大鼠孤束核內(nèi)谷氨酸受體亞型對心臟傷害性感受信息的調(diào)控作用

劉曉華，韓 曼，杜劍青

（1.陜西中醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，陜西 咸陽 712046；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，陜西 西安 710061）

位于延髓的孤束核（nucleus tractus solitarius，NTS）在心血管、呼吸以及胃腸道的初級感覺信息的整合和傳遞中扮演重要的角色［1］。心臟傷害性感受信息主要由伴隨心交感神經(jīng)和心迷走神經(jīng)的傳入纖維傳遞，經(jīng)不同的傳入通路上傳到中樞引起相應(yīng)的反應(yīng)［2］。解剖學(xué)研究［3－4］表明：NTS既是心迷走神經(jīng)傳入的中樞投射部位，同時也是心交感神經(jīng)的中轉(zhuǎn)部位。NTS在傷害性信息的傳遞中扮演不同的角色，既有抑制作用也有易化作用，但NTS對心臟傷害性感覺信息的作用到目前為止尚不清楚。谷氨酸是NTS內(nèi)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，谷氨酸受體分為2大類：一類為離子型受體，包括N－甲基－D－天冬氨酸（N－methyl－D－aspartic acid，NMDA）型、α－氨基－3－羥基－5－甲基－4－惡唑－丙酸（α－amino－3－h(huán)ydroxy－5－methyl－4－isoxazole propionic acid，AMPA）型和海人藻酸（kainic acid，KA）型，后2種也統(tǒng)稱為非NMDA受體，其與離子通道偶聯(lián)，形成受體－通道復(fù)合物，介導(dǎo)快信號或快突觸傳遞；另一類為促代謝型谷氨酸受體（metabotropic glutamate receptors，mGluRs），其與膜內(nèi)的G－蛋白偶聯(lián)，被激活后通過G－蛋白效應(yīng)器酶、胞內(nèi)第二信使等組成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)起作用，產(chǎn)生包括慢突觸傳遞等較緩慢的生理反應(yīng)。NMDA受體和mGluRs參與痛覺過敏［5－6］，但NTS內(nèi)谷氨酸及其受體亞型在心臟傷害感受中的作用尚不清楚。辣椒素是傷害性感受神經(jīng)元的選擇性激活物質(zhì)，可以選擇性地作用于有傷害性感受作用的C和Aδ神經(jīng)纖維末梢［7］。研究［8－9］表明：心臟表面給予辣椒素可以激活伴隨迷走和交感神經(jīng)的傳入纖維，心包內(nèi)注射辣椒素可以誘發(fā)心臟－軀體運(yùn)動反射（cardiosomatic motor reflex，CMR），背斜方肌肌電（electromyogram，EMG）活動明顯增強(qiáng)。本研究利用心包內(nèi)注射辣椒素誘發(fā)的CMR為心臟傷害性感受指標(biāo)，于NTS內(nèi)分別微量注射谷氨酸及各受體亞型拮抗劑觀察其對CMR的影響，確定NTS內(nèi)參與心臟傷害性感受的谷氨酸受體亞型，旨在為NTS內(nèi)參與心臟傷害性感受信息調(diào)控的神經(jīng)遞質(zhì)和受體提供新的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 辣椒素溶于吐溫80和無水乙醇（按1∶1比例混合）溶液中，配制成1×10g·mL－1的貯存液，實(shí)驗(yàn)時用生理鹽水稀釋到所需濃度1mg·L－1。鵝膏蕈氨酸（ibotenic acid，IBO）、谷氨酸、NMDA受體拮抗劑［（＋）－MK－801 hydrogen maleate，MK－801］、非NMDA受體拮抗劑6，7－二硝基喹喔啉－2，3二酮（6，7－dinitroquinoxaline－2，3－dione，DNQX）均用生理鹽水溶解。mGluRs拮抗劑α－甲基，4－羧基苯丙氨酸［（RS）－a－methyl－4－carboxyphenylglycine，MCPG］先用NaOH（1mol·L－1）溶解后，再用生理鹽水稀釋，所有藥物最終的pH值調(diào)整為7.2～7.6，所用藥物均購自美國Sigma公司。BL－420生物信號采集與分析系統(tǒng)（成都泰盟生物科技有限公司），壓力換能器（成都泰盟生物科技有限公司），蠕動泵（BT100－2J，保定蘭格恒流泵有限責(zé)任公司），小動物呼吸機(jī)（DW3000－B型，淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司），大鼠腦立體定位儀（日本Narishige公司），Olympus生物顯微鏡（BX51，日本Olympus公司），0.5μL微量注射器（Hamilton，Reno，Nevada，USA）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物、動物分組及處理方法 健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量260～330g，將其隨機(jī)分為IBO組、谷氨酸組、MK－801組、MCPG組、MCPG聯(lián)合MK－801組和DNQX組；各組大鼠孤束核內(nèi)分別微量注射130mmol·L－1IBO 100nL，10.0、20.0、50.0mmol·L－1谷氨酸100nL，NMDA受體拮抗劑40和60mmol·L－1MK－801100nL，代謝型谷氨酸受體拮抗劑25和50mmol·L－1MCPG 100nL，25mmol·L－1MCPG 50nL聯(lián)合40mmol·L－1MK－80150nL，非NMDA受體拮抗劑20和50mmol·L－1DNQX 100nL。

1.3 大鼠心包插管術(shù)和NTS內(nèi)微量注射手術(shù) 大鼠稱質(zhì)量后以初始劑量的戊巴比妥鈉（45～55mg·kg－1）靜脈滴注麻醉。取俯臥位，暴露左側(cè)背斜方肌，以記錄背斜方肌EMG。再取仰臥位，行氣管插管術(shù)，右側(cè)頸動脈插管監(jiān)測動脈血壓，左側(cè)頸靜脈插管以便在整個實(shí)驗(yàn)過程中維持戊巴比妥鈉的麻醉（10～15mg·kg－1·h－1）。以動脈血壓和瞳孔直徑監(jiān)測實(shí)驗(yàn)動物麻醉深度。①心包插管術(shù)：左側(cè)上胸部第1到第3肋軟骨處行開胸術(shù)，暴露胸腺。中線處分離胸腺，暴露心包膜。玻璃分針尖端（直徑0.5mm）在心包膜上扎開1個小孔，將一長12～14cm遠(yuǎn)端有數(shù)個小洞的硅膠管（內(nèi)徑0.020mm、外徑0.037mm）經(jīng)此孔插入心包約2cm，縫合胸腺和各層胸壁組織，以固定心包插管。②NTS內(nèi)微量注射：將大鼠固定于腦立體定位儀上，剪開枕骨處頭皮，鈍性分離附著于枕骨處的肌肉，暴露枕骨。微型電鉆鉆透枕骨后，用咬骨鉗剝離部分顱骨，在閂部水平去除硬腦膜和軟腦膜。實(shí)驗(yàn)中藥物注射位點(diǎn)以寫翮（第4腦室尾側(cè)最后點(diǎn)）為零坐標(biāo)（相當(dāng)于前囟后14.3mm水平），左側(cè)旁開0.5～0.8mm，吻側(cè)0～0.5mm，腦表面下0.5～0.8mm。微量注射使用尖端與玻璃微電極相連的0.5μL微量注射器，微電極尖端直徑為50～100μm。NTS內(nèi)微量注射量為0.1μL，速度為0.1μL·s－1。根據(jù)以往研究以及預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇藥物的劑量。

1.4 CMR記錄過程 同芯電極以30°的角度插入左側(cè)背斜方肌，記錄其EMG信號，根據(jù)肌肉大小調(diào)節(jié)電極插入深度，插入深度一般為1.5～1.7mm。手術(shù)完畢2～3h，待動物狀態(tài)穩(wěn)定后記錄EMG基線活動60s，NTS內(nèi)微量注射生理鹽水100nL，15min后心包腔內(nèi)注射辣椒素（0.655nmol／0.2mL）1min后回抽并沖洗心包4～6次，同時記錄EMG 60～65s。50min后NTS內(nèi)注射谷氨酸或者谷氨酸受體不同的拮抗劑100nL，15min后心包腔內(nèi)注射辣椒素1min后回抽并沖洗心包，同時記錄EMG 60～65s，觀察藥物對EMG活動的影響。間隔1h后心包腔內(nèi)注射辣椒素0.2mL，觀察EMG恢復(fù)情況。EMG以反應(yīng)中的放電單位總數(shù)計(jì)算，以NTS內(nèi)注射生理鹽水后的EMG反應(yīng)為對照，將其定義為100%。計(jì)算注射藥物后的EMG與生理鹽水比較的百分比。EMG以反應(yīng)中的放電單位總數(shù)計(jì)算，以NTS內(nèi)注射生理鹽水后的EMG反應(yīng)為對照，將其定義為100%；計(jì)算注射藥物后EMG變化的百分比。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，NTS微量注射位點(diǎn)原位微注射2%膀胺天藍(lán)100nL，以標(biāo)記藥物注射位點(diǎn)及擴(kuò)散范圍。10min后靜脈內(nèi)注入過量戊巴比妥鈉（100mg·kg－1）深麻大鼠，經(jīng)左心室插管至升主動脈，先用50mL生理鹽水快速灌注沖洗血液，再用約200mL 10%甲醛溶液灌流固定。灌流結(jié)束后取腦組織，放置于10%的甲醛固定液中室溫固定4h，再轉(zhuǎn)移到20%的蔗糖溶液中4℃沉糖48h。待組織沉糖完全后進(jìn)行冰凍切片，片厚30μm，行尼氏染色，顯微鏡下根據(jù)大鼠腦圖譜進(jìn)一步確定注射位點(diǎn)（圖1）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。EMG變化的百分比以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素重復(fù)測量方差分析。

圖1 NTS內(nèi)微量注射位點(diǎn)圖Fig.1 Microinjection sites in NTS

2 結(jié) 果

2.1 NTS內(nèi)微量注射IBO后CMR的變化 NTS聯(lián)合部微量注射130mmol·L－1IBO 100nL，1和2h后EMG放電總數(shù)分別為（56.4±6.9）%和（40.5±5.4）%，與對照組比較明顯下降（P＜0.01）。見圖2。

圖2 NTS內(nèi)注射IBO后CMR的肌電圖Fig.2 EMG activities of CMR after intra－NTS injection of IBO

2.2 NTS內(nèi)微量注射谷氨酸后CMR的變化NTS內(nèi)分別微量注射100、200和500mmol·L－1谷氨酸后，EMG活動分別為（116.9±4.9）%、（143.9±10.2）%和（214.2±15.8）%，與生理鹽水對照組比較CMR均增加（P＜0.05）。見圖3。

2.3 NTS內(nèi)微量注射谷氨酸受體亞型拮抗劑后CMR的變化 NTS內(nèi)微量注射40和60mmol·L－1MK－801100nL后，EMG活動分別為（45.2±10.6）%和（36.8±14.3）%，與生理鹽水對照組比較明顯下降（P＜0.05）。NTS內(nèi)微量注射25和50mmol·L－1MCPG后，EMG活動分別為（65.2±16.3）%和（57.0±4.2）%，與生理鹽水對照組比較明顯下降（P＜0.05）。NTS內(nèi)聯(lián)合微量注射25mmol·L－1MCPG和80mmol·L－1MK－801后，EMG活動為（22.5±13.2）%，與單獨(dú)注射MCPG或者M(jìn)K－801后比較EMG活動明顯下降（P＜0.05）。NTS內(nèi)微量注射20和50mmol·L－1DNQX后，EMG反應(yīng)為（99.6±18.6）%和（104±12.4）%，與生理鹽水對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 NTS內(nèi)注射谷氨酸和谷氨酸受體拮抗劑后CMR的肌電圖Fig.3 EMG activities of CMR after intra－NTS injection of glutamate and glutamate receptor antagonists

3 討 論

以往研究［2，10］表明：心臟感覺傳入神經(jīng)纖維至少通過2條通路上傳到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，即伴隨心交感神經(jīng)的傳入纖維和伴隨心迷走神經(jīng)的傳入纖維。大部分迷走傳入神經(jīng)纖維直接投射到位于延髓的NTS。束路追蹤研究［3］表明：心臟交感傳入神經(jīng)纖維通過星狀神經(jīng)節(jié)和交感神經(jīng)鏈投射到上胸段脊髓背角，而來自脊髓頸部和胸部背角的投射纖維中樞部同樣也會終止于NTS［4］。Albutaihi等［11］研究表明：心包內(nèi)注射化學(xué)致痛劑可以誘發(fā)c－Fos在NTS內(nèi)的表達(dá)。這些結(jié)果提示NTS是心臟傷害性感覺信息傳遞的重要驛站。在本實(shí)驗(yàn)中NTS聯(lián)合部微量注射選擇性的神經(jīng)元胞體損毀劑IBO，抑制了心包腔內(nèi)注射辣椒素誘發(fā)的EMG反應(yīng)；NTS聯(lián)合部內(nèi)微量注射興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸以選擇性地激活神經(jīng)元胞體，結(jié)果顯示谷氨酸對心包內(nèi)注射辣椒素誘發(fā)的CMR有明顯的易化作用，且呈劑量依賴性的增加關(guān)系。這2項(xiàng)結(jié)果提示：NTS在心臟傷害性感覺信息的中樞調(diào)控過程中起易化作用，且這種易化作用是以谷氨酸作為其興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的。該結(jié)果與以往的研究結(jié)果一致，解剖學(xué)以及電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究［12－13］證明：谷氨酸是NTS內(nèi)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，激活NTS內(nèi)神經(jīng)元可以對傷害性感受產(chǎn)生易化調(diào)控作用。由于NTS同時是心臟傷害性感受的初級傳入中樞，對于這種易化作用的產(chǎn)生有2種可能：一種是谷氨酸激活了NTS參與的傷害性信息的內(nèi)源性下行易化調(diào)控通路；另外可能是因谷氨酸是心臟傷害性感受初級傳入纖維在NTS內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)，注射谷氨酸增加了初級傳入信息從而產(chǎn)生易化效應(yīng)。對于這2種可能性還需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

免疫細(xì)胞研究以及分子生物學(xué)研究證實(shí)：NMDA受體、非NMDA受體以及代謝型谷氨酸受體亞型在NTS內(nèi)均有表達(dá)［14－15］。不同的谷氨酸受體亞型在傷害性感受的作用有所不同。研究［5－6］表明：NTS內(nèi)的NMDA受體介導(dǎo)胃內(nèi)注射鹽酸誘發(fā)的胃痛覺感受；mGluRs對炎癥誘發(fā)的脊髓超興奮的產(chǎn)生是必須的，并且mGluR參與痛覺過敏的行為學(xué)反應(yīng)的形成。但是，NTS內(nèi)谷氨酸各受體亞型在心臟傷害性感覺信息的調(diào)控中的作用尚未見報(bào)道。

為了進(jìn)一步明確不同的谷氨酸受體亞型在心臟傷害性感受中的作用，本研究觀察不同受體亞型拮抗劑對心包內(nèi)注射辣椒素誘發(fā)的CMR的影響，結(jié)果顯示：微量注射NMDA受體拮抗劑MK－801對CMR有明顯的抑制作用，提示NTS內(nèi)的NMDA受體參與心臟傷害性感受的易化調(diào)控作用。該結(jié)果與以往研究［5］結(jié)果一致。以往研究［5］已經(jīng)明確表明：腦干NMDA受體在痛覺的下行易化調(diào)節(jié)通路中有重要的作用。NMDA受體拮抗劑AP－V直接注射到延髓頭端腹內(nèi)側(cè)部（RVM）阻止了結(jié)腸炎癥和芥子油誘發(fā)的內(nèi)臟痛覺過敏。但是，本研究中非NMDA受體拮抗劑DNQX對CMR無明顯的影響，說明NTS內(nèi)非NMDA受體未參與NTS對心臟傷害性信息的易化調(diào)控作用。mGluRs是與G蛋白偶聯(lián)的受體家族。研究［6］顯示：脊髓mGluRs對炎癥誘發(fā)的脊髓超興奮的產(chǎn)生有重要的意義；同時mGluRs的激活參與痛覺過敏的行為學(xué)反應(yīng)的產(chǎn)生［16］，提示mGluRs在痛覺的下行易化調(diào)節(jié)中有重要的作用。本研究中NTS內(nèi)微量注射mGluRs拮抗劑MCPG使心包腔內(nèi)注射辣椒素誘發(fā)的肌肉痛覺過敏降低，提示NTS內(nèi)的mGluR參與心臟傷害性感受的易化調(diào)控。但是，不同的mGluRs亞型在心臟傷害性感受調(diào)控中的作用還需進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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