基因修飾小鼠的骨性關(guān)節(jié)炎模型研究進(jìn)展

蔡大衛(wèi) 蔣青

骨性關(guān)節(jié)炎（OA）的模型動(dòng)物有很多，但長(zhǎng)期以來可做基因修飾（基因敲除、基因表達(dá)及基因轉(zhuǎn)染）的動(dòng)物只有小鼠，雖然已有大鼠敲除的相關(guān)報(bào)道，但尚不成熟。

基因修飾（GM）小鼠，以敲出小鼠為例，越來越多應(yīng)用于骨性關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制研究和治療靶點(diǎn)尋找上，相關(guān)文獻(xiàn)呈逐年增加的趨勢(shì)。在PUBMED對(duì)2013年文獻(xiàn)（至11月）以關(guān)鍵詞mouse/mice和osteoarthritis/OA檢索，有41篇用到敲除小鼠，其中 10 篇[相關(guān)分子：AnxA6，MIP-1 γ，ADAMTS-7，fat-1，Lrp6，RAGE，sirt1，adamts5，mmp13，CB1（2）]對(duì)小鼠進(jìn)行了OA造模。因此，小鼠OA模型因其特殊的價(jià)值有整理歸納的必要。

1 模型分類及相關(guān)介紹

單獨(dú)對(duì)小鼠OA模型的分類尚缺，本文在造模的操作水平上將已有的小鼠模型（非自發(fā)）分為關(guān)節(jié)腔注射類和手術(shù)切斷（除）類兩種。

1.1 關(guān)節(jié)腔注射類

1.1.1 注射碘醋酸鹽（MIA）誘發(fā)OA 將小鼠膝關(guān)節(jié)彎曲90°以露出關(guān)節(jié)間隙，用30G針頭穿過髕下韌帶后注射5～10μl濃度為5mg/ml的MIA溶液進(jìn)入小鼠膝關(guān)節(jié)。作用20～30d后可有明顯病理和組織化學(xué)差異[1]。造模機(jī)理是它可以通過抑制軟骨細(xì)胞中甘油醛-3-磷酸脫氫酶阻斷糖酵解過程，繼而軟骨結(jié)構(gòu)的完整性可因軟骨細(xì)胞功能不全受損，軟骨下骨裸露后可有疼痛和機(jī)械高敏性出現(xiàn)。模型可模擬OA發(fā)病過程中基質(zhì)降解現(xiàn)象，有顯著關(guān)節(jié)疼痛出現(xiàn)。其基質(zhì)降解多累及髕骨中部和內(nèi)外側(cè)脛骨平臺(tái)的中部。除了2007年Boileau利用此模型敲除鼠研究galectin-3對(duì)OA的作用外，近年來的研究多和OA疼痛（pain）相關(guān)，如2013年Carmen使用的CB1、CB2敲除小鼠。

1.1.2 TTR模型 即TGFbeta1注射以及跑步機(jī)模型。給小鼠單側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射TGFb1（200ng），48h后再注射1次。之后每天以32cm/min的速度進(jìn)行20min的17°上斜坡強(qiáng)制跑步（跑步機(jī)），持續(xù)2周。本模型可以通過改變小鼠最終處死的時(shí)間獲得急慢性不同時(shí)相的模型數(shù)據(jù)[2]。同時(shí)，此模型在ADAMTS5、CD44等敲除小鼠上都可比較軟骨侵蝕，關(guān)節(jié)周圍纖維化，和滑膜以及半月板的變化。此外，Anna配合此模型進(jìn)行錄像步態(tài)分析以比較OA嚴(yán)重程度。

1.1.3 膠原酶（Collagenase）注射 注射細(xì)菌膠原酶進(jìn)入小鼠膝關(guān)節(jié)腔中，注射量6μl，濃度可為1.0%(w/v)，造模時(shí)間7～42天，該模型可于不同時(shí)間處死小鼠以觀察不同時(shí)相OA樣改變。模型早期有軟骨纖維化和基質(zhì)降解，后期發(fā)展為軟骨下骨磨損以及骨贅形成[3]。造模機(jī)理：膠原酶可以破壞主要的關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)如肌腱、韌帶、半月板，引起關(guān)節(jié)不穩(wěn)定性增加。膠原酶注射模型的骨性關(guān)節(jié)炎樣損害主要表現(xiàn)在關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)，但對(duì)于大齡小鼠外側(cè)也會(huì)累及（也有報(bào)道說最受累區(qū)域是和注射的位置有關(guān)）。此模型的OA樣表現(xiàn)不僅限于關(guān)節(jié)軟骨，滑膜和韌帶都會(huì)累及。

1.1.4 抗原誘導(dǎo)的OA模型（AIA） 在小鼠尾巴基部注射100μg溶于乳化劑中的mBSA，以及100μl Freund佐劑。這樣免疫以后的第10天，可在小鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射入10μl含100μg mBSA的溶液。模型在免疫后第17天完成[4]。

1.1.5 木瓜蛋白酶 往小鼠膝關(guān)節(jié)腔中注入已被L-半胱氨酸激活后的濃度1% (w/v)的木瓜蛋白酶溶液6μL，3周后有顯著OA樣改變，可累及軟骨面、韌帶、滑膜，而遠(yuǎn)期（9周）軟骨下骨的硬化改變不是很顯著[5]。

1.2 手術(shù)切斷（除）類主要包括 （1）DMM：切斷連接內(nèi)側(cè)半月板（MM）和脛骨平臺(tái)的半月板脛骨韌帶（MMTL）[6]；（2）ACLT：前交叉韌帶（ACT）可以限制脛骨前移動(dòng)起到穩(wěn)定關(guān)節(jié)的作用，本模型就是切斷前交叉韌帶[7]；（3）內(nèi)側(cè)副韌帶（MCL）切斷聯(lián)合內(nèi)側(cè)半月板切除[8]；（4）完全或者部分的半月板切除術(shù)[9]。

Kamekura[10]通過不同韌帶和（或）半月板切斷（除）的組合模擬了4種不同嚴(yán)重程度的OA手術(shù)模型，分別為：（1）輕微：前交叉韌帶切斷（ACL）；（2）適度：前交叉韌帶聯(lián)合內(nèi)側(cè)半月板切除(ACL+MM)；（3）中度：內(nèi)側(cè)副韌帶聯(lián)合內(nèi)側(cè)半月板切除(MCL+MM)；（4）嚴(yán)重：髕韌帶合內(nèi)外側(cè)副韌帶，內(nèi)外側(cè)半月板，前后交叉韌帶全切除(PL+MCL+MM+ACL+PCL+LM+LCL)。

小鼠的手術(shù)造模的原理都是利用關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)上的不完整增加關(guān)節(jié)不穩(wěn)定性，這樣長(zhǎng)遠(yuǎn)可以加速關(guān)節(jié)軟骨的磨損。造模完成一般需要4～8周，不同的模型的操作復(fù)雜性和病程發(fā)展的觀察可控性都有差別。在2013年已發(fā)表的有關(guān)GM小鼠OA造模文章中都有使用到手術(shù)法。

2 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷倪x擇

OA病癥紛繁復(fù)雜，可歸納出疼痛、功能障礙，病理生化改變3個(gè)主要方面。目前模型小鼠多用于模擬病理生化改變。

可根據(jù)模型特色選擇合適造模法，如近來MIA注射模型的OA研究多集中于疼痛學(xué)方面；手術(shù)造模的軟骨基質(zhì)降解和破壞非常顯著；而TTR跑步機(jī)模型則可獲得不同嚴(yán)重程度和急慢時(shí)相的OA模型，同時(shí)可行步態(tài)分析評(píng)估功能改變。

其次，需要考慮到實(shí)驗(yàn)外部條件限制，比如時(shí)間成本。注射藥物造模時(shí)間一般小于1個(gè)月，而手術(shù)造模則需要1～3個(gè)月。另外，像MIA、木瓜蛋白酶、膠原酶、抗原免疫及跑步機(jī)模型都需要有小鼠關(guān)節(jié)腔注射工具。在手術(shù)造模中，不同的術(shù)法難度也不一樣，如因?yàn)橛泻笫猪g帶(PCL)干擾，前交叉韌帶（ACLT）切斷術(shù)相對(duì)DMM較為復(fù)雜，要求實(shí)驗(yàn)者有較為熟練的操作技巧。

同時(shí)，可以在實(shí)驗(yàn)中使用多模型同時(shí)驗(yàn)證以增加可靠性和說服力，不同模型的組合尚沒有明確說法。最后，從動(dòng)物保護(hù)角度出發(fā)，應(yīng)盡量遵從3R原則。

3 小鼠模型的不足和展望

OA是個(gè)年齡相關(guān)性疾病，可是目前模型使用的實(shí)驗(yàn)鼠多是年輕鼠（10周內(nèi)），無論是關(guān)節(jié)的疼痛，功能障礙還是組織化學(xué)的改變都沒有把年齡相關(guān)因素考慮在內(nèi)。此外，小鼠的骨骼成熟后剩余壽命比例相對(duì)于大動(dòng)物（豬、狗）較小，這部分時(shí)間對(duì)于OA進(jìn)展至關(guān)重要，所以也就可能相對(duì)限制了實(shí)驗(yàn)中模型小鼠OA樣改變的進(jìn)展。

OA是全身性疾病，而小鼠模型大多集中研究膝關(guān)節(jié)。研究主要關(guān)注模型小鼠軟骨破壞，對(duì)其他組織如韌帶、關(guān)節(jié)囊、肌肉等鮮有涉及。同時(shí)，個(gè)別造模效果需要重新驗(yàn)證，如小鼠手術(shù)模型模擬創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎方法尤多，但是文獻(xiàn)中給的相關(guān)的疼痛，運(yùn)動(dòng)障礙，生化改變的數(shù)據(jù)甚少以至于無法全面判斷模型效果。

模型構(gòu)建過程，GM小鼠（特別是全身某基因敲出）可能會(huì)在行為上和同遺傳背景的普通鼠有區(qū)別（如生病、活動(dòng)量、進(jìn)食量），目前尚沒有相關(guān)報(bào)道討論這是否會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)最后基因修飾因素產(chǎn)生的差異性結(jié)果造成影響。

綜上所述，雖然存在不足，但總的來說，對(duì)于骨性關(guān)節(jié)炎研究除了小鼠在基因修飾方面的無可比擬的優(yōu)勢(shì)以外，小鼠購買和飼養(yǎng)成本低和操作相對(duì)簡(jiǎn)單的好處都是顯而易見。因此，隨著OA研究的進(jìn)一步深入及GM小鼠的逐漸普及，小鼠骨性關(guān)節(jié)炎模型有必要進(jìn)行廣泛而細(xì)致的研究、探討和系統(tǒng)歸類。

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