14-3-3γ表達載體的構(gòu)建及其對子宮肌瘤細胞增殖和凋亡的影響

沈奇，張文文，陶雪嬌，段萍，朱雪瓊

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325027）

·論 著·

14-3-3γ表達載體的構(gòu)建及其對子宮肌瘤細胞增殖和凋亡的影響

沈奇，張文文，陶雪嬌，段萍，朱雪瓊

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325027）

目的：構(gòu)建一種穩(wěn)定、高表達的14-3-3γ基因真核表達質(zhì)粒載體，并探索其抗子宮肌瘤的作用。方法：提取子宮肌瘤細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后通過RT-PCR擴增14-3-3γ，并將擴增的目的基因片段插入pCMVN-Flag真核表達質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒14-3-3γ-pCMV-N-Flag，重組體經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切分析及測序鑒定后，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入子宮肌瘤細胞。應(yīng)用Western Blot法檢測14-3-3γ蛋白的表達，應(yīng)用CCK-8檢測細胞增殖變化，應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙染色法經(jīng)流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。結(jié)果：①構(gòu)建的14-3-3 γ-pCMV-N-Flag真核表達載體經(jīng)酶切后電泳和DNA測序，顯示載體構(gòu)建正確；②子宮肌瘤細胞轉(zhuǎn)染重組體后的14-3-3γ表達明顯高于轉(zhuǎn)染前（P＜0.05）；③子宮肌瘤細胞轉(zhuǎn)染重組體后，細胞增殖抑制率為52.90%（P＜0.05）；④轉(zhuǎn)染重組體后肌瘤細胞的凋亡率明顯高于轉(zhuǎn)染前（P＜0.05）。結(jié)論：本研究成功構(gòu)建14-3-3γ-pCMV-N-Flag真核表達質(zhì)粒載體，14-3-3γ在子宮肌瘤細胞內(nèi)高表達后可抑制細胞的增殖和促進細胞凋亡。

子宮肌瘤；載體構(gòu)建；增殖；凋亡

14-3-3蛋白是一類高度保守的酸性蛋白家族，目前已發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白在哺乳動物中有七種亞型，分別為：β、γ、ε、η、ζ、σ和τ。該蛋白能夠與細胞內(nèi)200多種蛋白質(zhì)結(jié)合，參與細胞信號傳導(dǎo)、周期調(diào)控、凋亡、分化、惡性轉(zhuǎn)化、遷移等多種細胞生命活動，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮多方面的作用[1]。

子宮肌瘤是女性生殖器官最常見的腫瘤，雖是良性腫瘤，卻是導(dǎo)致生育年齡婦女子宮切除的首位原因[2]，嚴重危害了婦女的生殖健康。在我們的前期研究中，率先應(yīng)用雙向凝膠電泳和電噴霧串聯(lián)質(zhì)

譜技術(shù)研究子宮肌瘤和周圍正常肌層組織的差異蛋白質(zhì)，并采用RT-PCR技術(shù)和免疫印跡（Western Blot）法進一步驗證，發(fā)現(xiàn)14-3-3 γ在子宮肌瘤中的表達明顯低于正常子宮肌層組織[3]，但14-3-3 γ在子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展中的具體作用機制尚不明確。為此，本研究擬通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，構(gòu)建人子宮肌瘤14-3-3γ高表達載體，探討14-3-3 γ對子宮肌瘤細胞增殖、凋亡的影響，為治療子宮肌瘤提供新思路和實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 子宮肌瘤和質(zhì)粒：標本取自2012年4月至2013年4月本院婦科因子宮肌瘤而住院行子宮全切或次全切除術(shù)的患者共10例。術(shù)后病理證實為普通型平滑肌瘤。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，每例納入實驗的患者均簽署知情同意書?？蛰d體pCMV-NFlag購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 工具酶及主要試劑：內(nèi)切酶BamHI、EcoRI及T4 DNA連接酶均購自美國Thermo公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒及質(zhì)粒大提試劑盒購自美國Generay公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Lipofectamin 2000及Annexin VFITC/PI凋亡試劑盒購自美國Invitrogen公司。 II型膠原酶、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。鼠抗人14-3-3γ一抗購自美國Santa Cruz公司。CCK-8試劑購自日本同仁化學(xué)研究所。

1.1.3 引物：根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中14-3-3γ的全基因組序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計有酶切位點的上、下游引物，由上海桑尼生物科技有限公司合成。14-3-3 γ基因引物序列為，上游：5’-CGCGGATCC ATGGTGGACCGCGAGCAACTG-3’（BamHI），下游：5’-CCGGAATTC TTAATTGTTGCCTTCGCCGC-3’（EcoRI），加線部分分別為BamHI和EcoRI酶切位點。

1.2 方法

1.2.1 重組14-3-3γ載體的構(gòu)建：①14-3-3γ基因的獲得：提取子宮肌瘤細胞總RNA。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的方法合成14-3-3 γcDNA第l鏈，然后以cDNA為模板，擴增14-3-3γ基因片段。PCR反應(yīng)條件：擴增14-3-3γ基因片段，94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸l min，35個循環(huán)；68 ℃終延伸4 min，產(chǎn)物進行電泳分析。②14-3-3γ基因與pCMV-N-Flag質(zhì)粒的連接：純化PCR產(chǎn)物，雙酶切PCR產(chǎn)物和pCMV-N-Flag質(zhì)粒，去磷酸化，用T4 DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH5α，然后進行抗生素篩選，搖菌，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，測序鑒定。

1.2.2 人子宮肌瘤細胞原代培養(yǎng)：①術(shù)中無菌操作取子宮肌瘤組織約2 cm3，立即置于冰浴的DMEM中，迅速送至實驗室。②無菌PBS和DMEM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗，剪碎后加入含0.2%的I I型膠原酶的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃振蕩消化3～5 h。 ③加完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，再次加完全培養(yǎng)基，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。 ④再加入適量完全培養(yǎng)基，輕輕吹打成細胞懸液，以2×105個/mL密度接種，置37 ℃、飽和濕度、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)，隔天換液，5～7 d以1:2傳代。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染：①細胞培養(yǎng)：取6孔培養(yǎng)板，向每孔中加入2 mL含1×105～2×105個細胞培養(yǎng)液，37 ℃ CO2培養(yǎng)至40%～60%融合。②轉(zhuǎn)染液制備：在EP管中制備以下兩液（為轉(zhuǎn)染每一個孔細胞所用的量）。A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋1～10μ g DNA，終量100 μL；B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋2～10 μL脂質(zhì)體（Lipofectamine 2000），終量100μL。輕輕混合A、B液，室溫中置15～20 min。③轉(zhuǎn)染準備：用2 mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入2 mL不含血清培養(yǎng)液。④轉(zhuǎn)染：把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37 ℃溫箱置6 h，吸除無血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 Western Blot法檢測14-3-3γ蛋白的表達：①用細胞裂解液裂解細胞，二喹啉甲酸法（BCA法）測定蛋白含量。②用12% SDS-PAGE（15μ L/道）將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（pol-yvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脫脂奶粉封閉后，加入一抗（14-3-3γ，1:1 000；內(nèi)參Tubulin，1:2 000），4 ℃過夜。③TBST洗膜15 min×3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2 h，TBST洗膜15 min ×3次，ECL試劑與膜作用1 min后，用美國Bio-Rad公司的圖像攝取系統(tǒng)保存圖像并分析。④計算14-3-3 γ與Tubulin產(chǎn)物吸光度積分的比值，作為14-3-3γ蛋白的表達水平。每例實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5 CCK-8檢測細胞增殖：①在96孔板中分三組，第一組、第二組每孔均配置100μ L的子宮肌瘤細胞懸液，細胞數(shù)為5 000個/100μ L，第三組每孔僅配置不含細胞的培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)（37 ℃，5% CO2）24～48 h，至細胞80%融合。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，向第一組、第二組細胞分別轉(zhuǎn)染重組體和空載體，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。②向每孔加入10μL CCK-8溶液。③將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。每組設(shè)5個復(fù)孔，獨立實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.6 Annexin V-FITC/PI雙染色法經(jīng)流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡：①用不含EDTA的胰酶消化收集子宮肌瘤細胞，離心，微量離心機轉(zhuǎn)速1 000 r/min，離心時間5 min，棄培養(yǎng)基。②用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌細胞兩次（1 000 r/min，離心5 min收集細胞）。③用400 μL 1×Binding Buffer懸浮細胞，濃度大約為1×106cells/mL。④在細胞懸浮液中加入5μL Annexin V-FITC和1μL 100μ g/mL PI輕輕混勻后于2～8 ℃避光條件下孵育15 min。⑤在1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測。每組設(shè)3個重復(fù)樣本，獨立實驗重復(fù)3次，取均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。各組資料均為正態(tài)分布資料，因此數(shù)據(jù)以±s表示。兩組均數(shù)間比較采用配對t檢驗。多均數(shù)比較采用方差分析，均數(shù)間兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒14-3-3γ-pCMV-N-Flag的構(gòu)建與鑒定

重組14-3-3γ-pCMV-N-Flag經(jīng)EcoRI單酶切后可見約5 048 bp長度的片段，與重組基因長度相符，經(jīng)BamHI/EcoRI雙酶切后電泳可見約745 bp和4 303 bp長度的片段，與目的基因和空載體長度相符，見圖1。委托上海英俊生物有限公司對重組基因從正反兩個方向進行測序，通過Blast軟件分析測序結(jié)果，證實插入片段為14-3-3γ擴增片段，且插入方向正確，截取部分正向鏈和反向鏈序列圖，見圖2。

圖1 單酶切與雙酶切14-3-3γ-pCMV-N-Flag的鑒定結(jié)果

圖2 截取部分基因測序的正向鏈和反向鏈序列圖

2.2 轉(zhuǎn)染后子宮肌瘤細胞14-3-3 γ蛋白表達的變化

采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將重組質(zhì)粒14-3-3 γ-pCMVN-Flag轉(zhuǎn)入體外原代培養(yǎng)的子宮肌瘤細胞，36 h后提取細胞蛋白，檢測14-3-3γ蛋白表達水平，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），轉(zhuǎn)染后14-3-3γ蛋白表達水平較轉(zhuǎn)染前升高，表明轉(zhuǎn)染成功，見圖3。

圖3 Western Blot法檢測子宮肌瘤細胞轉(zhuǎn)染前后14-3-3γ蛋白表達的變化

2.3 轉(zhuǎn)染后子宮肌瘤細胞增殖的變化子宮肌瘤細胞轉(zhuǎn)染14-3-3 γ-pCMV-N-Flag體外培養(yǎng)24 h后，細胞增殖抑制率為52.90%（P＜0.05）。表明14-3-3γ經(jīng)轉(zhuǎn)染在子宮肌瘤細胞內(nèi)表達增高后，有抑制肌瘤細胞增殖的作用。

2.4 轉(zhuǎn)染后子宮肌瘤細胞凋亡的變化圖4為重組體轉(zhuǎn)染子宮肌瘤細胞后的雙變量流式細胞儀的散點圖，左下象限顯示活細胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI-）。經(jīng)統(tǒng)計，未轉(zhuǎn)染的子宮肌瘤細胞有0.201±0.011處于凋亡狀態(tài)，轉(zhuǎn)染空載體的細胞有0.325±0.009處于凋亡狀態(tài)，轉(zhuǎn)染重組體的細胞有0.394±0.010處于凋亡狀態(tài)。與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染重組體與轉(zhuǎn)染空載體的子宮肌瘤細胞的凋亡率明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。轉(zhuǎn)染重組體子宮肌瘤細胞的凋亡率明顯高于轉(zhuǎn)染空載體組（P＜0.01），表明轉(zhuǎn)染14-3-3γ重組體后，子宮肌瘤的細胞凋亡率增高。

圖4 流式細胞儀檢測重組體轉(zhuǎn)染后子宮肌瘤細胞的凋亡情況

3 討論

近年來，子宮肌瘤患病率有逐年增加的趨勢[2，4]。其發(fā)生與雌、孕激素密切相關(guān)[5]，但其發(fā)生發(fā)展的分子機制尚未明確。因此，深入探討子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制，將為有效治療子宮肌瘤提供新思路和實驗依據(jù)。

14-3-3蛋白與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系近年來受到學(xué)者們的重視，包括其與乳腺癌、卵巢癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性[6-7]。國外學(xué)者采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)研究14-3-3β和14-3-3ζ對細胞功能和腫瘤細胞生物學(xué)行為的影響[8-9]。在我們的前期研究中，采用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)14-3-3γ在子宮肌瘤中的表達明顯低于正常子宮肌層組織[3]，但14-3-3γ在子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚未明確。

因此，本實驗首先將目的基因構(gòu)建在真核細胞表達載體pCMV-N-Flag，成功構(gòu)建重組質(zhì)粒14-3-3 γpCMV-N-Flag。經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶酶切鑒定和DNA測序證實目的基因14-3-3γ序列正確，目的基因正確地構(gòu)建在多克隆位點BamH I、EcoRI之間，開放閱讀框架正確。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到原代培養(yǎng)的子宮肌瘤細胞，用Western Blot法檢測轉(zhuǎn)染效果，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后細胞的14-3-3 γ蛋白表達明顯增高。子宮肌瘤細胞轉(zhuǎn)染14-3-3γ重組質(zhì)粒使細胞高表達14-3-3 γ后，細胞增殖明顯被抑制，而細胞凋亡率明顯增加，說明14-3-3 γ有抑制子宮肌瘤細胞增殖和促進細胞凋亡的作用。本實驗為進一步研究14-3-3γ的抗子宮肌瘤的作用及其相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路奠定了基礎(chǔ)，也為有效治療子宮肌瘤提供了新思路和實驗依據(jù)。

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（本文編輯：吳健敏）

Construction of a 14-3-3γ expression vector and its effect on proliferation and apoptosis of uterine lei-

omyoma cells

SHEN Qi, ZHANG Wenwen, TAO Xuejiao, DUAN Ping, ZHU Xueqiong.Department of

Obstetrics and Gynecology, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To construct stably and highly expressing 14-3-3γ gene eukaryotic expression plasmid vector and to explore its antitumor effects on uterine leiomyoma cells in vitro.Methods:The total RNA was isolated from the uterine leiomyoma cells. After reverse transcription reaction, 14-3-3γ was amplified by RTPCR. The PCR product was cloned into the eukaryote expression vector pCMV-N-Flag, the resulted recombinant was designated as 14-3-3γ-pCMV-N-Flag. After sequence determination, the recombinant vector was transfected into uterine leiomyoma cells by lipofectin. The expression of the interesting protein was confirmed by Western Blot analysis. Cell proliferation was assessed by cell counting kit-8 assay and the percentage of apoptotic cells detected by annexinV-FITC/PI double-staining was determined by flow cytometry.Results:①The 14-3-3γ gene eukaryotic expression vector was successfully constructed and identified by sequencing. ②The expression level of 14-3-3γ protein was increased obviously after transfection (P<0.05). ③The inhibitory effect on the rate of cell proliferation was 52.90% after transfection (P<0.05). ④After transfection, the percentage of apoptotic cells was increased obviously (P<0.05).Conclusion:The 14-3-3γ-pCMV-N-Flag gene eukaryotic expression plasmid vector is successfully constructed which could suppress proliferation and induce apoptosis of uterine leiomyoma cells.

uterine leiomyoma; vector construction; proliferation; apoptosis

R711.74

A

1000-2138（2014）02-0079-04

2013-10-10

國家自然科學(xué)基金資助項目（811 7192 6）。

沈奇（1987-），男，浙江麗水人，博士生。

朱雪瓊，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，Ema il：zjwzzxq@163.com。