多粘類芽孢桿菌PS04胞外多糖分子結(jié)構(gòu)研究

蹇華麗，田文祥，楊幼慧，廖美德

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642；2.佛山市一方制藥股份有限公司，廣東佛山528244；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，廣東廣州510642）

多粘類芽孢桿菌PS04胞外多糖分子結(jié)構(gòu)研究

蹇華麗1，田文祥2，楊幼慧1，廖美德3，*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642；2.佛山市一方制藥股份有限公司，廣東佛山528244；3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，廣東廣州510642）

采用丙烯葡聚糖凝膠S-200 HR對PS04多糖進(jìn)行過濾層析，得到單一組分峰，且通過凝膠滲透色譜法分析測定，可知該多糖重均分子量為4009ku，峰位分子量為3174ku，分布寬度指數(shù)為1.348；結(jié)合紅外光譜、高效液相色譜及核磁共振分析，確定該多糖由果糖與葡萄糖以7∶1的比例組成，在多糖結(jié)構(gòu)中，果糖殘基以呋喃環(huán)構(gòu)型存在，且以β-2，6、β-1，2鍵連接，因PS04多糖與果聚糖最為接近，可初步判斷該多糖是一種果聚糖。

多粘類芽孢桿菌，胞外多糖，結(jié)構(gòu)鑒定

微生物多糖具有獨(dú)特的理化性質(zhì)及生物活性，因其具有生產(chǎn)過程可控性高、不受天氣季節(jié)影響、生產(chǎn)周期短等優(yōu)勢而被大量生產(chǎn)且廣泛應(yīng)用于各行各業(yè)[1-2]。到目前為止，已大量投產(chǎn)的微生物多糖主要有黃原膠、右旋糖苷、結(jié)冷膠、普魯蘭多糖、小核葡聚糖等。多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)是其生物活性的基礎(chǔ)[3-4]，其結(jié)構(gòu)研究首先要使用多種提取分離、純化鑒定手段獲得均一的多糖組分，然后測定均一性多糖組分的理化性質(zhì)，最后采用化學(xué)分析法、光譜分析法、生化分析方法等手段進(jìn)行結(jié)構(gòu)測定[5-6]。完整的多糖結(jié)構(gòu)測定應(yīng)包括對多糖的一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)的分析，但由于測定多糖高級結(jié)構(gòu)非常困難，目前關(guān)于多糖結(jié)構(gòu)的報(bào)道，大多處于測定一級結(jié)構(gòu)的層次[7-8]。

從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)殺蟲植物園土壤中分離篩選得到一株可以分泌大量粘性多糖的菌株P(guān)S04，經(jīng)鑒定該菌株屬于多粘類芽孢桿菌，通過優(yōu)化其發(fā)酵條件，多糖產(chǎn)量可高達(dá)60.04g/L；對其多糖粘度性質(zhì)進(jìn)行初步研究，發(fā)現(xiàn)其具有假塑性、低濃度下高粘性，同時(shí)對熱及酸堿有較好的穩(wěn)定性[9-10]。本實(shí)驗(yàn)將對該多糖分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，為其應(yīng)用開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株P(guān)S04 從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)殺蟲植物園土壤中分離得到，接種于察氏斜面培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)48h后保存菌種；葡萄糖、果糖、乙腈（色譜純） 美國Fisher公司；溴化鉀（光譜純） 德國Merck公司；其余培養(yǎng)基制備及多糖提取、檢測試劑 均為國產(chǎn)分析純。

AVATAR 360 FT-IR型傅立葉變換紅外光譜儀美國Nicolet公司；DRX-600核磁共振儀 德國-瑞士Bruker公司；H-CLASS高效液相色譜 美國Waters公司；CHRIST ALPHA 1-4/2-4 LSC型凍干機(jī) 德國Marin Christ公司；U-3010紫外可見分光光度計(jì) 日本Hitachi公司。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

蔗糖30g、NaNO33g、KH2PO4·3H2O 1g、KCl 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、蒸餾水1000mL，自然pH；接種量1%（v/v），裝液系數(shù)（裝液體積與容器體積之比）0.4，37℃，150r/min搖床培養(yǎng)48h。

1.3 多糖提取與純化

PS04菌株發(fā)酵液100℃水浴加熱30min，蒸餾水稀釋兩倍，冷卻，8000r/min離心15min，取上清液，以3∶1（v/v）用量加入95%乙醇，沉淀；將沉淀得到的多糖復(fù)溶于蒸餾水中，用Sevage法除蛋白，配制氯仿：正丁醇=5∶1（V∶V）二元體系，按照1∶5（V溶劑∶V發(fā)酵液）的比例加入到PS04多糖提取液中，混合、劇烈振蕩，靜置分層后去除溶劑層和與水層交接處的蛋白質(zhì)，再繼續(xù)加入上述比例的有機(jī)溶劑，直至交界處沒有變性蛋白產(chǎn)生為止。得到的水相溶液經(jīng)24h透析，凍干，得PS04精制多糖樣品。

1.4 多糖結(jié)構(gòu)鑒定

1.4.1 丙烯葡聚糖凝膠S-200 HR過濾層析 稱取10mgPS04精制多糖樣品溶于1mL水中，利用Sephacryl S-200HR層析柱（1.5cm×60cm），蒸餾水洗脫，洗脫流速1mL/min，分部收集，苯酚-硫酸法檢測糖分布[11]。

1.4.2 多糖分子量測定 采用凝膠滲透色譜法（GPC）測定[11]。柱子：TSK-GEL保護(hù)柱PWXL 6.0×40（mm）、TSK-GEL4000KpwxL 7.8×300（mm）和TSKGEL2500K pwxL 7.8×300（mm）；檢測器：waters2414示差折光檢測器；洗脫劑：0.2mol/L KH2PO4；流速：0.6mL/min；柱溫：35℃。以一系列分子量的葡聚糖為標(biāo)準(zhǔn)品，加洗脫劑配制成2mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后配制2mg/L PS04精制多糖溶液，測定后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品分子量。

1.4.3 單糖組分分析 稱取5mg PS04精制多糖樣品，加入2mL 2mol/L三氟乙酸，安培封管100℃水解6h，冷卻、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入2mL超純水溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，重復(fù)2次。加入2mL超純水溶解，用0.22μm膜過濾，得澄清濃縮液，置冰箱冷藏備用[12]。高效液相色譜（HPLC）分析條件：Asahipak NH2P-50G 4A色譜柱，Alltech蒸發(fā)光檢測器，進(jìn)樣量10μL，流動(dòng)相為乙腈∶水=85∶15（V/V），流速1mL/min[13]。

1.4.4 紅外光譜分析 取干燥PS04精制多糖樣品2mg，壓片，用傅立葉變換紅外光譜儀在4000～400cm-1范圍內(nèi)作全波長掃描[14]。

1.4.5 核磁共振分析 取干燥的PS04精制多糖10mg，溶解于0.5mL D2O中。用600M核磁共振儀進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙烯葡聚糖凝膠S-200 HR過濾層析

將PS04精制多糖樣品采用Sephacryl S-200HR層析柱分離，分部收集液用苯酚-硫酸法檢測糖分布，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，洗脫峰為單一對稱的狹窄峰，表明PS04多糖樣品為分子量均一的多糖。

圖1 PS04多糖Sephacryl S-200HR柱層析洗脫曲線Fig.1 Elution profile of PS04 polysaccharide on Sephacryl S-200HR column

2.2 PS04多糖分子量測定

多糖分子大小分布呈分散性，其分子量大小表現(xiàn)為連續(xù)的變化，所以多糖的分子量大小一般是指它在一定范圍的平均值。通過凝膠滲透色譜法（GPC）測定PS04多糖分子量，可知其重均分子量為4009ku，峰位分子量為3174ku，分布寬度指數(shù)1.348。結(jié)果表明PS04多糖分子量分布較為集中，可認(rèn)為該多糖為均一的多糖。分子量不僅影響多糖溶液流變性質(zhì)，也影響一些活性多糖的生理活性。Calazans等[3]在研究運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌果聚糖的分子量與抗腫瘤活性關(guān)系實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)重均分子量為456.9ku的果聚糖活性最好，720.2、1073.5ku的次之，353.5ku的果聚糖活性最差。PS04多糖的分子量較大，其生理活性還有待于進(jìn)一步研究。

圖2 PS04多糖的重均分子量圖譜Fig.2 The weight mean molecular weight of the PS04 polysaccharide

2.3 PS04多糖的單糖組分分析

如圖3和圖4所示，PS04多糖完全水解后經(jīng)HPLC檢測發(fā)現(xiàn)有兩種單糖存在，與標(biāo)準(zhǔn)單糖的HPLC圖譜比較，確定為果糖和葡萄糖。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算兩種單糖含量可知果糖∶葡萄糖=7∶1。

2.4 PS04多糖紅外光譜分析

PS04多糖紅外光譜分析結(jié)果（圖5）表明其具有典型多糖的吸收峰。3392.01cm-1為O-H的伸縮振動(dòng)（其低于3400cm-1表明存在分子內(nèi)氫鍵）。2937.23cm-1與2886.82cm-1為C-H不對稱伸縮振動(dòng)，而1454.62cm-1與1420.10cm-1形成的雙峰為C-H的變角振動(dòng)[14]。1775～ 1727cm-1不存在紅外吸收峰，則表明不存在乙?；c酯基。1637.39cm-1處吸收峰表明有結(jié)合水存在。1159.68cm-1和1227.63cm-1為C-O（C-O-C和C-O-H）的伸縮振動(dòng)。1063.20cm-1和1016.46cm-1形成的雙峰為O-H變角振動(dòng)。927.55cm-1是呋喃環(huán)伸縮振動(dòng)造成的，而812.85cm-1是呋喃環(huán)的C-H變角振動(dòng)，說明該多糖結(jié)構(gòu)中存在呋喃糖環(huán)。由此可見，PS04多糖不含有乙?；c酯基，其中糖殘基以呋喃型五元環(huán)存在。

圖3 PS04多糖水解樣品與葡萄糖HPLC的圖譜Fig.3 The HPLC chromatograms of glucose and hydrolysates of PS04 polysaccharide

圖4 PS04多糖水解樣品與果糖HPLC的圖譜Fig.4 The HPLC chromatograms of fructose and hydrolysates of PS04 polysaccharide

圖5 PS04多糖的紅外光譜Fig.5 The infrared spectra of PS04 polysaccharide

2.5 PS04多糖的核磁共振特征分析

2.5.1 PS04多糖的1H-NMR的圖譜解析1H-NMR主要用于分析多糖中糖苷鍵的構(gòu)型[15]。通常α型糖苷的異頭質(zhì)子超過δ5.0，β型一般小于δ5.0。PS04多糖溶于D2O中，測定其1H-NMR譜（圖6）。譜圖中沒有化學(xué)位移超過δ5.0，故確定PS04多糖是β型糖苷鍵構(gòu)型。多糖的主鏈糖苷鍵構(gòu)型在多糖活性中起一定作用，香菇多糖（β構(gòu)型）與淀粉（α構(gòu)型）的主鏈構(gòu)型不同，這可能是導(dǎo)致兩者活性上存在差異的重要原因。對于其他類型的多糖，具有生物活性者也多是β構(gòu)型，因此PS04多糖鏈的β糖苷鍵構(gòu)型是其可能具有生物活性的基礎(chǔ)。

圖6 PS04多糖1H-NMR圖譜Fig.6 1H-NMR spectrum of PS04 polysaccharide

圖7 PS04多糖13C-NMR圖譜Fig.7 13C-NMR spectrum of PS04 polysaccharide

2.5.2 PS04多糖的13C-NMR的圖譜解析 13C-NMR在多糖結(jié)構(gòu)分析上具有很重要的地位，通過這種方法不但能夠確定各種碳的位置，還能區(qū)別分子的構(gòu)型和構(gòu)象，它主要用于分析多糖結(jié)構(gòu)中的異頭碳構(gòu)型以及多糖中殘基的取代位置等。PS04多糖的13CNMR譜如圖7所示，在90～110ppm異頭碳出現(xiàn)的區(qū)域在104.22ppm處有明顯信號，表示只有或至少有一種糖殘基。結(jié)合Han及Liu等[16-17]對果聚糖的研究，對PS04多糖殘基中碳原子化學(xué)位移進(jìn)行初步歸屬，結(jié)果如表1所示。對比PS04多糖與各種果糖在C-5、C-2、C-6的化學(xué)位移發(fā)現(xiàn)（表1），PS04多糖C-5、C-2化學(xué)位移與呋喃糖接近，C-6處化學(xué)位移此三者（PS04多糖、呋喃糖、吡喃糖）相差不大，由此可以推測PS04多糖中糖單元為呋喃五元環(huán)結(jié)構(gòu)。當(dāng)多糖殘基中-OH發(fā)生取代，相應(yīng)碳原子化學(xué)位移會(huì)向低場區(qū)移動(dòng)[18]。將PS04多糖糖殘基中碳原子化學(xué)位移與β-D-呋喃果糖相比，發(fā)現(xiàn)只有C-2和C-6向低場區(qū)移動(dòng)，因此可以確定C-2、C-6發(fā)生取代。另外，PS04多糖糖殘基中碳原子化學(xué)位移與文獻(xiàn)報(bào)道的細(xì)菌果聚糖碳原子化學(xué)位移極為相近，故推測PS04多糖主要是由β-1，2鍵連接D-呋喃果糖殘基為主鏈，以少量β-2，1鍵形成分支點(diǎn)。分支度（DB）對多糖的活性有一定影響，具有生物活性的β-1，3-D-葡聚糖的DB范圍很廣，在0.015～0.750之間都有分布，但主要分布在0.20～0.33之間，處于該范圍的多糖活性也相對更強(qiáng)，因此，關(guān)于PS04多糖的分支度還需進(jìn)一步具體確認(rèn)。在圖譜中未發(fā)現(xiàn)葡萄糖殘基的信號，可能是由于葡萄糖殘基含量少而導(dǎo)致信號積累太少的緣故。

2.5.3 PS04多糖的HSQC圖譜解析 HSQC為異核單量子相干，其反映的是直接相連的1H、13C核之間的耦合關(guān)系（1JCH）[19]。通過HSQC就可以將糖單元中氫核進(jìn)行化學(xué)歸屬。如圖8所示，A與B是由C-1上直接相連的氫原子耦合產(chǎn)生，故C-1上連接2個(gè)氫原子；同理C與D由C-6與其直接相連氫原子之間的耦合作用產(chǎn)生，表明與C-6上相連的有2個(gè)氫原子；E、F、G分別由C-4、C-3、C-5與其上連接的氫原子發(fā)生耦合作用產(chǎn)生，說明C-4、C-3、C-5上只連接1個(gè)氫原子；而C-2上不存在氫原子，故沒有產(chǎn)生信號。

表1 幾種糖的13C-NMR化學(xué)位移（ppm）[16-17]Table 1 Chemical shift assignments for the13C-NMR spectrum of some kinds of suger（ppm）[16-17]

圖8 PS04多糖HSQC圖譜Fig.8 HSQC spectrum of PS04 polysaccharide

2.5.4 PS04多糖的HMBC圖譜解析 HMBC是異核多鍵相關(guān)，其將1H核與長程耦合的13C核關(guān)聯(lián)起來，從而給出分子連接骨架的結(jié)構(gòu)信息。對于多糖，它可以作為序列分析的工具對糖單元之間連接次序進(jìn)行分析。從圖9中可以看出，所有耦合都是由β-D-呋喃果糖殘基上的碳原子與氫原子之間作用產(chǎn)生，其中A、B是C-2與C-1上H之間的耦合產(chǎn)生，C是C-2與C-6上氫原子之間耦合產(chǎn)生。HMBC結(jié)果進(jìn)一步說明PS04多糖是由β-2，6鍵與β-2.1鍵連接而成。

3 結(jié)論

圖9 PS04多糖HMBC圖譜Fig.9 HMBC spectrum of PS04 polysaccharide

3.1 采用丙烯葡聚糖凝膠S-200 HR對PS04精制多糖進(jìn)行純化，且通過凝膠滲透色譜法分析測得該多糖重均分子量為4009ku，峰位分子量為3174ku，分布寬度指數(shù)為1.348，分子量分布較為集中，可認(rèn)為該多糖為均一的多糖；經(jīng)水解后進(jìn)行HPLC分析單糖組成，發(fā)現(xiàn)該多糖由果糖和葡萄糖構(gòu)成，其摩爾比例為7∶1；結(jié)合紅外光譜及核磁共振分析，確定在PS04多糖結(jié)構(gòu)中，果糖殘基以呋喃環(huán)構(gòu)型存在，且以β-2，6、β-1，2鍵連接，與相關(guān)文獻(xiàn)中提到的各種多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對，PS04多糖與果聚糖最為接近，因此可初步判斷該多糖是一種果聚糖。關(guān)于葡萄糖與果糖的連接方式，以及糖鏈分支所占比例，還需進(jìn)一步開展實(shí)驗(yàn)。

3.2 與蛋白質(zhì)、核酸相比，多糖的結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜，需要結(jié)合多種大型精密儀器，測定和分析工作量大，成本高。因?qū)嶒?yàn)條件所限，本研究僅對PS04多糖的一級結(jié)構(gòu)作了初步分析，今后還需進(jìn)行大量工作，精確測定其二級、三級甚至四級結(jié)構(gòu)，進(jìn)行更系統(tǒng)的研究，從而為深入探討該多糖結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)。

[1]李龍偉，閆鎖．黃原膠與卡拉膠復(fù)配在果凍中的應(yīng)用研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009（17）：342-343.

[2]Slaveykova V I，Parthasarathy N，Dedieu K，et al.Role of extracellular compounds in Cd-sequestration relative to Cd uptake by bacterium Sinorhizobium meliloti[J].Environmental Pullution，2010，158（8）：2561-2565.

[3]Calazans G M T，Lima R C，de Franca F P，et al．Molecular weight and antitumour activity of Zymomonas mobilis levans[J]．International Journal of Biological Macromolecules，2000，27：245-247.

[4]Vuong C，Kocianova S，Voyic6 J M，et al．A crucial mle for exopolysaccharide modification in bacterial biofilm formation，immune evasion，and virulence[J]．Journal of Biological Chemistry，2004，279：54881-54886.

[5]Rau U，Kuenz A，Wray V，et al．Production and structural analysis of the polysaccharide secreted by Trametes（Coriolus）versicolor ATCC 200801[J]．Applied Microbiology and Biotechnology，2009，81（5）：827-837.

[6]Zhao L Q，Chen Y L，Ren S，et al．Studies on the chemical structure and antitumor activity of an exopolysaccharide from Rhizobium sp．N613[J]．Carbohydrate Research，2010，345（5）：637-643.

[7]Asker M M S，Ahmed Y M，Ramadan M F．Chemical characteristics and antioxidant activity of exopolysaccharide fractions from Microbacterium terregens[J]．Carbohydrate Polymers，2009，77（3）：563-567.

[8]Gorska S，Jachyrnek W，Rybka J，et al．Structural and immunochemical studies of neutral exopolysaccharide produced by Lactobacillus johnsonii 142[J]．Carbohydrate Research，2010，345（1）：108-114.

[9]田文祥，蹇華麗，楊幼慧，等.產(chǎn)胞外多糖菌的鑒定及多糖性質(zhì)研究[J].食品與機(jī)械，2012，28（1）：162-165.

[10]蹇華麗，田文祥，楊幼慧，等.多黏類芽孢桿菌PS04產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食品科技，2013（1）：26-30.

[11]陳春英，丁玉強(qiáng)，Elmahadi E A，等.薯葉多糖的分離純化及其理化性質(zhì)的研究[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，1998，14（4）：422-431.

[12]王薇，黃海東，張禹，等．一種新型生物聚合物Ss的流變學(xué)性質(zhì)及成膠特性[J]．微生物學(xué)通報(bào)，2008，35（6）：866-871.

[13]陳倩，李偉欣，程靜，等．雙歧桿菌22-5胞外多糖理化特性研究[J]．食品科學(xué)，2008，29（3）：364-368.

[14]陳雪峰，賈士儒，王岳，等．發(fā)菜多糖的紅外光譜分析與抗氧化活性的研究[J]．分析與檢測，2009，35（7）：133-137.

[15]張惟杰．糖復(fù)合物生化研究技術(shù)[M].杭州：浙江大學(xué)出版社，1999：242-243.

[16]Han Y W，Margaret A C.Production and characterization of microbial levan[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1990，38（2）：393-396.

[17]Liu J，Luo J G，Ye H，et al．Medium optimization and structural characterization of exopolysaccharides from endophytic bacterium Paenibacillus polymyxa EJS-3[J]．Carbohydrate Polymers，2010，79（1）：206-213.

[18]方積年．C-13NMR在多糖機(jī)構(gòu)分析上的應(yīng)用[J]．國外醫(yī)藥（抗生素分冊），1982（2）：107-112，125.

[19]李波，陳海華，許時(shí)嬰．二維核磁共振譜在多糖結(jié)構(gòu)研究中的應(yīng)用[J]．天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17（4）：523-526.

Study on the molecular structure of polysaccharide produced by PS04 strain

JIAN Hua-li1，TIAN Wen-xiang2，YANG You-hui1，LIAO Mei-de3，*
（1.College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2.Guangdong Yifang Pharmaceutical Co.，Ltd.，F(xiàn)oshan 528244，China；3.College of Natural Resources and Environment，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

A single component peak was found in PS04 polysaccharide purity analysis using S-200 HR filtration of chromatography.The weight mean molecular weight of the PS04 polysaccharides examined by GPC was 4009ku，the peak positions molecular weight was 3174ku，and distribution width index was 1.348.The structure of PS04 polysaccharide was identified by infrared spectral，HPLC，and NMR.The results showed that PS04 polysaccharide was a typical polysaccharide compounds and the main composition was fructose and glucose （proportion 7∶1）.NMR analysis demonstrated that there were furan nucleus and the chain was linked by β-2，6 and β-1，2 linkage，so PS04 polysaccharide was similar to levan.

Paenibacillus polymyxa；exopolysaccharide；structural Identification

TS202.3

A

1002-0306（2014）08-0114-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.08.016

2013－08－16 *通訊聯(lián)系人

蹇華麗（1977-），女，博士，副教授，研究方向：發(fā)酵工程。

廣東省教育廳青年創(chuàng)新基金（2012LYM_0029）；華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校長基金（5100-K09151）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2008JI-c221）。