虎杖內(nèi)生真菌抗菌活性研究及菌株初步鑒定

彭 浩， 陳文強(qiáng)， 鄧百萬(wàn)， 蘭阿峰

(陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心， 陜西 漢中 723000)

0 引 言

內(nèi)生菌(endophyte)是指那些在其生活史中的某段時(shí)期或全部階段生活在植物組織內(nèi)，對(duì)植物組織沒(méi)有明顯引起病害癥狀的一類真菌[1]，其分布廣泛，主要生長(zhǎng)在植物表皮下的組織當(dāng)中。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究人員從多種藥用植物內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物中分離出具有各種生理活性的物質(zhì)[2-3]。藥用植物內(nèi)生真菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)存在極大的多樣性，如具有抗腫瘤、抗病毒、抗細(xì)菌、抗真菌、抗蟲(chóng)等[4-7]，表明藥用植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、功能特殊的次生代謝產(chǎn)物，是新化合物、新藥物的潛在資源，它們?cè)卺t(yī)藥、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景[8]。

虎杖(Polygonumcuspidatum)始載于《名醫(yī)別錄》，為蓼科植物虎杖的根莖(《中國(guó)藥典》第194頁(yè))，主要分布在我國(guó)湖北、四川、陜西等20多個(gè)省份。其性味微苦，微寒，歸肝、膽、肺經(jīng)，具活血散瘀定痛，清熱解毒利濕，化痰止咳通喘之功效[9-10]。主要有效成分為芪類和蒽醌類化合物，前者包括白藜蘆醇及其糖苷[11]，據(jù)報(bào)道白藜蘆醇具有抑制腫瘤、抗氧化、抗自由基、抗血栓、抗過(guò)敏、抗動(dòng)脈粥樣硬化和具有對(duì)冠心病、缺血性心臟病、高血脂癥的防治作用[12-13]，白藜蘆醇已被列為抗心血管疾病、抗癌最有前途的藥物之一[14]?；⒄燃鍎┰隗w外對(duì)金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、變形桿菌、綠膿桿菌等均有一定抑制作用[15-16]。

藥用植物虎杖自身具有較明顯的抑菌作用，在內(nèi)生菌與其長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的過(guò)程中，其基因的互相交換使得部分內(nèi)生菌具有和虎杖類似的抑菌作用。國(guó)內(nèi)有關(guān)虎杖內(nèi)生真菌抗菌活性的研究，僅有曾松榮等在分離得到的24株虎杖內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)，有3株內(nèi)生真菌分別對(duì)枯草芽孢桿菌、藤黃八疊球菌(Micrococcusluteus)、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、乙型副傷寒桿菌(SalmonellaparatyphiB)、白色念珠菌(Moniliaalbican)、擲孢酵母(Sporobolomycetaceaesp.)等8種受試菌均有明顯抑制作用。

秦巴山區(qū)生境獨(dú)特、氣候溫暖濕潤(rùn)，藥用植物資源豐富，而有關(guān)虎杖內(nèi)生真菌的分離及抗菌活性的相關(guān)研究報(bào)道甚少。本研究通過(guò)對(duì)分離自秦巴山區(qū)虎杖根莖的30株內(nèi)生真菌進(jìn)行抑菌研究，旨在掌握該地區(qū)具有抑菌作用虎杖內(nèi)生真菌的多樣性，尋找新的抑菌活性物質(zhì)，為進(jìn)一步研發(fā)抗菌新藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

虎杖內(nèi)生真菌30株，由陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心提供。

1.1.2 靶標(biāo)菌株

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、白色念珠菌(Candidaalbicans)共4種，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。

1.1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(g/L)：去皮馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂20.0 g；馬鈴薯葡萄糖(PDB)培養(yǎng)基(g/L)：去皮馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂20.0 g，pH 7.2；沙氏瓊脂(SDA)培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0 g，葡萄糖40.0 g，瓊脂20.0 g，pH 5.6 ± 0.2。查氏(Czapek)培養(yǎng)基(g/L): NaNO32.0 g，K2HPO41.0 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蔗糖30.0 g，瓊脂15.0 g，pH 6.7。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備

恒溫振蕩器(ZHWY-2102C，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司)，超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，電子天平(BJ100M，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司)，立式蒸氣滅菌器(LS-B50L，上海醫(yī)用核子儀器廠)，人工氣候箱(LRH-800-GS，韶關(guān)市明天環(huán)保儀器有限公司)等。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的活化

內(nèi)生真菌活化：無(wú)菌條件下，分別將30株虎杖內(nèi)生真菌采用點(diǎn)植法轉(zhuǎn)入PDA試管斜面中，(28±1)℃下培養(yǎng)，菌絲滿斜面后置于4 ℃恒溫箱中保藏備用。

靶標(biāo)菌株的活化：無(wú)菌條件下，分別將大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌轉(zhuǎn)入牛肉膏蛋白胨試管斜面及沙氏瓊脂試管斜面中，(36±1)℃下培養(yǎng)，待菌苔形成后，置于4 ℃恒溫箱中保藏備用。

1.2.2 內(nèi)生真菌的液體培養(yǎng)及發(fā)酵液處理

將分離純化好的內(nèi)生真菌菌株在無(wú)菌條件下，取0.5 mm×0.5 mm菌塊接種于盛有200 mL PDB培養(yǎng)基的三角瓶中，28 ℃，160 r/min振蕩培養(yǎng)7 d。將培養(yǎng)的內(nèi)生真菌發(fā)酵液先以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾并將濾液裝入無(wú)菌小三角瓶中，置于4 ℃恒溫箱中保藏備用。

1.2.3 菌株發(fā)酵液抑菌試驗(yàn)

采用濾紙片擴(kuò)散法[17]，挑取少量活化24～48 h的靶標(biāo)菌株，在裝有10 mL無(wú)菌水的試管中反復(fù)洗滌，搖勻，制成菌懸液。用微量取液器分別取大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌菌懸液各0.2 mL注入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和沙氏瓊脂平板表面，無(wú)菌玻棒涂布均勻，然后將以虎杖內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸泡2 h、直徑為8.0 mm的無(wú)菌濾紙片貼到培養(yǎng)基表面，每皿貼4片，每2片為1株菌的發(fā)酵液，(36±1)℃培養(yǎng)24～48 h后觀察，并測(cè)量抑菌圈直徑。

1.2.4 菌株的初步鑒定

將有抑菌活性的內(nèi)生真菌菌株轉(zhuǎn)入查氏平板中，(28±1)℃培養(yǎng)5～7 d，觀察菌絲生長(zhǎng)并作記錄。待平板里菌落不再有明顯增大后，根據(jù)菌落形態(tài)特征、菌絲結(jié)構(gòu)以及孢子形態(tài)等結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》及《常見(jiàn)與常用真菌》[18-19]對(duì)其進(jìn)行初步分類鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 虎杖內(nèi)生真菌抑菌試驗(yàn)

通過(guò)1.2.3方法對(duì)30株虎杖內(nèi)生真菌發(fā)酵液進(jìn)行抑菌活性試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。

表1 虎杖內(nèi)生真菌抑菌試驗(yàn)

注：“+”表示抑菌直徑為8～10 mm；“++”表示抑菌直徑為10～14 mm；“+++”表示抑菌直徑為14～19 mm；“-”代表沒(méi)有抑菌圈。

(a)大腸桿菌(Escherichia coli) (b)枯草桿菌(Bacillus subtilis)

(c)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (d)白色念珠菌(Candida albicans) 圖1 虎杖內(nèi)生真菌抑菌試驗(yàn)結(jié)果

表1、圖1結(jié)果表明，共有16株內(nèi)生真菌的發(fā)酵液對(duì)3種受試菌有不同程度的抑制作用，占菌株總數(shù)的53.3%。且在16株具抑菌活性的菌株中，15株菌對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用，占93.7%。其中F225、L101、L112、L213對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)抑制作用；12株菌對(duì)枯草芽孢桿菌有抑制作用，占75.0%。其中F104、F225、L102、L112、L213、L256對(duì)枯草芽孢桿菌有較強(qiáng)抑制作用；7株菌對(duì)大腸埃希氏桿菌有抑制作用，占43.7%。其中L101、L237抑制作用明顯，菌株L101對(duì)大腸埃希氏桿菌、枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌均有明顯抑制，此試驗(yàn)中的30株虎杖內(nèi)生真菌中暫未發(fā)現(xiàn)對(duì)白色念珠菌有抑制作用的菌株。

研究結(jié)果表明，篩選出的16株菌株對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌均具有明顯的抑制作用，而只有部分菌株對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌有抑制作用，這與孔亞男等[20]對(duì)虎杖內(nèi)生放線菌的抑菌活性研究結(jié)果相一致。

2.2 菌株的初步鑒定

根據(jù)1.2.4方法對(duì)16株具有抑菌活性的內(nèi)生真菌菌株進(jìn)行初步鑒定，結(jié)果表明這些真菌分屬于半知菌亞門絲孢綱絲孢目淡色孢科曲霉屬(Aspergillussp.)、青霉屬(Penicilliumsp.)，半知菌亞門絲孢綱絲孢目暗色孢科枝孢屬(Cladosporiumsp.)，半知菌亞門絲孢綱瘤座孢目鐮刀菌屬(Fusariumsp.)及半知菌亞門絲孢綱無(wú)孢菌目無(wú)孢科無(wú)孢菌類(Agonomycetalessp.)真菌(表2)。

表2 抑菌菌株種群組成及抑制類型

表2結(jié)果表明，具抑菌活性的16株虎杖內(nèi)生真菌分屬半只菌亞門3目、4科、5屬，具有一定物種多樣性，而絲孢目真菌占抑菌菌株的56%。同時(shí)，在上述菌株中，曲霉屬有2株菌對(duì)G-、G+細(xì)菌均有抑制作用，3株菌只對(duì)G+細(xì)菌有抑制作用；青霉屬有3株菌對(duì)G-、G+細(xì)菌均有抑制作用，1株菌只對(duì)G+細(xì)菌有抑制作用；枝孢屬的2株菌只對(duì)G+細(xì)菌有抑制作用；鐮刀菌屬有1株菌對(duì)G-、G+細(xì)菌均有抑制作用，2株菌只對(duì)G+細(xì)菌有抑制作用；無(wú)孢菌類1株菌對(duì)G-、G+細(xì)菌均有抑制作用，1株菌只對(duì)G+細(xì)菌有抑制作用。

3 討 論

植物內(nèi)生菌在近一個(gè)多世紀(jì)的研究過(guò)程中，有越來(lái)越多的內(nèi)生菌先后被分離、純化。同時(shí)，紫杉醇、喜樹(shù)堿、三尖杉酯堿、鬼臼素及長(zhǎng)春花堿等具有抗癌活性的物質(zhì)也從這些內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物中被檢測(cè)發(fā)現(xiàn)。表明植物內(nèi)生菌是極具潛力的一個(gè)微生物資源寶庫(kù)，具有重要的醫(yī)藥應(yīng)用價(jià)值，必將在天然藥物研究中得到廣泛開(kāi)發(fā)和利用[21-23]。

虎杖作為傳統(tǒng)中藥在我國(guó)已有千年的使用歷史，其本身就具有抗菌、抗病毒、鎮(zhèn)咳、平喘等作用?；⒄葍?nèi)生真菌由于在和虎杖長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的過(guò)程中發(fā)生了基因相互交換，使得部分內(nèi)生真菌具有和虎杖類似的藥理作用。本研究采用濾紙片擴(kuò)散法對(duì)30株虎杖內(nèi)生真菌發(fā)酵液進(jìn)行抑菌活性試驗(yàn)，其中15株內(nèi)生真菌對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑菌活性，12株內(nèi)生真菌對(duì)枯草芽孢桿菌具有抑菌活性，7株內(nèi)生真菌對(duì)大腸埃希氏菌具有抑菌活性，分別占菌株總數(shù)的50%，40%和23%。根據(jù)菌落形態(tài)及菌絲結(jié)構(gòu)對(duì)其初步鑒定，具有抑菌活性的菌株分屬于曲霉屬、青霉屬、枝孢霉屬、鐮刀菌屬及無(wú)孢菌類真菌。此研究為進(jìn)一步保護(hù)、利用、開(kāi)發(fā)虎杖內(nèi)生真菌寶貴資源和研發(fā)新穎的抗菌藥物具有一定作用。

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