、脫落,間質(zhì)中大量炎性細(xì)胞浸潤。術(shù)后14 d腎小管結(jié)構(gòu)嚴(yán)重毀損,管腔塌陷,大量腎小管上皮細(xì)胞死亡。模型組各時(shí)間點(diǎn)之間病變面積差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01)。相同時(shí)間點(diǎn)下,雙環(huán)醇組病變面積顯著低于模型組(P < 0.01)。見表1、圖1。

    表1 各組大鼠腎間質(zhì)病變范圍(%,x±s)

    注:與同組術(shù)后3 d比較,aP < 0.01;與同組術(shù)后6 d比較,bP < 0.01;與同組術(shù)后9 d比較,cP < 0.01;與模型組比較,▼P < 0.01

    2.2 免疫組化染色結(jié)果

    2.2.1 HGF染色 假手術(shù)組中HGF僅在腎小管上皮細(xì)胞及小管周圍細(xì)胞有微量表達(dá),各時(shí)間點(diǎn)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。模型組HGF的表達(dá)位置與假手術(shù)組基本一致,表達(dá)量呈現(xiàn)早期升高、后期降低的趨勢,術(shù)后3、9、14 d與術(shù)后6 d相比,差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.01)。在相同時(shí)間點(diǎn),雙環(huán)醇組與模型組相比,表達(dá)量有顯著升高(P < 0.01)。見表2、圖2(封三)。

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