中縫大核對(duì)大鼠心臟傷害性感受的下行抑制性調(diào)控作用及其調(diào)控通路

孫 娜，牛利剛，孔令恒，朱娟霞，徐 燕，杜劍青

（1.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生理學(xué)教研室，陜西 西安 710021；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，陜西 西安 710061）

腦干對(duì)脊髓背角傷害性信息的傳入具有下行抑制性調(diào)控作用，電刺激中縫大核（nucleus raphe magnus，NRM）或者于NRM內(nèi)注射谷氨酸或5－羥色胺（5－h(huán)ydroxytryptamine，5－HT）等受體激動(dòng)劑，可以對(duì)由傷害性軀體或者內(nèi)臟刺激引起的脊髓傷害感受性反射或者脊髓背角神經(jīng)元進(jìn)行抑制性調(diào)節(jié)，而NRM的這種下行抑制性調(diào)節(jié)作用在解剖學(xué)上被認(rèn)為是由脊髓背外側(cè)束（dorsolateral funiculus，DLF）下行介導(dǎo)的［1－2］。另外有研究［3］顯示：5－HT能神經(jīng)元主要集中在腦干的NRM，其下行纖維可達(dá)脊髓膠質(zhì)區(qū)／側(cè)角和前腳，尤其是從NRM至脊髓后側(cè)角的5－HT神經(jīng)通路，因此脊髓內(nèi)5－HT遞質(zhì)的釋放被認(rèn)為是腦干下行抑制系統(tǒng)參與鎮(zhèn)痛作用的主要因素。然而，這些研究都是以軀體痛或者直腸和膀胱腹部?jī)?nèi)臟痛為研究靶點(diǎn)，而關(guān)于心臟痛的腦干下行性調(diào)節(jié)卻少有研究。為了進(jìn)一步探討NRM對(duì)心臟傷害性感受的下行性調(diào)控作用以及參與其中的脊髓通路和5－HT受體系統(tǒng)的作用，本實(shí)驗(yàn)采用Jou等［4］人建立的大鼠心臟－軀體運(yùn)動(dòng)反射（cardiosomatic motor reflex，CMR）模型，以心包內(nèi)注射致痛劑辣椒素（capsaicin，CAP）誘發(fā)背斜方?。╯pinotrapezius，SPT）肌電（electromyogram，EMG）為指標(biāo)，分析EMG的變化，探討NRM對(duì)心臟傷害性感受的調(diào)節(jié)作用及其調(diào)控通路，為心絞痛的臨床神經(jīng)治療研究提供有效的參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 實(shí)驗(yàn)選用成年、雄性、健康的Sprgue Dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量250～350g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：0008366。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)清潔級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)，室溫20℃～25℃，12h晝夜循環(huán)光照，自由攝食飲水。在保證實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)的基礎(chǔ)上盡量減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的數(shù)目。戊巴比妥鈉（美國(guó)Sigma公司）溶于生理鹽水，配制成2×10－2g·mL－1溶液用于動(dòng)物初始麻醉，1×10－2g·mL－1溶液用于動(dòng)物麻醉維持；CAP（美國(guó)Sigma公司）溶于吐溫80和無(wú)水乙醇混合溶液（按1∶1的配比）中，配制成1×10－3g·mL－1的母液，待實(shí)驗(yàn)當(dāng)天用生理鹽水稀釋到濃度為1mg·L－1；麥角新堿（美國(guó)Sigma公司，5－HT受體拮抗劑）溶于二甲基亞砜溶液中，待麥角新堿完全溶解后，再將溶有麥角新堿的二甲基亞砜溶液與生理鹽水按照3∶7的體積比混合，配制成濃度分別為3×10－3g·mL－1和5×10－3g·mL－1溶液。PowerLab信號(hào)采集與分析系統(tǒng)（澳大利亞AD Instruments公司），蠕動(dòng)泵（BT100－2J，保定蘭格恒流泵有限責(zé)任公司），小動(dòng)物呼吸機(jī)（DW3000－B，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司），溫度控制儀（原西安醫(yī)科大學(xué)教學(xué)儀器廠），動(dòng)物腦立體定位儀（SN－2N，日本Narishige公司），雙線記憶示波器（VC－10）、雙通道放大器（AVM－11）、刺激器（SEN－3301）和隔離器（SS－202J）（日本Nihon Kohden公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 所有大鼠均以2×10－2g·mL－1戊巴比妥鈉（45～55mg·kg－1）腹腔麻醉，行常規(guī)氣管插管和頸外靜脈、頸總動(dòng)脈插管術(shù)后，制備CMR大鼠模型：于大鼠左側(cè)上胸部第1到第3肋軟骨處行開胸術(shù)，暴露胸腺和心臟，用玻璃探針在心包膜上開一小孔，將一內(nèi)徑0.051cm、外徑0.094cm，長(zhǎng)度14～16cm、遠(yuǎn)端有數(shù)個(gè)小洞的硅膠管順胸腺的中線由之前在心包上所開的孔插入心包，導(dǎo)管順左心室表面插入約2cm并縫合在胸腺和各層胸壁組織之間予以固定。心包內(nèi)可反復(fù)注入和抽出液體。每一次從導(dǎo)管內(nèi)抽出的液體均作為廢棄液被處理，以免污染下一次實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，于T4～T6水平暴露大鼠左側(cè)背斜方?。╯pinotrapezius，SPT），插入同芯電極記錄大鼠EMG反應(yīng)，EMG信號(hào)經(jīng)AVM－11雙通道放大器（Nihon Kohden）放大后，由PowerLab軟件采集和分析，濾波為1000～3000Hz。實(shí)驗(yàn)中維持大鼠于淺麻醉狀態(tài)（1×10－2g·mL－1戊巴比妥鈉，10～15mg·kg－1·h－1），體溫保持（37.0±0.5）℃。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理方法 大鼠隨機(jī)分為NRM電刺激組（n＝8）、NRM電刺激聯(lián)合DLF橫斷組（n＝8）和NRM電刺激聯(lián)合5－HT受體拮抗劑鞘內(nèi)微注射組（n＝18）。①NRM電刺激組：為實(shí)現(xiàn)電刺激大鼠NRM區(qū)的目的，根據(jù)Paxions ＆Watson圖譜，將一根外徑0.45mm的鋼制導(dǎo)管植入大鼠腦干NRM區(qū)上方2mm處（前囟后9.4～11.8mm，腦表面下7.0～7.4mm，中線旁開0～0.5mm）。同芯刺激電極經(jīng)此導(dǎo)管進(jìn)入NRM區(qū)，使其尖端位置長(zhǎng)于導(dǎo)管尖端2mm。每只大鼠在行NRM電刺激前，先行單純CAP（0.2mL，1mg·L－1）心包內(nèi)注射，其誘發(fā)的EMG活動(dòng)作為基礎(chǔ)對(duì)照；間隔50min，給予大鼠NRM電刺激（75μA）及心包內(nèi)CAP注射，觀察NRM電刺激對(duì)心包內(nèi)注射CAP所誘發(fā)EMG反應(yīng)的影響；50min后，再次心包內(nèi)注射CAP，觀察EMG恢復(fù)情況，作為后對(duì)照。為保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確，每次CAP刺激后，用溫生理鹽水沖洗心包腔5～6次，每次0.2mL，去除心包內(nèi)殘留的CAP，每次心包CAP刺激時(shí)間間隔50min，以避免藥物耐受性現(xiàn)象的出現(xiàn)。②NRM電刺激聯(lián)合DLF橫斷組：為實(shí)現(xiàn)觀察脊髓下行調(diào)控路徑的目的，對(duì)大鼠實(shí)施C1～C3節(jié)段的開錐板術(shù)并將硬脊膜完全剝離，暴露脊髓組織，實(shí)驗(yàn)需要時(shí)用精細(xì)眼科剪解剖學(xué)橫斷DLF。實(shí)驗(yàn)過(guò)程：CAP心包內(nèi)注射，記錄EMG活動(dòng)作為基礎(chǔ)對(duì)照；50min后行NRM區(qū)電刺激（75μA）及心包內(nèi)CAP注射，記錄EMG以觀察NRM的下行性調(diào)控作用；繼而用精細(xì)眼科剪實(shí)現(xiàn)DLF解剖學(xué)阻斷，50min后再次行NRM區(qū)電刺激（75μA）及心包內(nèi)CAP注射，記錄EMG活動(dòng)以判斷DLF橫斷對(duì)NRM下行性調(diào)控作用的影響。DLF被橫斷后，血壓下降，但50min內(nèi)血壓便得以恢復(fù)至基線水平。③NRM電刺激聯(lián)合5－HT受體拮抗劑鞘內(nèi)微注射組：為觀察5－HT受體拮抗劑麥角新堿在NRM下行性抑制性調(diào)控中的作用，對(duì)大鼠實(shí)施脊髓鞘內(nèi)置管術(shù)，即將一根規(guī)格為PE10的導(dǎo)管通過(guò)枕骨大孔植入至脊髓T3～T5節(jié)段，插入深度為3.5～4.0cm，為后期脊髓內(nèi)藥物注射做準(zhǔn)備。實(shí)驗(yàn)過(guò)程：先行CAP心臟刺激記錄EMG活動(dòng)作為基礎(chǔ)對(duì)照；繼而NRM電刺激（75μA）及心包內(nèi)注射CAP，記錄EMG以觀察NRM的下行性調(diào)控作用；間隔50min，鞘內(nèi)注射溶媒（10μL）或麥角新堿（30或50μg，10μL），15min后，行NRM區(qū)電刺激（75μA）及心包內(nèi)CAP注射，記錄EMG活動(dòng)以觀察麥角新堿鞘內(nèi)注射對(duì)NRM電刺激的影響；50min后，行NRM區(qū)電刺激（75μA）并心包內(nèi)注射CAP，記錄EMG以判斷藥物作用的持續(xù)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將實(shí)驗(yàn)中所記錄的EMG用PowerLab軟件進(jìn)行頻率直方圖處理。當(dāng)放電頻率高于3imp·s－1時(shí)，作為放電的開始；當(dāng)放電頻率低于3imp·s－1時(shí)，則作為放電的終止，從而得到每次CAP心包內(nèi)注射所誘發(fā)的肌電反應(yīng)總個(gè)數(shù)（total number of motor unit discharges，TMUD）。每只大鼠第1次心包內(nèi)注射CAP所誘發(fā)的肌電反應(yīng)的TMUD被標(biāo)化為100%，作為基礎(chǔ)對(duì)照（control），其后續(xù)肌電反應(yīng)均以第1次心包內(nèi)注射CAP所誘發(fā)的肌電反應(yīng)的TMUD為分母進(jìn)行標(biāo)化，以消除大鼠個(gè)體間的差異。電刺激后肌肉放電單位數(shù)高于基礎(chǔ)對(duì)照110%或者低于對(duì)照90%，視為有意義，可計(jì)入統(tǒng)計(jì)范疇［5］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組大鼠CAP誘發(fā)的背斜方肌EMG的變化率以表示，組內(nèi)各處理因素之間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK－q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 NRM電刺激下大鼠CMR的變化 當(dāng)給予NRM 75μA的高強(qiáng)度電刺激時(shí)，大鼠EMG反應(yīng)為基礎(chǔ)對(duì)照的（48.15±6.10）%，明顯低于基礎(chǔ)對(duì)照（P＜0.05）；間隔50min后，后對(duì)照恢復(fù)良好，為基礎(chǔ)對(duì)照的（96.16±1.63）%，與基礎(chǔ)對(duì)照比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。NRM對(duì)CAP誘發(fā)的EMG反應(yīng)抑制性調(diào)節(jié)效應(yīng)的原始肌電實(shí)例圖見圖1A，NRM電刺激位點(diǎn)組織再建圖見圖1B。

2.2 NRM電刺激作用下大鼠CMR下行抑制性調(diào)節(jié)脊髓通路的變化 于C1－C2脊髓節(jié)段行雙側(cè)DLF橫斷術(shù)，解剖學(xué)阻斷脊髓DLF下行通路。DLF阻斷前，75μA電刺激NRM的抑制效應(yīng)為基礎(chǔ)對(duì)照的（52.08±6.60）%（P＜0.05）；DLF阻斷后，NRM電刺激的抑制效應(yīng)消失，為基礎(chǔ)對(duì)照的（91.82±2.42）%（P＞0.05）；DLF阻斷前NRM電刺激所產(chǎn)生的肌電效應(yīng)與DLF阻斷后比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。DLF橫斷面積實(shí)例圖見圖2。

圖1 電刺激NRM對(duì)CAP誘發(fā)EMG的抑制性調(diào)節(jié)效應(yīng)原始肌電實(shí)例圖（A）及NRM電刺激位點(diǎn)組織再建圖（B）Fig.1 Raw traces of NRM stimulation－induced inhibitory modulation of EMG responses to CAP from one rat（A）and locations of electrical stimulation sites in NRM（B）

圖2 脊髓C2節(jié)段DLF橫斷面積實(shí)例圖Fig.2 DLF transection area at C2level of spinal cord

2.3 麥角新堿對(duì)NRM電刺激下行抑制性調(diào)節(jié)的翻轉(zhuǎn)效應(yīng) NRM電刺激聯(lián)合鞘內(nèi)微量注射5－HT受體拮抗劑麥角新堿（30和50μg）后所產(chǎn)生的EMG反應(yīng)與NRM電刺激比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但仍未恢復(fù)至基礎(chǔ)對(duì)照水平（P＜0.05）；NRM電刺激聯(lián)合鞘內(nèi)注射麥角新堿溶媒所產(chǎn)生的EMG反應(yīng)與NRM電刺激比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：電刺激NRM可以對(duì)CMR產(chǎn)生抑制調(diào)節(jié)作用；DLF橫斷實(shí)驗(yàn)表明NRM的下行抑制性調(diào)節(jié)是經(jīng)脊髓通路DLF實(shí)現(xiàn)的；鞘內(nèi)注射5－HT受體拮抗劑麥角新堿部分翻轉(zhuǎn)了NRM的下行性抑制效應(yīng)，說(shuō)明5－HT參與了NRM對(duì)心臟傷害性感受的下行抑制性調(diào)節(jié)。

表1 麥角新堿鞘內(nèi)注射對(duì)NRM下行抑制性調(diào)控作用的影響Tab.1 Influence of methysergide intrathecal administration in descending inhibitory modulation of NRM（n＝6，，η／%）

表1 麥角新堿鞘內(nèi)注射對(duì)NRM下行抑制性調(diào)控作用的影響Tab.1 Influence of methysergide intrathecal administration in descending inhibitory modulation of NRM（n＝6，，η／%）

＊P＜0.05compared with control；△P＜0.05compared with NRM stimulation.

Group ide＋NRM stimulation NRM stimualtion Methysergide 30μg 100.0046.94±4.12＊71.50±2.66＊△47.05±5.01 EMG Program：Control NRM stimulation Methyserg＊Methysergide 50μg 100.0044.77±4.44＊70.76±4.67＊△51.00±3.94＊Vehicle 100.0043.10±6.91＊42.15±5.51＊42.00±4.33＊

目前，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為腦干內(nèi)源性下行抑制系統(tǒng)主要由中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（periaqueductal gray，PAG）、延髓頭端腹內(nèi)側(cè)核群（rostral ventromedial medulla，RVM）和一部分腦橋背外側(cè)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)組成，經(jīng)脊髓DLF下行對(duì)延髓和脊髓背角痛覺(jué)感受性信息的傳入產(chǎn)生抑制性調(diào)制［6］。而NRM為RVM核群內(nèi)最重要的一個(gè)核團(tuán)，是內(nèi)源性鎮(zhèn)痛系統(tǒng)的一個(gè)重要的中繼站。在NRM內(nèi)存在3類神經(jīng)元：“停止”神經(jīng)元（off－cell）、“啟動(dòng)”神經(jīng)元（on－cell）和“中性”神經(jīng)元（neutral cell）。許多研究［7－10］發(fā)現(xiàn)：當(dāng)給予NRM高強(qiáng)度的電刺激（50～200μA）時(shí)，可以通過(guò)激活off－cell，抑制oncell，從而對(duì)軀體或內(nèi)臟傷害性刺激起到抑制性調(diào)節(jié)作用，如甩尾反射、熱板反射和直腸／膀胱－軀體運(yùn)動(dòng)反射等，然而這些有關(guān)的研究均局限于軀體痛和腹部臟器痛，有關(guān)心臟傷害性感受的研究很少。本實(shí)驗(yàn)采用了一種新的動(dòng)物模型，通過(guò)CMR證明了NRM對(duì)心臟傷害性感受同樣具有抑制性調(diào)節(jié)作用。

另外許多資料證實(shí)脊髓DLF參與痛覺(jué)下行抑制調(diào)節(jié)。Chandler等［11］研究報(bào)道脊髓電刺激（spinal cord stimulation，SCS）可以抑制由心臟內(nèi)注射緩激肽（bradykinin，BK）引起的胸段脊髓丘腦束神經(jīng)元的興奮活動(dòng)。Zhou等［1］研究報(bào)道：NRM對(duì)內(nèi)臟傷害性感受的抑制性調(diào)節(jié)效應(yīng)是通過(guò)脊髓DLF介導(dǎo)的；在大鼠直腸放置膨脹氣囊產(chǎn)生內(nèi)臟傷害性刺激，觀察脊髓背角神經(jīng)元的電活動(dòng)，當(dāng)給予NRM高強(qiáng)度電刺激（50～200μA）時(shí)，可減少脊髓背角神經(jīng)元的神經(jīng)沖動(dòng)，而在橫斷DLF后，這種抑制效應(yīng)隨即消失。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示：雙側(cè)DLF橫斷后，NRM對(duì)CMR的下行性抑制性調(diào)節(jié)被阻斷，與以往研究結(jié)果一致。綜合以往的研究資料以及本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本文作者認(rèn)為：高強(qiáng)度的電刺激可能主要激活了NRM內(nèi)off－cell，而off－cell的神經(jīng)沖動(dòng)主要通過(guò)脊髓DLF下行發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn)NRM約50%的神經(jīng)元為5－HT能神經(jīng)元，Potrebic等［12］采用抗體微電極技術(shù)發(fā)現(xiàn)NRM內(nèi)的off－cell／on－cell／neutral－cell均呈5－HT免疫陽(yáng)性反應(yīng)，其中5－HT免疫陽(yáng)性反應(yīng)在neutral－cell分布最多，off－cell次之，on－cell最少。而這些5－HT能神經(jīng)元80%以上為縫－脊投射神經(jīng)元，即其投射纖維主要經(jīng)脊髓DLF下行，分布于同側(cè)脊髓后角，可通過(guò)軸－軸突觸影響脊髓后角的傷害性感受神經(jīng)細(xì)胞的活動(dòng)，從而在痛覺(jué)調(diào)制中發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。然而，5－HT對(duì)脊髓傷害性反應(yīng)的調(diào)控是復(fù)雜的，可能產(chǎn)生抑制作用，也有可能產(chǎn)生易化作用，這可能歸因于激活的受體亞型不同、藥物注射的劑量不同或者傷害性刺激類型不同。有研究［13－16］顯示：脊髓的5－HT1、5－HT2和5－HT3受體與鎮(zhèn)痛效應(yīng)有關(guān)。麥角新堿作為非選擇5－HT1和5－HT2受體的拮抗劑被廣泛使用。本研究通過(guò)鞘內(nèi)注射麥角新堿部分翻轉(zhuǎn)了電刺激NRM對(duì)CMR的抑制作用，提示5－HT及其受體參與NRM對(duì)CMR的下行性抑制作用，即高強(qiáng)度電刺激可能主要激活了NRM內(nèi)的off－cell，off－cell的神經(jīng)沖動(dòng)通過(guò)脊髓DLF通路下行，促使大量的5－HT釋放至脊髓背角，導(dǎo)致脊髓背角感覺(jué)神經(jīng)元超極化，從而明顯提高了疼痛的閾值，而一旦麥角新堿阻斷了脊髓背角感覺(jué)神經(jīng)元上的5－HT受體，導(dǎo)致5－HT的抑制作用減弱或消失。即使鞘內(nèi)注射高濃度的麥角新堿（50μg）也沒(méi)有完全阻斷NRM對(duì)CMR的抑制效應(yīng)，這說(shuō)明還有其他脊髓受體參與了源自NRM的抑制性調(diào)節(jié)過(guò)程。研究［14］顯示：雖然NRM內(nèi)5－HT能神經(jīng)元為主導(dǎo)，但是還有不到50%的神經(jīng)元為去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、多種神經(jīng)肽和γ－氨基丁酸（γ－aminobutyric acid，GABA）能神經(jīng)元，其中5－HT與NE、5－HT與阿片肽、5－HT與GABA以及GABA與阿片肽等也多有共存現(xiàn)象，而這些神經(jīng)元的活動(dòng)之間存在著復(fù)雜的構(gòu)筑關(guān)系，至今還不十分清楚。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)中給予NRM電刺激可以減弱大鼠SPT的緊張性反應(yīng)，而DLF和5－HT下行纖維系統(tǒng)參與NRM對(duì)CMR下行性抑制性調(diào)節(jié)。臨床上許多患者在經(jīng)歷過(guò)心絞痛后，會(huì)出現(xiàn)上胸部肌肉緊張性的增加，這與本實(shí)驗(yàn)中的大鼠模型相似。本研究結(jié)果將為心絞痛的臨床神經(jīng)治療研究提供有效的基礎(chǔ)研究資料。

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