同位素稀釋質(zhì)譜法測定人絨毛促性腺激素的含量*

張曉光　黃　挺　宋德偉　武利慶　楊　屹　全　燦　李紅梅

(1.北京化工大學(xué) 理學(xué)院，北京 100029；2.中國計量科學(xué)研究院，北京 100029)

0　引言

人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)是一種由胎盤的滋養(yǎng)層合體滋養(yǎng)葉細(xì)胞所分泌的蛋白質(zhì)類的激素，是一個由a 亞基和β亞基構(gòu)成的蛋白，a 亞基有92個氨基酸，β亞基有145個氨基酸[1]。是重要的臨床標(biāo)志物，在人體內(nèi)的含量可以作為懷孕、癌癥等的診斷標(biāo)準(zhǔn)，如先兆流產(chǎn)、滋養(yǎng)葉細(xì)胞癌等胚胎性腫瘤[2-3]。由于人絨毛促性腺激素在臨床上的重要性，其標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制是必要的。而其準(zhǔn)確定量方法是前提。

目前，人絨毛促性腺激素在臨床上的主要是通過免疫或者發(fā)光試劑盒來測定其含量。雖然試劑盒有檢測快速、簡便、易于推廣等特點(diǎn)，但是靈敏度、通用性的局限性導(dǎo)致試劑盒不能廣泛應(yīng)用。近年來質(zhì)譜在臨床蛋白質(zhì)組學(xué)和檢測中成為一個日益成熟的檢測手段[4-5]。質(zhì)譜的檢測方法很多，其中同位素稀釋質(zhì)譜法是唯一一種微量、痕量和超痕量元素權(quán)威測量的方法[6]。同位素稀釋質(zhì)譜法(IDMS)是利用同位素標(biāo)記的目標(biāo)物的類似物作為內(nèi)標(biāo), 最大程度地消除了化學(xué)處理過程帶來的影響方法，處理過后的樣品再經(jīng)色譜分離、質(zhì)譜檢測，使其測量干擾很少，是目前復(fù)雜機(jī)體微量成分測量的最準(zhǔn)確的方法之一。IDMS 可以通過天平稱重和同位素豐度比的質(zhì)譜測量，將化學(xué)成分分析轉(zhuǎn)化為同位素豐度的質(zhì)譜測量。IDMS具有絕對測量性質(zhì)；靈敏度高；方法準(zhǔn)確；測量的動態(tài)范圍寬等特點(diǎn)[7]。同時樣品制備不需要嚴(yán)格分離。測量值能夠直接溯源到國際基本單位制的物質(zhì)量基本單位。

由于hCG的分子量較大，不能使用質(zhì)譜直接進(jìn)行定量分析。并且蛋白質(zhì)在酸性高溫條件下會水解成氨基酸及肽段，完全水解后的產(chǎn)物是混合的氨基酸。將蛋白質(zhì)水解后分離，并監(jiān)測產(chǎn)物，得到氨基酸的含量。根據(jù)氨基酸和蛋白質(zhì)的對應(yīng)關(guān)系可得出蛋白質(zhì)的含量[8]。

本文建立了人絨毛促性腺激素的水解-同位素稀釋質(zhì)譜的含量測量方法，在測量中只需要氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，就可以保證蛋白質(zhì)含量測定的可溯源性。該方法提高了測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度，減少了方法的不確定度。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1　主要儀器及試劑

6410型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；N-EVAP111型氮吹儀(美國Organomation公司)；UFE500型烘箱(德國Memmert公司)；SW23型振蕩水浴槽(德國JULABO公司)；Vacucell型真空干燥箱(德國MMM公司)；XP26型分析天平(最大量程22g，精度0.001mg，瑞士Mettler-Toledo公司)；ME235S型分析天平(最大量程230g，精度0.01mg，德國Sartorius公司)。

乙腈(色譜純，德國Merck)；全氟庚酸、三氟乙酸(美國Sigma)；鹽酸(優(yōu)級純，北京化學(xué)試劑公司)；甲酸(分析純，北京化學(xué)試劑公司)；人絨毛促性腺激素(美國sigma)；13C5-L-纈氨酸、13C9-L-苯丙氨酸和13C5-L-脯氨酸(98%，美國CIL公司)；纈氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸(純度分別為99.4%、99.9%、99.0%，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))。

1.2　樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的配制

本實(shí)驗(yàn)配制樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液用的都是質(zhì)量稱量法。所取樣品、標(biāo)液及水都要準(zhǔn)確稱取質(zhì)量。

1)準(zhǔn)確稱取1.063mg人絨毛促性腺激素溶于2.104g水中，配制成0.5050mg/g的hCG蛋白質(zhì)儲備溶液。

2)用苯丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、以及對應(yīng)的三種標(biāo)記氨基酸，分別配制六種氨基酸儲備溶液。

3)分別取三種非標(biāo)記的氨基酸混標(biāo)儲備溶液，溶于10mL水中，配制非標(biāo)記氨基酸混標(biāo)儲備液。

4)分別取三種標(biāo)記的氨基酸混標(biāo)儲備溶液，溶于10mL水中，配制標(biāo)記氨基酸混標(biāo)儲備液。

5)配制低標(biāo)溶液：分別稱取非標(biāo)記和標(biāo)記的氨基酸混標(biāo)溶液，使其中的非標(biāo)記氨基酸比相應(yīng)的標(biāo)記氨基酸含量略低(比值約為0.9)。

6)配制高標(biāo)溶液：分別稱取非標(biāo)記和標(biāo)記的氨基酸混標(biāo)溶液，使其中的非標(biāo)記氨基酸比相應(yīng)的標(biāo)記氨基酸含量略高(比值約為1.1)(見表1)。

7)配制樣品溶液：稱取的hCG蛋白質(zhì)儲備溶液，加入一定量的標(biāo)記氨基酸混標(biāo)溶液，使hCG水解后的氨基酸和加入的標(biāo)記氨基酸的比值約為1。

表1　氨基酸的儲備液及混標(biāo)配制

1.3　樣品的處理

把稱量好的的樣品放入40℃真空干燥箱中干燥，干燥后，等樣品恢復(fù)到室溫，加入6mol/L的鹽酸500μL。然后在樣品瓶中充入高純氮2min，并密封。之后放入110℃烘箱水解。稱量平行樣品，分別水解12h、24h、36h、48h和60h。水解結(jié)束后的樣品使用氮吹儀吹干。用0.1%的甲酸水溶液復(fù)溶。經(jīng)過0.23μm濾膜過濾后，進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜儀分析，樣品待分析前在-20℃保存。

1.4　色譜質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱Aglient的SB-AQ C18150mm×2.1mm×5μm，柱溫：40℃，流動相A相：0.8mmol/L 全氟庚酸和0.05% 三氟乙酸的水溶液。B相：乙腈。流動相梯度見表2。

質(zhì)譜條件：干燥氣流速為8L/min；毛細(xì)管溫度350℃；毛細(xì)管電壓為4000V。

1.5　樣品分析

使用上述已優(yōu)化好的條件進(jìn)行分析。質(zhì)譜采用多離子監(jiān)測模式(MRM)模式對樣品進(jìn)行監(jiān)測。方法中采用的是已經(jīng)優(yōu)化好的定量檢測離子對Phe：m/z=166→120，L-Phe：m/z=175→128； Pro：m/z=116→70；L-Pro：m/z121→74；Val：m/z=118→72, L-Val：m/z123→76。

表2　流動相梯度表

1.6　蛋白質(zhì)含量的計算

根據(jù)一個氨基酸計算的樣品溶液中蛋白質(zhì)的溶液按式(1)計算：

(1)

式中，P為氨基酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度；H為人絨毛促性腺激素水解效率；mS為標(biāo)記的苯丙氨酸的質(zhì)量(g)；RS為樣品的質(zhì)譜峰面積比；I1為低標(biāo)中非標(biāo)記苯丙氨酸/標(biāo)記苯丙氨酸質(zhì)量比；I2為高標(biāo)中非標(biāo)記苯丙氨酸/標(biāo)記苯丙氨酸質(zhì)量比；R1為低標(biāo)的質(zhì)譜峰面積比；R2為高標(biāo)的質(zhì)譜峰面積比；m為樣品溶液質(zhì)量(g)；caa為根據(jù)一個氨基酸算出的樣品溶液中毛膜促性腺激素蛋白質(zhì)的濃度(g/g)(aa分別是Phe、Pro、Val三種氨基酸)；MhCG為人絨毛膜促性腺激素蛋白質(zhì)分子量；Maa為對應(yīng)氨基酸的分子量。n為人絨毛膜促性腺激素蛋白質(zhì)序列中對應(yīng)的氨基酸個數(shù)(根據(jù)人絨毛膜促性腺激素蛋白質(zhì)序列中對應(yīng)的氨基酸個數(shù)的Phe：6個；Pro：29個；Val：19個)。

然后，由三個氨基酸計算出儲備溶液中蛋白質(zhì)的濃度c(g/g)按式(2)計算：

(2)

人絨毛膜促性腺激素蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，按式(3)計算：

(3)

式中，X為人絨毛膜促性腺激素蛋白質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(g/g)；mhCG為稱取人絨毛膜促性腺激素蛋白質(zhì)的質(zhì)量(g)；mwater為溶解人絨毛膜促性腺激素蛋白質(zhì)的水的質(zhì)量(g)。

2　結(jié)果與討論

2.1　樣品水解后的MRM檢測

圖1為水解后的樣品，經(jīng)過液相分離并采用MRM模式監(jiān)測上述三種氨基酸的離子對的同位素稀釋質(zhì)譜的典型譜圖。圖中三種氨基酸能達(dá)到分離。

2.2　水解時間對蛋白質(zhì)水解效率的影響

水解時間是影響蛋白質(zhì)水解效率的最主要因素。水解時間短會導(dǎo)致蛋白質(zhì)沒有完全水解成氨基酸，而導(dǎo)致氨基酸定量蛋白質(zhì)的結(jié)果偏低。水解時間太長會導(dǎo)致氨基酸在強(qiáng)酸環(huán)境下進(jìn)一步反應(yīng)。同樣也會造成定量結(jié)果的不準(zhǔn)確。

(從上至下分別為Phe、L-Phe、Pro、L-Pro、Val、L-Val的色譜質(zhì)譜圖)

通過稱量平行樣品水解不同時間來確定人絨毛促性腺激素的完全水解時間，如圖2。從圖中可以得出，人絨毛促性腺激素隨著時間遞增一開始氨基酸的比例也迅速遞增，24h后趨勢緩慢，說明隨著水解的進(jìn)行，氨基酸的含量不斷增加，樣品中hCG的含量不斷減少導(dǎo)致水解反應(yīng)速率降低，使比例遞增緩慢。當(dāng)?shù)?8h后比例達(dá)到最大值，如果時間再長，氨基酸的比例會降低。說明hCG在48h的時候就達(dá)到完全水解，再繼續(xù)水解會導(dǎo)致氨基酸的副反應(yīng)。從而使其比例降低。

圖2　水解時間對hCG水解程度的影響

2.3　同位素稀釋質(zhì)譜法測定樣品含量

在進(jìn)行分析時候按“低標(biāo)-樣品-高標(biāo)”的順序進(jìn)行檢測。把水解相同時間的樣品分為一組，水解48h的平行樣品為6個。經(jīng)過計算得到6個樣品的hCG分別以Phe、Pro、Val為標(biāo)準(zhǔn)的含量如表3：

表3　人絨毛促性腺激素含量

2.4　測量結(jié)果的不確定度評價

2.4.1元素的原子量和不確定度

人絨毛促性腺激素樣品通過胰蛋白酶酶切鑒定后得到的其由a 亞基(92個氨基酸)和β亞基(145個氨基酸)構(gòu)成。

人絨毛促性腺激素的蛋白質(zhì)分子中含有元素C:1105個，H:1756個，O:311個，N:322，S:26個。對每個元素來說，其標(biāo)準(zhǔn)不確定度可按IUPAC給出的數(shù)值求得(見表4)。計算hCG的摩爾質(zhì)量的不確定度為：u(MhCG)=[(1105(0.000462)2+(1756×0.000040)2+(311×0.000173)2+(322×0.000115)2+(26×0.002887)2]1/2=0.2755(g/mol)，與hCG的分子量相比遠(yuǎn)小于0.1%，可以忽略不計。

表4　元素的原子量和不確定度

2.4.2儲備溶液中蛋白濃度c的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(c)

先算出苯丙氨酸的蛋白濃度值的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur(cPhe)：

2)稱量樣品及標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度，由于使用精度為0.001mg的天平稱量0.5～1mg的樣品，用精度為0.01mg的天平稱量100～200mg的樣品，因此，天平稱量的相對不確定度小于0.1%，可以忽略不計(B類不確定度)。

3)由水解效率引入的不確定度ur(HPhe)為1%(B類不確定度)。

4)由苯丙氨酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對不確定度ur(PPhe)。由標(biāo)準(zhǔn)證書得到國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)苯丙氨酸的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.8%(B類不確定度)。

5)相對合成不確定度ur(cPhe) 。合成不確定度等于以上各項(xiàng)平方和的開方，即ur(cPhe)=1.5%。

同理可以算出由脯氨酸(Pro)，纈氨酸(Val)濃度值相對不確定度ur(cPro)，ur(cVal)具體數(shù)值見表5，則蛋白濃度c的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度由三個氨基酸的溶液值不確定度平方和開方再除以3算得，見表5。

表5　由氨基酸濃度引入的不確定度

蛋白濃度c的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度由三個氨基酸的溶液值不確定度平方和開方再除以3算得：

2.4.3蛋白定值質(zhì)量分?jǐn)?shù)X的不確定度ur(X)

蛋白定值質(zhì)量分?jǐn)?shù)的相對擴(kuò)展不確定度為：Ur(X)=k×ur(X)=2×1.5%=3.0%(k=2)

蛋白定值質(zhì)量分?jǐn)?shù)不確定度：u(X)=ur(X)×X=1.5%×0.555=0.008(g/g)

蛋白定值質(zhì)量分?jǐn)?shù)擴(kuò)展不確定度：U(X)=u(X)×k=0.008×2=0.016(g/g)

終上所述，hCG測量結(jié)果，即hCG定值質(zhì)量分?jǐn)?shù)的不確定度為0.008g/g，擴(kuò)展不確定度為0.016g/g(k=2)。

3　結(jié)語

本文首次建立了人絨毛促性腺激素水解-同位素稀釋質(zhì)譜的方法。人絨毛促性腺激素在110℃，6mol/L的HCl水解48h達(dá)到完全水解，得到其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為：0.555g/g。并且進(jìn)行了測定結(jié)果的不確定度評估，不確定度為：0.016g/g(k=2)。同時可以通過氨基酸直接溯源到氨基酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制奠定了基礎(chǔ)。

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