松弛素對TGF-β誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化的抑制作用

陳瀟，周浩，周希，蔡潔潔，陳靈芝，鄭高暑，黃偉劍，張懷勤

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江 溫州 325015；2.溫州市中心醫(yī)院 檢驗科，浙江溫州 325000）

松弛素對TGF-β誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化的抑制作用

陳瀟1，周浩1，周希1，蔡潔潔1，陳靈芝2，鄭高暑1，黃偉劍1，張懷勤1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，浙江 溫州 325015；2.溫州市中心醫(yī)院 檢驗科，浙江溫州 325000）

目的：探討松弛素（RLX）對TGF-β誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化現(xiàn)象的影響。方法：采用體外分離的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）作為體外細(xì)胞模型，通過TGF-β10 ng/mL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化，100 ng/mL和200 ng/mL RLX分別預(yù)處理，再與TGF-β聯(lián)合培養(yǎng)48 h。光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，CCK-8實驗和transwell實驗檢測細(xì)胞增殖和遷移能力，免疫熒光單雙染技術(shù)觀察vimentin和CD31的表達(dá)變化，蛋白免疫印跡技術(shù)觀察各實驗組vimentin、CD31、ve-cadherin和α-SMA的蛋白表達(dá)。結(jié)果：陰性對照組內(nèi)皮細(xì)胞呈鋪路石樣生長，TGF-β誘導(dǎo)組細(xì)胞形態(tài)向梭形轉(zhuǎn)化，呈擴散遷移趨勢。與陰性對照組相比，TGF-β誘導(dǎo)組細(xì)胞增殖、遷移能力明顯增強；而RLX可抑制TGF-β誘導(dǎo)的增殖和遷移。免疫熒光單染結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，TGF-β誘導(dǎo)組內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白CD31表達(dá)下調(diào)而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白vimentin明顯上升；與TGF-β組相比，RLX聯(lián)合TGF-β處理組CD31表達(dá)上調(diào)而vimentin表達(dá)下調(diào)。免疫熒光雙染結(jié)果顯示，陰性對照組以內(nèi)皮性質(zhì)的細(xì)胞為主，僅存在少量的CD31和vimentin雙陽性細(xì)胞；TGF-β誘導(dǎo)組雙陽性細(xì)胞明顯增多；與TGF-β組相比，RLX聯(lián)合TGF-β處理組間質(zhì)效應(yīng)的雙陽性細(xì)胞下調(diào)，而內(nèi)皮效應(yīng)的雙陽性細(xì)胞增多。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，TGF-β誘導(dǎo)組內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白CD31（0.36± 0.076 vs 0.88±0.086）和ve-cadherin（0.54±0.046 vs 1.09±0.13）表達(dá)下調(diào)而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白vimentin（0.72±0.102 vs 0.21±0.081）和α-SMA（0.88±0.084 vs 0.24±0.046）明顯上升（P＜0.05）；與TGF-β組相比，RLX聯(lián)合TGF-β處理組CD31（0.67±0.09、0.59±0.12 vs 0.36±0.076）和ve-cadherin（0.85±0.09、0.72±0.064 vs 0.54±0.046）表達(dá)上調(diào)，而vimentin（0.56±0.011、0.48±0.06 vs 0.72±0.102）和α-SMA（0.65±0.081、0.54±0.032 vs 0.88±0.084）表達(dá)下降（P＜0.05），且呈劑量依賴性。結(jié)論：RLX可抑制TGF-β誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)化細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

松弛素；內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化；TGF-β；心肌纖維化

心肌和大動脈壁纖維化是許多心臟疾病的基本表現(xiàn)，與疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)?？估w維化已成為治療心腦血管疾病的重要靶點，而內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化是組織器官纖維化中成纖維細(xì)胞的重要來源，闡明并阻斷這一過程對防治纖維化有重要的臨床意義[1]。松弛素（RLX）屬胰島素類肽類激素，在研究妊娠期骨盆變化時被首次發(fā)現(xiàn)[2]，其可通過下調(diào)膠原生成和增加膠原降解發(fā)揮抗纖維化的作用。RLX可由心臟本身產(chǎn)生，主要通過與細(xì)胞表面的特異性受體LGR7或LGR8結(jié)合，介導(dǎo)Smad細(xì)胞間信號，激活特殊的基因，有心臟保護(hù)和細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)作用[3]。本研究通過構(gòu)建由TGF-β誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)化轉(zhuǎn)化的模型，由不同劑量的RLX進(jìn)行預(yù)處理，探討RLX對TGF-β誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化現(xiàn)象的影響，以及對抗纖維化治療的展望。

1 材料和方法

1.1 實驗對象選用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）。

1.2 實驗試劑和藥物Recombinant Human Relaxin-2（130-10）和TGF-β（100-21）購自peprotech公司；兔抗人ve-cadherin（D87F2）、兔抗人vimentin（D21H3）、鼠抗人CD31（89C2）購自Cell Signaling Technology公司；兔抗人Anti-Von Willebrand Factor antibody購自abcam公司；鼠抗人α-SMA購自武漢博士德生物工程有限公司；Alexa Fluor熒光二抗購自earthox公司；Hoechst 33342購自Sigma-Aldrich公司。

1.3 實驗分組實驗共分五組：①陰性對照組；②RLX對照組：RLX 100 ng/mL；③TGF-β誘導(dǎo)組：TGF-β10 ng/mL；④TGF-β+RLX 100 ng/mL處理組：先加入RLX 100 ng/mL培養(yǎng)24 h后加入TGF-β10 ng/ mL；⑤TGF-β+RLX 200 ng/mL處理組：先加入RLX 200 ng/mL 培養(yǎng)24 h后加入TGF-β10 ng/mL。以上每組均在37 ℃，5% CO2恒溫?zé)o菌的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.4 HUVECs原代培養(yǎng)與簽定

1.4.1 HUVECs原代培養(yǎng)和分離：取新生兒臍帶，無夾痕扭曲部分，夾閉兩端后注入胰酶并置于37 ℃水浴箱中7～10 min。取臍帶內(nèi)消化液離心后，取沉淀重懸，移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)。3～4 d長至70%～80%匯合后傳代，取4～6代細(xì)胞實驗。所用標(biāo)本經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意。

1.4.2 HUVECs細(xì)胞鑒定：制細(xì)胞爬片于24孔板上，固定封閉后加入兔抗人VWF相關(guān)抗原（1:160），4 ℃過夜后Hochest33342（1μ g/mL）染核20 min，熒光二抗（DyLight 488）孵育1 h。滴加抗熒光猝滅劑后在熒光顯微鏡下觀察。

1.5 增殖與遷移實驗

1.5.1 細(xì)胞增殖實驗：細(xì)胞按1×104/m2孔接種到96孔板，培養(yǎng)12 h后饑餓24 h。隨機分組，設(shè)4個復(fù)孔，按實驗分組繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入10μ L CCK-8試劑，37 ℃放置2.5 h。在酶標(biāo)儀450 nm下讀取吸光度OD值。

1.5.2 細(xì)胞遷移實驗：細(xì)胞按5×104個/孔接種到24孔板，培養(yǎng)12 h后饑餓24 h。隨機分組，設(shè)3個復(fù)孔，按上述實驗分組繼續(xù)培養(yǎng)48 h后胰酶消化成5×104/mL單細(xì)胞懸液。在transwell小室的下室加入600μL含10% FBS的培養(yǎng)基，上室加入單細(xì)胞懸液100 μL。37 ℃培育24 h后多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，計數(shù)。

1.6 免疫熒光技術(shù)

1.6.1 免疫熒光單染技術(shù)：制細(xì)胞爬片到24孔板上，隨機分組，設(shè)3個復(fù)孔，按上述實驗分組繼續(xù)培養(yǎng)48 h。固定封閉后加入各濃度一抗4 ℃過夜，VWF（1:150），vimentin（1:100），ve-cadherin（1: 100），CD31（1:1600），α-SMA（1:120）。次日Hochest33342（1μg/mL）染核20 min后加相應(yīng)熒光二抗（DyLight 488/DyLight 594，1:300）室溫孵育1 h。滴加抗熒光淬滅劑后在熒光顯微鏡下觀察。

1.6.2 免疫熒光雙染技術(shù)：步驟同單染。CD31和vimentin混合一抗，200μ L/孔，各一抗?jié)舛炔蛔儭?/p>

1.7 蛋白免疫印跡技術(shù)檢測蛋白含量提取細(xì)胞蛋白，測定蛋白濃度，恒質(zhì)量上樣蛋白400μ g，配制10%的分離膠和3%的濃縮膠（SDS-PAGE），電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入一抗（1:1 000），4 ℃過夜（15 h），洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1:5 000），室溫下孵育1 h，洗膜，曝光。Gelpro32分析軟件進(jìn)行灰度值分析，以目的蛋白/內(nèi)參蛋白表達(dá)的相對值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)比較。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理方法采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以±s表示，對各組數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗，若符合正態(tài)分布、方差齊，則進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），組間比較采用LSD檢驗；若不符合方差齊性的要求，則進(jìn)行秩和檢驗，組間比較采用Mann-Whiteney法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下HUVECs的形態(tài)學(xué)變化光鏡下HUVECs呈多邊形，邊界清楚，呈現(xiàn)集落式生長，TGF-β誘導(dǎo)48 h后，部分細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變成梭形，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞向邊界擴散遷移，RLX聯(lián)合TGF-β則介于以上兩種形態(tài)之間，RLX可抑制內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，如圖1。

圖1 光鏡下細(xì)胞形態(tài)變化（×200 ）

2.2 原代HUVECs細(xì)胞鑒定第4代HUVECs細(xì)胞VWF相關(guān)抗原陽性率為（0.0957±0.03）%，見圖2。

圖2 第4代HUVECs細(xì)胞VWF相關(guān)抗原免疫熒光染色（×400）

2.3 增殖與遷移實驗結(jié)果

2.3.1 細(xì)胞增殖實驗：TGF-β誘導(dǎo)組較陰性對照組吸光度A值明顯降低（P＜0.05），表明TGF-β可促進(jìn)HUVECs增殖；RLX聯(lián)合TGF-β處理組與TGF-β誘導(dǎo)組相比，吸光度值明顯升高（P＜0.05），表明RLX可抑制TGF-β誘導(dǎo)的增殖效應(yīng)，見表1。

2.3.2 細(xì)胞遷移實驗：通過transwell法檢測，與陰性對照組相比，TGF-β誘導(dǎo)組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增多（P＜0.05）；與TGF-β誘導(dǎo)組相比，RLX聯(lián)合TGF-β處理組穿膜細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05），見表1。

表1 各組CCK-8實驗吸光度A值和穿膜細(xì)胞數(shù)（±s）

表1 各組CCK-8實驗吸光度A值和穿膜細(xì)胞數(shù)（±s）

與陰性對照組比：aP＜0.05；與TGF-β誘導(dǎo)組比：bP＜0.05

穿膜細(xì)胞數(shù)178.6±29.0 190.2±32.8 513.8±29.4a344.2±10.8b415.6±30.4b組別陰性對照組RLX對照組TGF-β誘導(dǎo)組TGF-β+RLX 100 ng/mL處理組TGF-β+RLX 200 ng/mL處理組A值1.17±0.06 1.37±0.02 0.85±0.04a1.16±0.03b1.19±0.04b

2.4 免疫熒光實驗結(jié)果

2.4.1 免疫熒光技術(shù)檢測vimentin和CD31單染：按實驗分組培養(yǎng)48 h后，與陰性對照組相比，TGF-β誘導(dǎo)組內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白CD31表達(dá)下降，而間質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白vimentin表達(dá)升高；與TGF-β誘導(dǎo)組相比，RLX聯(lián)合TGF-β處理組CD31升高而vimentin下降，見圖3-4。

2.4.2 免疫熒光雙染技術(shù)：對照組含極少的內(nèi)皮、間質(zhì)標(biāo)志物雙陽性細(xì)胞，而TGF-β誘導(dǎo)組明顯增多；與TGF-β誘導(dǎo)組相比，RLX聯(lián)合TGF-β處理組間質(zhì)效應(yīng)的雙陽性細(xì)胞下降，而內(nèi)皮效應(yīng)的雙陽性細(xì)胞增多。見圖5。

2.5 蛋白免疫印跡技術(shù)檢測CD31、ve-cadherin、vimantin和α-SMA蛋白表達(dá)與陰性對照組相比，TGF-β誘導(dǎo)組內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白CD31（0.36 ±0.076 vs 0.88±0.086）和ve-cadherin（0.54 ±0.046 vs 1.09±0.13）表達(dá)下調(diào)而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白vimentin（0.72±0.102 vs 0.21±0.081）和α-SMA（0.88±0.084 vs 0.24±0.046）明顯上升（P＜0.05）；與TGF-β誘導(dǎo)組相比，RLX聯(lián)合TGF-β處理組CD31（0.67±0.09、0.59±0.12 vs 0.36±0.076）和ve-cadherin（0.85±0.09、0.72 ±0.064 vs 0.54±0.046）表達(dá)上調(diào)，而vimentin（0.56±0.011、0.48±0.06 vs 0.72±0.102）和α-SMA（0.65±0.081、0.54±0.032 vs 0.88 ±0.084）表達(dá)明顯下降（P＜0.05），且呈劑量依賴性。見圖6。

圖3 各組細(xì)胞免疫熒光顯微鏡下CD31表達(dá)（綠色熒光）（×400）

圖4 各組細(xì)胞免疫熒光顯微鏡下vimentin（綠色熒光）表達(dá)（×200）

圖5 各組細(xì)胞免疫熒光顯微鏡下vimentin（綠色熒光）和CD31（紅色熒光）表達(dá)（×400）

圖6 各實驗組CD31、ve-cadherin、vimantin和α-SMA蛋白表達(dá)變化

3 討論

成纖維細(xì)胞是心肌纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞，其來源主要有損傷的組織內(nèi)固有的成纖維細(xì)胞活化和血液中的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞[4]。但是，近年的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化是成纖維細(xì)胞的重要來源，是組織器官發(fā)生纖維化的重要機制，成人心血管系統(tǒng)在應(yīng)激、創(chuàng)傷、炎癥等情況下也存在血管內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化現(xiàn)象，與心肌纖維化密切相關(guān)[5]。TGF-β是目前認(rèn)為與心肌纖維化關(guān)系最密切的細(xì)胞因子，體內(nèi)外實驗均報道TGF-β信號通路在內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化過程中起著重要作用[6]。本實驗采用體外分離的HUVECs作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的體外細(xì)胞模型，通過TGF-β誘導(dǎo)后，細(xì)胞由鋪路石樣形態(tài)向梭形形態(tài)轉(zhuǎn)化，細(xì)胞之間的連接減少，細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞增殖和遷移能力明顯增加，同時，間質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白表達(dá)明顯增加，內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白和間質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白雙陽性細(xì)胞較對照組明顯增加。這些結(jié)果提示內(nèi)皮細(xì)胞可向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，內(nèi)皮細(xì)胞是成纖維細(xì)胞的來源之一，而TGF-β可誘導(dǎo)內(nèi)皮向間質(zhì)化轉(zhuǎn)化的過程，因此通過阻斷這一過程將可能延緩和抑制纖維化的發(fā)生。

RLX最初被認(rèn)為是一種與妊娠相關(guān)的激素，妊娠期間引起子宮和產(chǎn)道松弛舒張，其機制與降解細(xì)胞間質(zhì)的膠原纖維含量相關(guān)[7]。近來的研究發(fā)現(xiàn)，RLX在心血管組織，如心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮功能上均有表達(dá)，心血管系統(tǒng)亦是RLX作用靶器官之一[3]，并且已證實其可阻斷心肌纖維化過程。動物實驗表明，RLX基因敲除小鼠心肌發(fā)生明顯的纖維化[8]，相反，外源性給予RLX干預(yù)可明顯抑制心肌纖維化模型小鼠心臟纖維含量的升高[9]。新近的臨床試驗表明RLX治療可以降低急性心力衰竭患者血壓，減輕呼吸困難癥狀，并有降低心血管和腎臟不良事件的趨勢[10]。綜上研究，RLX有望被用于人類心臟纖維化性疾病的治療。然而，目前RLX抗心臟纖維化作用的具體機制和信號通路尚不完全明確。本研究通過構(gòu)建TGF-β誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化現(xiàn)象，應(yīng)用RLX進(jìn)行預(yù)處理，觀察RLX對內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化的抑制作用。結(jié)果顯示，RLX干預(yù)后，細(xì)胞由鋪路石樣形態(tài)向梭形形態(tài)轉(zhuǎn)化明顯減少，細(xì)胞間隙、細(xì)胞增殖和遷移較TGF-β誘導(dǎo)組明顯減少，同時間質(zhì)細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白減少，內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白和間質(zhì)細(xì)胞特異性蛋白雙陽性細(xì)胞亦明顯減少，表明RLX可阻斷內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，有效地抑制內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化。2007年Zeisberg等[1]動物實驗首次證明心肌纖維化與內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化現(xiàn)象的關(guān)系，冠狀動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞是成纖維細(xì)胞的來源之一，因此，我們認(rèn)為RLX有望通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化現(xiàn)象從而減輕心肌纖維化。

總之，RLX對心肌纖維化的治療前景已得到基礎(chǔ)研究和臨床試驗的肯定，但其機制尚未完全闡明。近年來的研究證實內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化是纖維化疾病的重要機制[11]，是成纖維細(xì)胞的重要來源。本實驗通過構(gòu)建TGF-β誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化模型，闡明RLX對內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)化的影響，旨在為心肌纖維化機制研究和RLX的臨床應(yīng)用提供進(jìn)一步的依據(jù)，但其具體的作用機制有待進(jìn)一步探討。

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（本文編輯：吳健敏）

The inhibition effect of relaxin for TGF-β induced endothelial to mesenchymal transition in vitro

CHEN Xiao1, ZHOU Hao1, ZHOU Xi1, CAI Jiejie1, CHEN Lingzhi2, ZHENG Gaoshu1, HUANG Weijian1, ZHANG huaiqin1.1.Department of Cardiovascular, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Clinical laboratory, Wenzhou City Center Hospital, Wenzhou, 325000

Objective:To investgate the effect of relaxin which inducing endothelial to mesenchymal transition in vitro.Methods:Endothelial cells were isolated from human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). TGF-β10 ng/mL was added to medium for inducing endothelial to mesenchymal transition. Pretreatment relaxin 100 ng/mL and 200 ng/mL was added to medium, then co-cultured with TGF-β10 ng/mL for 48 h. The changes of morphology were observed under an inverted phase contrast microscope. CCK-8 assay was used to evaluate the cell proliferation as well as Transwell tested cell migration. The expression of CD31, vimentin, ve-cadherin and α-SMA were determined by immunofluoresence staining and western blot analysis. The co-expression of CD31 with vimentin and VWF withα-SMA were also determined by immunofluoresence.Results:A paving stone-like growth was observed in control group while TGF-β induced more spreading and migrating cells which was called EMT. However, this transition could be prevented by relaxin. Compared with the control group, the proliferation and the mobility were increased by TGF-β(P<0.05), but declined when combining with relaxin compared toadding TGF-β only (P<0.05). Compared with the control group, the specific protein of endothelial CD31 (0.36 ±0.076 VS 0.88±0.086) and ve-cadherin (0.54±0.046 VS 1.09±0.13) were significantly decreased when adding TGF-β, but the specific protein of mesenchymal vimentin (0.72±0.102 VS 0.21±0.081) and α-SMA (0.88±0.084 VS 0.24±0.046) were significantly increased. However, relaxin could inhibit the phenotype switch. Compared with the TGF-β inducing group, CD31 (0.67±0.09, 0.59±0.12 VS 0.36±0.076) and ve-cadherin(0.85±0.09, 0.72±0.064 VS 0.54±0.046) were significantly increased, but vimentin (0.56±0.011, 0.48±0.06 VS 0.72±0.102) and α-SMA (0.65±0.081, 0.54±0.032 VS 0.88±0.084) were significantly decreased when combining with relaxin. Besides, it exhibited dose-dependent. Last but not least, the number of double positive cells was largely increased in TGF-β inducing group compared to the control group. And compared with the TGF-β group, double positive cells performing mesenchymal are declined while performing endothelial ones are increased in the combined group.Conclusion:Relaxin exhibits the inhibition effect for TGF-β induced endothelial to mesenchymal transition in vitro.

relaxin; endothelial to mesenchymal transition; TGF-β; myocardial fibrosis

R329.2；R541

A

1000-2138（2014）03-0161-05

2013-11-28

浙江省自然科學(xué)基金資助項目（LY12H02004）。

陳瀟（1987-），女，浙江寧波人，碩士生。

張懷勤，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email：zhanghuaiqin@126.com。