牛呼吸道合胞體病毒檢測方法研究進(jìn)展

楊洺揚(yáng)，王 煒，李真光，董 鵬，胡桂學(xué)，武 華，陳立志，程世鵬，冷 雪＊

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物分子生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林吉林130122；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林長春130118；3.華威特（北京）生物科技有限公司，北京100085）

牛呼吸道合胞體病毒（Bovine respiratory syncytial virus，BRSV）屬于副黏病毒科肺病毒亞科肺病毒屬，為單股負(fù)鏈RNA病毒［1］。病毒基因組從3′端到5′端轉(zhuǎn)錄，得到10個(gè)mRNA，這10個(gè)mRNA翻譯11個(gè)蛋白，分別為 NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2－1、M2－2和 L［2－3］。20世紀(jì)70年代初牛呼吸道合胞體病被公認(rèn)為犢牛呼吸道系統(tǒng)主要疾病，BRSV呈世界性分布，廣泛分布于美國、加拿大、瑞士、比利時(shí)、澳大利亞、日本等國家。犢牛較為易感，潛伏期可長達(dá)幾個(gè)月，因此牛群間的潛伏期感染很難得到控制。其高發(fā)病率、高病死率對(duì)養(yǎng)牛業(yè)及奶制品市場造成了嚴(yán)重影響［4］。目前，我國市場上尚無用于該病防控的疫苗應(yīng)用，因此，建立快速的檢測方法，淘汰陽性牛，對(duì)于降低該病造成的損失就顯得尤為重要。國內(nèi)外對(duì)BRSV的檢測均進(jìn)行了大量研究，首先結(jié)合流行病學(xué)和臨床檢查做出初步診斷，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行確診，實(shí)驗(yàn)室方法主要包括病原學(xué)和血清學(xué)方法，現(xiàn)對(duì)其進(jìn)行綜述如下。

1 流行病學(xué)

1970年首次從患病牛體內(nèi)分離到BRSV，隨后在歐洲和北美等國家相繼報(bào)道出現(xiàn)BRSV。牛呼吸道合胞體病廣泛分布于世界各國，是具有很強(qiáng)傳染性的急性、熱性牛呼吸道疾病，山羊、豬和馬也可能感染［5］。牛呼吸道合胞體病常發(fā)生于秋冬季溫帶地區(qū)，往往由動(dòng)物轉(zhuǎn)群引起，既能夠通過動(dòng)物之間直接接觸傳播，也可以通過帶毒動(dòng)物呼吸道分泌物或氣霧傳播，其發(fā)病率很高占乳牛呼吸道疾病的60%。一般來說其發(fā)病情況與種群密度、年齡結(jié)構(gòu)密切相關(guān)［6－7］。目前有研究認(rèn)為，其最具威脅的傳染源來自亞臨床感染動(dòng)物本身［8］，它們攜帶的病毒可能引起疫情在牛群中暴發(fā)，但仍需進(jìn)一步證明。

2 臨床癥狀

病牛表現(xiàn)為精神沉郁、體溫升高、干咳、呼吸道有漿液性鼻液或伴有濕性咳嗽［9］。潛伏期大約3d～5d，急性型突然發(fā)熱、呼吸困難、呼吸頻率加快、張口呼吸［10］。肺部聽診支氣管音增強(qiáng)有濕啰音、捻發(fā)音。肺泡呈間質(zhì)性肺炎變化，可能伴有肺水腫和肺氣腫，背部區(qū)肺泡壁破裂。少數(shù)患病牛有皮下肺氣腫，肺腹側(cè)粘連，背側(cè)部腫脹。胸膜、肺小葉有氣腫性損傷。剖檢可見肺臟堅(jiān)實(shí)，肺泡膈葉腫大，有纖維蛋白滲出。乳牛在感染BRSV后表現(xiàn)為泌乳量減少或停乳，妊娠母牛感染BRSV后會(huì)引起流產(chǎn)。

3 病原學(xué)檢測

3.1 細(xì)胞分離培養(yǎng)

細(xì)胞分離培養(yǎng)鑒定是最直觀的病毒鑒定方法。培養(yǎng)BRSV可以用Vero細(xì)胞、MDBK細(xì)胞或牛鼻甲骨細(xì)胞［11］。將待檢病料接種細(xì)胞后傳代培養(yǎng)，第一代一般不出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE），隨著傳代次數(shù)增加，出現(xiàn)CPE時(shí)間縮短，病變初期出現(xiàn)細(xì)胞融合，晚期聚集、圓縮，形成合胞體［12］，細(xì)胞液可見輪廓明顯嗜酸性包涵體［13］。

3.2 聚合酶鏈反應(yīng)

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）通過擴(kuò)增病毒基因片段來檢測病毒，是近年來快速發(fā)展和應(yīng)用的病原學(xué)檢測方法，PCR以它特異性強(qiáng)、敏感性高、高效快速的特點(diǎn)已經(jīng)成為實(shí)驗(yàn)室診斷最常用的方法。Vilcek M等［14］建立了BRSV套式PCR檢測方法，這種方法大大提高了檢測的敏感性，在對(duì)35個(gè)臨床樣品的檢測中陽性檢出率達(dá)到89%，遠(yuǎn)高于采用傳統(tǒng)免疫熒光方法檢測的66%。Boxus M 等［15］建立了RT－PCR方法檢測BRSV，引物及探針設(shè)計(jì)來自于BRSV核蛋白保守區(qū)序列，具有很好的重復(fù)性和特異性，敏感性能夠達(dá)到傳統(tǒng)PCR方法的100倍。在國內(nèi)，王紅等［16］在2008年也建立了BRSV的RT－PCR檢測方法。Thonur L等［17］開發(fā)了一步多重實(shí)時(shí)定量RT－PCR檢測方法，該方法可以快速的同時(shí)檢測牛呼吸道合胞體病毒、牛皰疹病毒1型和牛副流感病毒3型3種主要牛呼吸道病毒。陽性檢出率高達(dá)97%，敏感性與單一PCR基本一致。我國科研工作者也于2013年建立了牛病毒性腹瀉病毒、牛呼吸道合胞體病毒、牛副流感病毒3型的多重PCR檢測方法［18］。這種方法憑借它快速、高特異性、敏感性以及節(jié)約成本等特點(diǎn)，將在牛呼吸道病毒檢測中得到廣泛應(yīng)用。Masayuki U等［19］在2013年開發(fā)的微滴RT－PCR可在10min內(nèi)完成PCR檢測，大大提高了診斷效率。

4 血清學(xué)診斷

4.1 中和試驗(yàn)

以待檢血清和標(biāo)準(zhǔn)毒進(jìn)行中和試驗(yàn)，將待檢血清用稀釋液進(jìn)行2倍遞增稀釋之后加入等量標(biāo)準(zhǔn)病毒液（200TCID50／0.1mL）充分混合。37℃感作1h后將混合液接種在鋪滿單層Vero細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48h后開始觀察，14d判定最終結(jié)果。中和抗體效價(jià)2倍以上為陽性血清［20］。中和試驗(yàn)是傳統(tǒng)的病毒診斷方法，但診斷時(shí)間較長，對(duì)人工免疫后動(dòng)物無法診斷。

4.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）作為一項(xiàng)血清學(xué)診斷技術(shù)，已在動(dòng)物疫病診斷工作中已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用。由于酶的高效催化作用使其對(duì)抗原抗體結(jié)合識(shí)別起到了放大作用，從而達(dá)到了快速、靈敏、高效的檢測要求，是重要的疫病早期診斷方法。Rhodes M B等［21］開發(fā)了阻斷ELISA檢測BRSV的方法，采用辣根過氧化氫酶標(biāo)記抗體，抗原抗體特異結(jié)合后洗滌，滴加底物溶液，通過測定底物吸光值確定抗原抗體含量。相比于傳統(tǒng)中和滴定試驗(yàn)，這種方法能夠更早期的檢測到血清中的抗體，而且其特異性明顯優(yōu)于其他ELISA方法。在我國，王紅等建立了以BRSV重組N蛋白為包被抗原的的間接ELISA檢測方法，并且進(jìn)一步證明這種方法的符合率、敏感性、特異性分別達(dá)到了87.7%、90.9%和85.0%，為今后開發(fā)ELISA試劑盒提供了有效的技術(shù)手段。近些年，國內(nèi)外還報(bào)道了斑點(diǎn)ELISA［22］、夾心ELISA［23］、多重 ELISA［24］及 Luminex多元血清檢測［25］等方法，都顯示出相比于傳統(tǒng)檢測方法更高的敏感性和更快的速度。

4.3 直接免疫熒光抗體試驗(yàn)

將待檢牛鼻拭子處理后固定在載玻片上，用可以與BRSV F蛋白特異結(jié)合的熒光標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合，培養(yǎng)后洗去未結(jié)合的熒光物質(zhì)，在熒光顯微鏡下觀察是否有熒光物質(zhì)［26］。這種方法敏感性高，速度快，但非特異性染色仍有待解決，結(jié)果判定客觀性不足，試驗(yàn)操作比較復(fù)雜。

隨著國內(nèi)外科研工作者對(duì)牛合胞體病毒的潛心研究，特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡便快捷的檢測方法將逐漸取代傳統(tǒng)的檢測手段，不斷優(yōu)化的商品化BRSV檢測試劑盒的問世也將為牛呼吸道合胞體病的診斷和預(yù)防提供有力的保障。

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