鹽蒿內(nèi)生耐(嗜)鹽真菌的分離及鑒定

丁小維

(陜西理工學(xué)院 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000)

0 引 言

耐(嗜)鹽真菌是能夠在鹽濃度為0.2 mol/L以上環(huán)境中生長的真菌，主要分布在鹽湖、鹽田、海洋等高鹽環(huán)境中。目前，對耐(嗜)鹽真菌的研究主要集中在海洋環(huán)境耐(嗜)鹽真菌物種多樣性及其代謝產(chǎn)活性物質(zhì)方面[1-3]，而對植物內(nèi)生耐(嗜)鹽真菌的研究相對較少。鈕旭光等[4]從遼寧雙臺子國家自然保護(hù)區(qū)內(nèi)陸鹽堿地及潮間帶生長的翅堿蓬(Suaedasalsa)中分離到13個屬的內(nèi)生真菌。在高鹽環(huán)境中生長的耐鹽植物組織中可能蘊(yùn)藏著豐富的耐鹽內(nèi)生真菌。此外，研究證實(shí)高鹽地區(qū)植物內(nèi)生真菌對宿主適應(yīng)鹽逆境方面發(fā)揮重要作用[5-7]。因此，研究內(nèi)陸極端鹽湖區(qū)植物內(nèi)生耐(嗜)鹽真菌可為耐鹽植物的培育及促進(jìn)鹽堿化土壤的綜合利用提供豐富的菌種資源。

花馬鹽湖屬于堿性碳酸鹽型內(nèi)陸高鹽湖泊，位于陜西省榆林定邊縣城西北10 km處的鹽場堡鄉(xiāng)?；R鹽湖蘊(yùn)藏著非常豐富的碳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀及氯化鈣等資源。該鹽湖區(qū)寒暑變化劇烈，年降水量小(年降水約為316.9 mm)，日照強(qiáng)烈，蒸發(fā)量大(年蒸發(fā)量高達(dá)2 490 mm)，干燥及輻射強(qiáng)烈，因此具有高鹽堿、大溫差、高寒、高熱、干燥及強(qiáng)輻射等極端環(huán)境特征。鹽湖區(qū)沉積物Na+濃度從46.7 g/kg到飽和Na+濃度，生長于湖岸的鹽蒿其組織中Na+含量為普通植物6倍多，該地區(qū)無疑是發(fā)掘極端耐(嗜)鹽真菌多樣性的理想?yún)^(qū)域之一。

本文利用不同含鹽培養(yǎng)基分離純化花馬鹽湖區(qū)耐鹽植物鹽蒿的耐(嗜)鹽真菌，基于形態(tài)學(xué)和ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系認(rèn)識真菌物種多樣性，豐富我國鹽湖真菌菌種資源，為耐(嗜)鹽真菌的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗材料

鹽蒿(A.halodendron)采自陜北榆林定邊縣北鹽堡鄉(xiāng)花馬鹽湖區(qū)(海拔1 301 m，緯度37°40′478N，經(jīng)度107°30′724E)。新鮮的植物材料收集于塑料袋中，置于冰盒中帶回實(shí)驗室，用于分離耐(嗜)鹽真菌。

1.1.2 分離培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：(1)改良馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(cPDA)：去皮馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO41.5 g/L，維生素B110 mg/L，瓊脂粉15 g/L，pH自然；(2)麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA)：麥芽提取物20 g/L，蛋白胨1 g/L，葡萄糖15 g/L，瓊脂15 g/L，pH 6；(3)酵母膏葡萄糖蛋白胨(YPD)：酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉15 g/L，pH自然。在上述3種分離培養(yǎng)基中分別添加濃度為2.5%，5%，10%和15%的NaCl。

1.1.3 主要儀器和設(shè)備

主要儀器設(shè)備：光學(xué)顯微鏡(E600型，日本尼康公司)，熒光倒置顯微成像系統(tǒng)(奧林巴斯IX71/IX81)，冷凍超速離心機(jī)(Beckman)，PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad)，電泳儀(Bio-Rad)，紫外凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)及DNA測序儀(ABI PRISM 377)等。

1.2 方法

1.2.1 耐(嗜)鹽真菌的分離純化

將鹽蒿莖、葉組織置于自來水下沖洗4～5 h后，在無菌條件下依次用有效氯含量為4.5%～5%的次氯酸鈉(含0.01% Tween 80)處理3 min，用75%乙醇處理15 s，最后用無菌水清洗6次。將表面消毒徹底的植物材料切成0.5 cm2小塊，并置于分離培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)1～3 w，挑取菌絲接入含5% NaCl的YPD斜面純化培養(yǎng)，純化斜面于4 ℃保藏備用。

1.2.2 耐(嗜)鹽真菌的鑒定

采用形態(tài)學(xué)并結(jié)合ITS系統(tǒng)發(fā)育分析對內(nèi)生真菌進(jìn)行鑒定。菌落培養(yǎng)特征、菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子特征參照魏景超主編的《真菌鑒定手冊》進(jìn)行鑒定[8]。采用CTAB法[9]提取鹽蒿內(nèi)生真菌基因組DNA。PCR反應(yīng)體系(25 μL)：超純無菌水9 μL，2×PCR Mix 11 μL，10 μmol/L的ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS2(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)各2 μL，基因組DNA約50 ng；PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 變性1 min，55 ℃退火40 s，72 ℃ 擴(kuò)增1 min，35個循環(huán)；72 ℃再保持10 min。PCR產(chǎn)物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。序列提交GenBank，并下載相似性高的數(shù)據(jù)，用Clustal-X[10]軟件對所得序列文件進(jìn)行比對分析，通過Mega 4.0軟件構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐(嗜)鹽真菌的分離

利用cPDA、YPG及MEA培養(yǎng)基分離鹽蒿內(nèi)生真菌，從表面消毒的莖、葉組織塊中共分離到1 215株真菌，以YPG上獲得的內(nèi)生真菌菌株數(shù)最多，占35.5%，而在cPDA和MEA上分離到的菌株數(shù)較YPG的少。培養(yǎng)基不同鹽濃度對內(nèi)生真菌分離研究表明，以含鹽濃度為15%的NaCl培養(yǎng)基上出菌數(shù)最多(404株)，含5%NaCl的培養(yǎng)基次之(340株)，分別占其出菌總數(shù)的33.3%和28%。

2.2 耐(嗜)鹽真菌的鑒定

2.2.1 耐(嗜)鹽真菌的形態(tài)學(xué)

形態(tài)學(xué)研究表明，不同形態(tài)種的菌落特征正反面形態(tài)及顏色差異很大(圖1，表1)，如AH-1菌落較圓整平鋪，正面粉紅色，反面內(nèi)側(cè)淺灰黑色，外側(cè)粉紅色，菌絲較粗壯、發(fā)達(dá)，分枝有隔(圖1A,C)；AH-18菌落正面乳白色菌絲上有土黃色孢子分生孢子頭，反面黃色，菌絲分枝有隔，分生孢子梗上產(chǎn)生球形孢子，大小2.0 μm×2.0 μm(圖1B,D)；AH-35菌落正面黃綠色，反面黃褐色，分生孢子球形或近球形，大小2.5 μm×2.5 μm，(2.0～2.5)μm×(2.5～4.75)μm。基于菌落和顯微形態(tài)特征，從鹽蒿中獲得的內(nèi)生真菌屬于9個不同的形態(tài)種，以AH-1為優(yōu)勢種，其分離頻率為78.8%，其余菌株分離頻率在0.09%～2.1%之間(表1)。

圖1 鹽蒿部分耐(嗜)鹽真菌菌落及顯微形態(tài)特征

菌株編號分離頻率/%形態(tài)學(xué)特征(菌絲、孢子大小/μm)ITS/%GenBank中最相似種及其登錄號分類地位AH-178.8菌落較圓整,正面粉紅色,反面產(chǎn)脂溶性黑色素;菌絲(5.0～8.75)粗壯、發(fā)達(dá),分枝有隔,且局部膨大;菌絲內(nèi)生孢子呈圓形,大小(2.25～2.5)×(2.25～2.5)99/97Pleosporales sp.HQ914837Leptosphaeria sp.AH-20.2菌落圓整,正面內(nèi)側(cè)淺灰色,外側(cè)青綠色,反面淺黃色;菌絲分枝有隔;產(chǎn)生帚狀枝,分生孢子呈球形99Penicillium chrysogenum,JQ015265PenicilliumchrysogenumAH-40.7菌落正面黃綠色,反面黃褐色;分生孢子球形或近球形99Trichoderma longibrachiatum,HQ882796Trichoderma sp.AH-180.09菌落正面乳白色菌絲上有土黃色孢子分生孢子頭,反面黃色;菌絲分枝有隔,分生孢子梗上產(chǎn)生球形孢子,大小2.0×2.0100Aspergillus westerdijkiae,JN793950Aspergillus westerdijkiaeAH-200.09菌落較圓整平鋪,正面粉紅色,反面內(nèi)側(cè)淺灰黑色,外側(cè)粉紅色;菌絲較粗壯、發(fā)達(dá),分枝有隔;未見產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)100Alternaria tenuissima,JQ417902Alternaria sp.AH-222.1菌落呈褐色絨狀,菌絲分枝有隔;分生孢子榴彈形,有縱橫隔100Alternaria tenuissima,JQ417902Alternaria tenuissimaAH-290.09菌落呈灰褐色絨狀,菌絲分枝有隔;分生孢子榴彈形,有3～5個縱橫隔,孢子大小(10～15)×(30～36)100Alternaria alternata,JQ070079Alternaria alternataAH-340.2菌落正反面淺粉色,棉絮狀;菌絲有隔分枝;未見分生孢子99Fusarium chlamydosporum,HQ671187Fusarium sp.AH-350.09菌落正面黃綠色,反面黃褐色;分生孢子球形或近球形,大小2.5×2.5,(2.0～2.5)×(2.5～4.75)99/100Trichoderma longibrachiatum,JQ653055Trichoderma longibrachiatum

2.2.2 ITS的系統(tǒng)發(fā)育分析

鹽蒿內(nèi)生真菌ITS的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示，8個代表菌株(AH-2，AH-4，AH-18，AH-20，AH-22，AH-29，AH-34及AH-35)的ITS序列同GenBank數(shù)據(jù)庫中序列相似性≥99%，聚于系統(tǒng)發(fā)育樹分枝上的步長值在74%～100%之間。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，上述菌株屬于Penicillium、Trichoderma、Aspergillus、Alternaria及Fusarium，被鑒定為Penicilliumchrysogenum、Aspergilluswesterdijkiae、Alternariatenuissima和Trichodermalongibrachiatum等。菌株AH-1，AH-32，AH-58，AH-64和AH-77同GenBank數(shù)據(jù)庫中格孢菌目(Pleosporales)一真菌的ITS序列相似性為97%，上述菌株內(nèi)聚于一個分枝上，步長值分別為99%?；谛螒B(tài)學(xué)特征，上述5個菌株為Leptosphaeria屬的一潛在新物種。Leptosphaeria是花馬鹽湖鹽蒿內(nèi)生真菌的優(yōu)勢屬，其次為Alternaria，分別占78.8%和2.28%。研究結(jié)果表明，陜北花馬鹽湖堿蓬中蘊(yùn)藏著較豐富的耐(嗜)鹽真菌。上述真菌的ITS序列提交GenBank登錄號為：KC460798，KC460799，KC460801，KC460814，KC460816，KC460818，KC460825，KC460828，KC460830，KC460831，KC460858和KC460871。

圖2 鹽蒿內(nèi)生真菌ITS鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹分析

3 討 論

研究了通過含鹽濃度不同的cPDA、MEA及YPG培養(yǎng)基分離鹽蒿內(nèi)生耐(嗜)真菌并研究物種多樣性。從鹽蒿莖、葉組織中共分離到1 215株真菌，在YPG上獲得的內(nèi)生菌株數(shù)最多，以含NaCl濃度為15%的培養(yǎng)基出菌率最高。楊麗源等[12]分離耐(嗜)鹽真菌時發(fā)現(xiàn)，鹽礦水樣中的真菌在以5%NaCl的YPG培養(yǎng)基上出菌數(shù)最多，某些固體樣則以含5%或15%的NaCl培養(yǎng)基為最佳。由于樣品類型差異，為獲得鹽蒿中多樣的耐(嗜)鹽真菌，分離培養(yǎng)基的鹽濃度需要多樣化。

近年來，形態(tài)學(xué)和ITS序列分析被廣泛應(yīng)用于真菌物種多樣性研究[13-15]。由于ITS序列長度合適，具有較高的種間變異和低種內(nèi)變異及其在GenBank，EMBL/ENA及DDBJ等國際數(shù)據(jù)庫中有大量參考序列，被認(rèn)為是真菌鑒定的理想分子標(biāo)簽[16-17]。本研究從花馬鹽湖鹽蒿中獲得6個真菌屬，Leptosphaeria為優(yōu)勢屬，獲得9個形態(tài)種如P.chrysogenum、A.westerdijkiae、Al.tenuissima和T.longibrachiatum等。鈕旭光等[4]從翅堿蓬根、莖及葉組織中獲得49株的內(nèi)生真菌，以Glomerella、Alternaria、Colletotrichum和Cladosporium為優(yōu)勢菌屬。雖然不同生境中的鹽蒿內(nèi)生真菌群落豐富度存在一定相似性，但在某些種屬分布存在差異性，這可能由于某些內(nèi)生真菌具有宿主特異性，且其分布受宿主所生長的環(huán)境影響。本研究探討鹽湖鹽蒿內(nèi)生耐(嗜)鹽真菌物種多樣性，將為耐(嗜)鹽真菌的開發(fā)利用提供菌種資源。

[參考文獻(xiàn)]

[1] WANG W,WANG Y,TAO H,et al.Cerebrosides of the halotolerant fungusAlternariaraphaniisolated from a sea salt field[J].J Nat Prod.,2009,72(9):1695-1698.

[2] ZHENG J,XU Z,WANG Y,et al.Cyclic Tripeptides from the halotolerant fungusAspergillussclerotiorumPT06-1[J].J Nat Prod.,2010,73(6):1133-1137.

[3] 黃菁菁,魯春華,錢曉鳴,等.臺灣海峽海洋耐(嗜)鹽真菌及其抗菌活性的初步研究[J].廈門大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2008,47(5):723-727.

[4] 鈕旭光,宋立超，韓梅，等.鹽生植物翅堿蓬的內(nèi)生真菌多樣性分析.微生物學(xué)通報[J].2012,39(10):1388-1395.

[5] RODRINGUEZ R J,HENSON J,VOLKENBURGH Van E,et al.Stress tolerance in plants via habitat-adapted symbiosis[J].ISME J.,2008,2(4):404-416.

[6] YOU Y H,YOON H,KANG S M,et al.Fungal diversity and plant growth promotion of endophytic fungi from six halophytes in Suncheon Bay[J].J Microbiol. Biotechnol,2012,22(11):1549-1556.

[7] Maciá-Vicente J G,Ferraro V,Burruano S,et al.Fungal assemblages associated with roots of halophytic and non-halophytic plant species vary differentially along a salinity gradient[J].Microb Ecol.,2012,64(3):668-679.

[8] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W(xué)出版社，1979.

[9] ZHANG D,YANG Y,CASTLEBURY L A,et al.A method for the large scale isolation of high transformation efficiency fungal genomic DNA[J].FEMS Microbiol Lett.,1996(145):261-265.

[10] THOMPSON J D,GIBSON T J,PLEWNIAK F,et al.The Clustal X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic Acids Res.,1997(24):4876-4882.

[11] TAMURA K,DUDLEY J,NEI M,et al.MEGA4:Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0[J].Mol Biol Evol.,2007,24(8):1596-1599.

[12] 楊麗源，李治瀅，李紹蘭，等.一平浪鹽礦耐鹽真菌的種群調(diào)查[J].云南大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2002,24(6):465-468.

[13] BLAXTER M L.The promise of a DNA taxonomy[J].Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.,2004,359(1444):669-679.

[14] SCHINDEL D E,MILLER S E.DNA barcoding a useful tool for taxonomists[J].Nature,2005,435(7038):17.

[15] SCHOCH C L,SEIFERT K A,HUHNDORF S,et al.Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for fungi[J].Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(16):6241-6246.

[16] BEGEROW D,NILSSON H,UNTERSEHER M,et al.Current state and perspectives of fungal DNA barcoding and rapid identification procedures[J].Appl Microbiol Biotechnol.,2010(87):99-108.

[17] DENTINGER B T,DIDUKH M Y,MONCALVO J M.Comparing COI and ITS as DNA barcode markers for mushrooms and allies (Agaricomycotina)[J].PLoS One,2011,6(9):e25081.