腦利鈉肽激活環(huán)鳥苷酸/蛋白激酶G信號通路對線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放和糖原合成激酶-3β磷酸化的影響

潘國焰 林榮 吳兵 洪美滿 陳乘波 黃雪娥

.基礎(chǔ)研究.

腦利鈉肽激活環(huán)鳥苷酸/蛋白激酶G信號通路對線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放和糖原合成激酶-3β磷酸化的影響

潘國焰 林榮 吳兵 洪美滿 陳乘波 黃雪娥

目的 觀察腦利鈉肽(BNP)激活環(huán)鳥苷酸/蛋白激酶G(cGMP/PKG)信號通路對線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)開放和糖原合成激酶-3β(GSK-3β)磷酸化的影響。方法 將48只新西蘭兔隨機分為4組(12只):假手術(shù)組；對照組；BNP組；BNP+KT5823組(KT5823為蛋白激酶G抑制劑)。除了假手術(shù)組，其余3組均于結(jié)扎左回旋支45 min后恢復(fù)左回旋支血流，進行再灌注180 min。全程觀察血流動力學(xué)及心電變化；實驗終末，各組隨機抽取6只兔子，采用伊文思藍和氯化三苯基四氮唑雙染色法測定左心室心肌梗死面積；每組另外6只兔子心臟取梗死邊緣區(qū)組織，用TUNEL法檢測缺血再灌注心肌細胞的凋亡，Western blotting方法測定P-GSK-3β/GSK-3β、細胞質(zhì)細胞色素C/線粒體細胞色素C的表達。結(jié)果 各組之間HR、MABP差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＞0.05)；與對照組相比，BNP組心律失常發(fā)生率明顯減少(8.3%比83.3%，P＜0.0125)。與BNP組比較，BNP+KT5823組心律失常明顯增加(75.0%比8.3%，P＜0.0125)；假手術(shù)組無心肌梗死。與對照組比較，BNP組心肌梗死范圍明顯減少(26.02%±2.17%比40.99%±1.23%，P＜0.05)。與BNP組比較，BNP+KT5823組梗死面積明顯增加(38.94%±2.04%比26.02%±2.17%，P＜0.05)；與對照組比較，BNP組GSK-3β的磷酸化水平顯著增加(0.7800±0.0506比0.3610±0.0570，P＜0.05)，細胞質(zhì)細胞色素C/線粒體細胞色素C明顯減少(0.3420±0.0921比0.9530±0.2054，P＜0.05)。與BNP組相比，BNP+ KT5823組GSK-3β的磷酸化水平明顯降低(0.4037±0.0437比0.7800±0.0506，P＜0.05)，細胞質(zhì)細胞色素C/線粒體細胞色素C顯著增加(0.8037±0.1001比0.3420±0.0921，P＜0.05)。與對照組比較，BNP組心肌細胞凋亡數(shù)明顯減少(4.6%±2.0%比13.1%±2.7%，P＜0.05)，與BNP組相比，BNP+KT5823組心肌細胞凋亡數(shù)顯著增加(12.8%±2.3%比4.6%±2.0%，P＜0.05)。結(jié)論 BNP激活cGMP/PKG信號通路所產(chǎn)生的心肌保護作用與抑制mPTP的開放有關(guān)，cGMP/PKG信號通路的激活可以促進GSK-3β磷酸化。

心肌缺血再灌注損傷； 細胞凋亡； 環(huán)鳥苷酸/蛋白激酶G信號通路； 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔； 糖原合成激酶-3β

研究顯示，抑制心肌細胞凋亡可明顯縮小缺血再灌注心肌梗死的面積［1］。細胞凋亡是主動的有序的細胞死亡的過程，其終末階段依賴于半胱天冬氨酸蛋白酶(caspase)活化，及其對核內(nèi)和胞漿內(nèi)蛋白底物的修飾完成［2］。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)［3-4］、糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)［5］在細胞凋亡調(diào)控上扮演著重要的角色。已有研究表明，環(huán)鳥苷酸/蛋白激酶G(cyclic guanosine monophosphate/ protein kinase G，cGMP/PKG)信號通路［6］產(chǎn)生抗再灌注損傷作用，但cGMP/PKG信號通路的下游底物的分子機制仍未完全闡明。本研究擬觀察腦利鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)激活cGMP/PKG信號通路對mPTP開放的影響以及對凋亡調(diào)控因素GSK-3β的作用，探討其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及主要試劑

清潔級3～4月齡新西蘭大耳白兔48只，雌雄不拘，體質(zhì)量1.8～2.0 kg［許可證號:SCXK(滬) 2012-0011］，由上海市松江區(qū)松聯(lián)實驗動物中心提供，BNP(批號:20120802，西藏藥業(yè)公司)，氯化三苯基四氮唑(TTC)染色劑、Evans Blue(上海圓創(chuàng)生物科技有限公司)，KT5823(批號:1205006，美國Sigma公司)，線粒體和胞漿蛋白制備試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒(廈門鷺隆生物科技發(fā)展有限公司)，P-GSK-3β、GSK-3β、細胞質(zhì)細胞色素C、線粒體細胞色素C抗體(美國Santa Cruz公司)，細胞凋亡試劑盒(瑞士Roche公司)。

1.2 在體兔心肌缺血/再灌注模型制備

參照文獻［7］報道制作模型:兔子稱重，20%烏拉坦溶液按4 ml/kg麻醉。分離左頸總動脈插入導(dǎo)管至左心室，連接壓力換能器，全程記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖及監(jiān)測平均動脈壓。右側(cè)耳緣靜脈置管作為藥物輸液通道。氣管插管連接人工呼吸機作機械通氣，沿胸骨左緣第3～5肋間隙開胸，在左心耳與心尖中下1/3左回旋支下方用5-0帶線縫合針結(jié)扎以阻斷左回旋支血流，阻斷45 min后，恢復(fù)冠狀動脈血流180 min。模型成功判斷標準:結(jié)扎左回旋支后心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段呈弓背向上抬高，T波高聳等為缺血成功；放松結(jié)扎線后，抬高的ST段回落1/2以上為再灌注成功。實驗動物排除的標準:(1)嚴重的低血壓(缺血/再灌注期間平均動脈壓不能維持在50 mmHg以上)；(2)不可逆的心室顫動。

1.3 實驗分組

將48只兔子隨機均分為以下4組，每組12只: (1)假手術(shù)組:只開胸，不結(jié)扎左冠回旋支；(2)對照組(缺血/再灌注組):再灌注前5 min靜脈泵入生理鹽水，按0.l ml/min，持續(xù)整個再灌注期；(3)BNP組:再灌注前5 min經(jīng)耳緣靜脈泵入BNP，濃度0.01 μg.kg-1.min-1，按0.l m l/min速度泵入，持續(xù)整個再灌注期；(4)BNP+KT5823組:再灌注前5 min經(jīng)頸靜脈注射KT5823(1 mg/kg)，并同時經(jīng)耳緣靜脈泵入BNP，濃度0.01 μg.kg-1.min-1，按0.l ml/min速度泵入，持續(xù)整個再灌注期。

1.4 觀察指標

1.4.1 血流動力學(xué)檢測及心律失常發(fā)生情況LEAD2000-32多道生理記錄儀系統(tǒng)連續(xù)監(jiān)測血流動力學(xué)指標:心率(HR)、平均動脈壓(MABP)。于缺血前，缺血45 min，再灌注60、120、180 min記錄HR、MABP，并觀察各組實驗動物缺血45 min至再灌注180 min內(nèi)發(fā)生的各種心律失常情況。

1.4.2 心肌缺血和梗死面積測定 再灌注180 min結(jié)束后，重新結(jié)扎阻斷左回旋支血流，先于頸內(nèi)靜脈注入1%伊文思藍2 ml，待2～3 min后兔子嘴舌均呈藍色后，再靜脈推注10%氯化鉀3 ml，使心臟停于舒張期，開胸迅速取心臟，除去大血管、心房及右心室，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)液沖洗后，留左心室立即置于-20℃冰箱速凍25 min。取出左心室，沿平行于房室溝的方向均勻橫切成約2 mm厚的薄塊，置于1%TTC PBS中，37℃避光恒溫孵育15 min，此時出現(xiàn)3種顏色:藍色為非缺血區(qū)心肌，磚紅色為缺血區(qū)內(nèi)的非梗死區(qū)心肌，白色為梗死區(qū)心肌。孵育15 min結(jié)束后，取出心肌組織置于4%多聚甲醛中固定12 h，分離各種顏色區(qū)，電子天平稱重，測定左心室、缺血區(qū)及梗死區(qū)心肌重量。計算缺血區(qū)范圍=缺血區(qū)心肌重量/左心室心肌重量×100%，梗死區(qū)范圍=梗死區(qū)心肌重量/左心室心肌重量× 100%。

1.4.3 Western blotting法檢測 再灌注180 min結(jié)束后，迅速剪下左心室缺血區(qū)，PBS液洗滌干凈后，稱取100 mg心肌組織，加入1 ml細胞裂解液，機械勻漿，4℃裂解30 min，4℃12 000 r/min離心15 min，收集上清液，分裝后保存于-80℃?zhèn)溆?。另外稱取100 mg心肌組織，按線粒體和胞漿蛋白制備試劑盒說明操作，分別制備細胞質(zhì)和線粒體蛋白提取物，分裝后保存于-80℃?zhèn)溆?。用BCA法進行心肌組織蛋白定量，按試劑盒說明操作，562 nm測定吸光度。根據(jù)標準曲線計算心肌組織蛋白含量(mg/L)。心肌組織蛋白先進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移至PDVF膜上，用含10%脫脂奶粉的TBST室溫封閉40 min，與1∶1000稀釋的GSK-3β、P-GSK-3β、細胞質(zhì)細胞色素C、線粒體細胞色素C一抗(按1 ml/cm2加入)4℃孵育過夜，1∶2500稀釋的二抗室溫孵育1 h，最后ECL顯影。用Leica圖像分析軟件將圖片上每個特異性條帶進行灰度測定。

1.4.4 TUNEL檢測缺血心肌細胞凋亡 取梗死邊緣區(qū)心肌組織，制作石蠟切片，每張厚度5 μm。采用細胞凋亡原位檢測試劑盒，DNA末端標記凋亡檢測試劑盒檢測缺血心肌凋亡細胞。根據(jù)凋亡細胞的分布情況，每張切片拍攝5個陽性視野，每份標本的切片隨機選取10個200倍不重疊視野，計算凋亡陽性細胞及凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI=凋亡陽性細胞數(shù)/所有心肌細胞數(shù)×100%)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

表1 各組缺血再灌注時期的血流動力學(xué)參數(shù)(±s)

表1 各組缺血再灌注時期的血流動力學(xué)參數(shù)(±s)

注:與基線水平比較，aP＜0.05；與本組缺血45 min比較，bP＜0.05

組別兔(只)血流動力學(xué)參數(shù)基線缺血45 min再灌注60 min再灌注120 min再灌注180 min假手術(shù)組12 HR(次/min)255±10對照組12 253±11 230±10a215±11ab212±9ab208±8abBNP組12 251±11 225±9a210±8ab208±10ab211±9abBNP+KT5823組12 249±12 221±12a205±9ab204±11ab207±9ab假手術(shù)組12 MABP(mmHg)103±11對照組12 104±8 93±7a81±8ab80±5ab77±6abBNP組12 109±9 94±5a78±6ab76±7ab74±8abBNP+KT5823組12 106±9 92±8a83±9ab80±8ab78±6ab

2.1 血流動力學(xué)指標

HR和MABP在基線水平上無明顯差異(均為P＞0.05)。與基線水平相比，HR和MABP在缺血以及再灌注時期有明顯下降(均為P＜0.05)，而在再灌注時期維持較穩(wěn)定的水平。各組之間HR、MABP差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P＞0.05，表1)。

2.2 心律失常發(fā)生率

缺血再灌注導(dǎo)致出現(xiàn)多種類型的心律失常，以室性期前收縮、室性心動過速多見。再灌注期間，兔子可出現(xiàn)心律失常，但多可自行恢復(fù)。假手術(shù)組無心律失常發(fā)生。與對照組相比，BNP組心律失常發(fā)生率明顯減少(P＜0.0125)。與BNP組比較，BNP+KT5823組心律失常明顯增加(P＜0.0125，表2)。

表2 各組心律失常情況

2.3 左心室心肌缺血和梗死面積的大小

各組心肌缺血區(qū)和梗死區(qū)范圍見表3。假手術(shù)組無心肌缺血及梗死。各組之間缺血區(qū)范圍差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與對照組比較，BNP組心肌梗死范圍明顯減少(P＜0.05)。與BNP組比較，BNP+KT5823組梗死面積明顯增加(P＜0.05)。

表3 各組心肌缺血區(qū)范圍和梗死區(qū)范圍(±s)

表3 各組心肌缺血區(qū)范圍和梗死區(qū)范圍(±s)

注:與對照組比較，aP＜0.05；與BNP組比較，bP＜0.05

組別兔(只)缺血區(qū)范圍(%)梗死區(qū)范圍(%)對照組6 33.55±1.67 40.99±1.23 BNP組6 32.41±1.80 26.02±2.17aBNP+KT5823組6 31.31±1.44 38.94±2.04b

2.4 GSK-3β、P-GSK-3β、細胞質(zhì)細胞色素C及線粒體細胞色素C蛋白的表達

與對照組比較，BNP組GSK-3β磷酸化水平顯著增加，細胞質(zhì)細胞色素C/線粒體細胞色素C明顯減少(P＜0.05)。與BNP組相比，BNP+KT5823組GSK-3β磷酸化水平明顯降低，細胞質(zhì)細胞色素C/線粒體細胞色素C顯著增加(P＜0.05，圖1、表4)。

圖1 A Western blotting檢測P-GSK-3β、GSK-3β表達；圖1B Western blotting檢測細胞質(zhì)細胞色素C、線粒體細胞色素C表達

表4 各組P-GSK-3β/GSK-3β、細胞質(zhì)細胞色素C/線粒體細胞色素C比值(±s)

表4 各組P-GSK-3β/GSK-3β、細胞質(zhì)細胞色素C/線粒體細胞色素C比值(±s)

注:與對照組比較，aP＜0.05；與BNP組比較，bP＜0.05

組別兔(只) P-GSK-3β/ GSK-3β細胞質(zhì)細胞色素C/線粒體細胞色素C假手術(shù)組6 0.0308±0.0062 0.0915±0.0396對照組6 0.3610±0.0570 0.9530±0.2054 BNP組6 0.7800±0.0506a0.3420±0.0921aBNP+KT5823組6 0.4037±0.0437b0.8037±0.1001b

2.5 心肌細胞凋亡改變

與對照組(13.1%±2.7%)比較，BNP組心肌細胞凋亡數(shù)(4.6%±2.0%)明顯減少(P＜0.05)。與BNP組相比，BNP+KT5823組心肌細胞凋亡數(shù)(12.8%±2.3%)顯著增加(P＜0.05)。

3 討論

mPTP的開放是缺血再灌注過程中發(fā)生的一個關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，在細胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用［3］。mPTP是跨越線粒體外膜和內(nèi)膜的蛋白復(fù)合體，生理情況下呈低通透或關(guān)閉狀態(tài)，僅允許相對分子量小于1500的物質(zhì)通過。再灌注誘發(fā)mPTP開放，引起線粒體內(nèi)物質(zhì)釋放入胞漿，包括Cytc、促細胞凋亡因子等。Cytc釋放到胞漿，在dATP/ATP存在下，Cytc與凋亡蛋白活化因子1(APaf-1)形成凋亡復(fù)合體，通過Apaf-1氨基端的Caspase募集結(jié)構(gòu)域募集細胞中的Caspase-9前體，一個活化的APaf-1可募集多個Caspase-9，并使其自我剪切和活化，啟動Caspase的級聯(lián)反應(yīng)，激活下游的Caspase-3和Caspase-7，完成對相應(yīng)底物的切割，引起細胞凋亡［4］。

研究表明，BNP與BNP受體A結(jié)合后，活化鳥苷酸環(huán)化酶，促使細胞內(nèi)cGMP生成增加，cGMP進一步作用于下游底物PKG。cGMP/PKG信號通路參與減輕心肌缺血再灌注損傷的重要作用機制之一就是抑制細胞凋亡［6］。在兔子、大鼠完整心臟中，再灌注即刻給予外源性BNP有利于抑制心肌細胞凋亡，考慮與激活cGMP/PKG信號通路，增加抗凋亡蛋白bcl-2表達，抑制促凋亡蛋白Bax表達及Caspase-3活化有關(guān)［7］。

本實驗通過測定細胞質(zhì)/線粒體細胞色素C蛋白水平的變化來判斷對mPTP開放的程度。已知心肌梗死面積測定是目前評價心肌缺血再灌注損傷保護效應(yīng)的金標準，抑制再灌注心律失常的發(fā)生，也是對再灌注損傷心肌的一種保護作用。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，BNP組的心肌梗死面積、心律失常發(fā)生率、細胞質(zhì)/線粒體細胞色素C蛋白水平、心肌細胞凋亡指數(shù)明顯減少，而給予蛋白激酶G抑制劑KT5823后，與BNP組相比，心肌梗死面積明顯增大，心律失常發(fā)生率明顯增加，細胞質(zhì)/線粒體細胞色素C蛋白水平明顯增高，心肌細胞凋亡指數(shù)顯著增高，提示BNP激活cGMP/PKG信號通路所產(chǎn)生的心肌保護作用與抑制mPTP的開放有關(guān)。

GSK-3β是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸類蛋白激酶，其在靜息時保持激活狀態(tài)，而當(dāng)絲氨酸9位點被磷酸化時，其活性顯著降低。研究表明，GSK-3β在控制細胞凋亡信號通路上有重要作用，激活GSK-3β可以誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡，抑制GSK-3β的活性可以減輕心肌缺血/再灌注損傷，其可能的作用機制是通過抑制mPTP的開放，減少Caspase-9和Caspase-3的激活，降低核蛋白的分解與DNA鏈的剪裂，從而抑制細胞凋亡［5］。目前發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶B(PKB/ Akt)是GSK-3β的上游調(diào)節(jié)因子，而PKB/Akt是磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)下游的主要激酶，許多激活PI3K的刺激通過PKB/Akt的介導(dǎo)而抑制GSK-3β的活性［8］。研究表明，cGMP/PKG信號通路的激活與PI3K/Akt通路的激活有關(guān)［6］，而GSK-3β是PI3K/Akt的下游底物，因此，推測GSK-3β也可能是cGMP/PKG信號通路的作用底物。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，BNP組的GSK-3β磷酸化水平明顯增高，而給予KT5823后，與BNP組相比，GSK-3β磷酸化水平明顯降低，提示cGMP/PKG信號通路的激活可以促進GSK-3β磷酸化，GSK-3β可能為該信號通路成員之一。

綜上所述，BNP激活cGMP/PKG信號通路提高了GSK-3β的磷酸化水平，抑制mPTP的開放，最終抑制細胞凋亡而產(chǎn)生心肌保護作用。本研究為BNP作為抗心肌缺血再灌注損傷的藥物應(yīng)用于臨床，治療急性冠脈綜合征提供了動物實驗基礎(chǔ)。

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Impact of brain natriuretic peptide activated cyclic guanosine monophosphate/protein kinase G signaling pathway on open of m itochondrial perm eability transition pore and phosphorylation of glycogen synthase kinase-3β

Pan Guoyan1，Lin Rong2，Wu Bing2，Hong Meiman2，Chen Chengbo2，Huang Xuee2.
1 Department of Cardiology，Putian First Hospital，Putian 351100，China；2 Department of Cardiology，Quanzhou First Affiliated Hospital of Fujian Medical University

Lin Rong，Email:qzlinrong@163.com

Objective To observe the impact of brain natriuretic peptide(BNP)activated cyclic guanosine monophosphate/protein kinase G(cGMP/PKG)signaling pathway on open of mitochondrialpermeability transition pore(mPTP)and phosphorylation of glycogen synthase kinase-3β(GSK-3β). M ethods Totally 48 New Zealand white rabbits were randomly divided into four groups(12 in each group):sham group，control group，BNP group and BNP+KT5823 group(KT5823 is protein kinase G inhibitor).Occlusion of left circumflex artery for 45 min followed by 180 min reperfusion was performed on rabbits in all groups except those in sham group.Rabbits in sham group underwent open thoracotomy without ligating the left circumflex artery.Hemodynamics and ECG were obtained.At the end of experiment，6 rabbit hearts were stained by Evan's blue/triphenyltetrazolium chloride methods to test the area of infarction. The apoptosis of myocardial cell was determined by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP-biotin nick end-labeling(TUNEL)method.Expression of P-GSK-3β/GSK-3β and cytoplasmic cytochrome C/mitochondrial cytochrome C proteins in the rest hearts were analyzed using western blot assay.Results There was no significant difference in HR and MABP among four groups during I/R period(P＞0.05). Rate of arrhythmia was significantly reduced in BNP group than in control group(8.3%vs.83.3%，P＜0.0125).Rate of arrhythmia was significantly increased in BNP+KT5823group than in BNP group(75.0% vs.8.3%，P＜0.0125).Myocardial infarction did not occur in sham group.Myocardial infarct size was significantly smaller in BNP group than in control group(26.02%±2.17%vs.40.99%±1.23%，P＜0.05)，and was significantly increased in BNP+KT5823 group than in BNP group(38.94%±2.04%vs. 26.02%±2.17%，P＜0.05).Level of GSK-3β phosphorylation was increased significantly and cytoplasm cytochrome C/mitochondrial cytochrome C reduced significantly in BNP group than in control group(0.7800 ±0.0506 vs.0.3610±0.0570，0.3420±0.0921 vs.0.9530±0.2054，both P＜0.05).Level of GSK-3β phosphorylation was significantly lower and cytoplasm cytochrome C/mitochondrial cytochrome C increased significantly in BNP+KT5823 group than in BNP group(0.4037±0.0437 vs.0.7800±0.0506，0.8037± 0.1001 vs.0.3420±0.0921，both P＜0.05).The apoptotic indices of myocardial cell was significantly smaller in BNP group than in control group(4.6%±2.0%vs.13.1%±2.7%，P＜0.05).The apoptotic indices of myocardial cell was significantly increased in BNP+KT5823 group than in BNP group(12.8%± 2.3%vs.4.6%±2.0%，P＜0.05).Conclusions The myocardial protective effect of BNP which activate cGMP/PKG signaling pathway is associated with inhibition of mPTP，and activation of cGMP/PKG signaling pathway can promote phosphorylation of GSK-3β.

Myocardial ischemia-reperfusion injury； Apoptosis； Cyclic guanosine monophosphate/protein kinase G signaling pathway； Mitochondrial permeability transition pore； Glycogen synthase kinase-3β

2013-08-10)

(本文編輯:周白瑜)

This work was supported by Quanzhou Technology Plan Funded Project(No.2011Z56)

10.3969/j.issn.1007-5410.2014.02.014

泉州市科技計劃項目(2011Z56)

351100福建醫(yī)科大學(xué)教學(xué)醫(yī)院莆田市第一醫(yī)院心內(nèi)科(潘國焰)；福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州第一醫(yī)院心內(nèi)科(林榮、吳兵、洪美滿、陳乘波、黃雪娥)

林榮，電子信箱:qzlinrong@163.com