結直腸癌組織NEDD9的表達及臨床意義

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(青島大學醫(yī)學院附屬青島市立醫(yī)院普外科，山東 青島 266071)

神經前體細胞發(fā)育下調表達蛋白(NEDD9)是CAS 家族成員之一。近年研究顯示，NEDD9在乳癌、侵襲性黑色素瘤、肺癌、宮頸癌等惡性腫瘤組織中呈高表達狀態(tài)[1-6]，并且與腫瘤的侵襲轉移密切相關；NEDD9的作用與細胞的黏附、遷移、侵襲、細胞凋亡和上皮-間質轉化(EMT)有關[1,7]；NEDD9與非小細胞肺癌預后相關，高表達的NEDD9可以作為一個獨立的判斷預后的指標[8]。NEDD9可以作為預測腫瘤病人預后的標記物，但NEDD9在結直腸癌侵襲轉移及預后中的作用尚不清楚。本文應用免疫組化方法，檢測NEDD9在結直腸癌組織中的表達情況，并分析其與預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2007年1月—2008年9月，選取在我科行手術治療、術后病理確診為結直腸癌組織及其正常組織(距腫瘤組織距離>5 cm)標本各92例。其中男52例，女40例；年齡23～82歲，平均62歲。術后病理類型：黏液腺癌12例，管狀腺癌77例，乳頭狀腺癌3例。腫瘤部位：57例位于乙狀結腸或直腸，26例位于右半結腸，9例位于左半結腸。腫瘤分期：Ⅰ期15例,Ⅱ期30例,Ⅲ期37例,Ⅳ期10例。所有病例均為原發(fā)腫瘤，臨床病理資料及隨訪資料完整，通過電話或門診方式隨訪止2013年9月。平均隨訪時間51.2個月，失訪5例，失訪率5.4%。腫瘤分期參照2012版美國結直腸癌診療指南(NCNN)。

1.2 NEDD9檢測方法

采用免疫組織化學方法。結直腸癌組織及正常組織標本4 μm連續(xù)切片，石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，PBS清洗后用pH值為6的檸檬酸修復液在高壓鍋中進行抗原修復，再次PBS清洗后用體積分數0.03的H2O2室溫下孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶的活性，PBS清洗后用體積分數0.10正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10 min，傾去 血清，勿洗。滴加一抗工作液，4 ℃過夜。第2天滴加二抗，室溫下孵育15 min，PBS清洗后進行DAB染色，自來水充分沖洗終止染色，然后行復染、脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定

每張切片均由兩名病理醫(yī)師雙盲閱片。在40倍顯微鏡下，計數10個視野陽性細胞所占比例及視野綜合染色強度，并進行評分。陽性細胞數評分：0分，陽性細胞所占比例<10%；1分，陽性細胞所占比例10%～25%；2分，陽性細胞所占比例26%～50%；3分，陽性細胞所占比例>50%。細胞染色強度評分：0分，無色；1分，染色淡黃色；2分，染色黃色；3分，染色棕黃色。根據染色強度評分與陽性細胞數評分的乘積計算最終得分，0～3分為NEDD9低表達，4～9分為NEDD9高表達。

1.4 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計數資料比較采用χ2檢驗，生存分析采用Cox單因素及多因素分析，生存曲線應用Kaplan-Meier方法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 NEDD9在結直腸癌組織中的表達

NEDD9陽性表達主要位于細胞質，在結直腸癌組織中有68例高表達，在癌旁正常組織中有12例高表達，結直腸癌組織與癌旁正常組織NEDD9表達比較，差異有顯著性(χ2=65.35，P<0.01)。

2.2 結直腸癌組織NEDD9表達與臨床病理特征的關系

結直腸癌組織NEDD9表達與腫瘤TNM分期以及其中的pT、pN、pM有關(χ2=3.960～11.476，P<0.05)，與年齡、性別、部位及病理類型無關(P>0.05)。見表1。

2.3 結直腸癌病人NEDD9表達與預后的相關性

Kaplan-Meier生存分析顯示，NEDD9低表達和高表達結直腸癌病人的5年生存率分別是62.5%和35.3%，Log Rank檢驗顯示兩組病人生存曲線差異有顯著性(χ2=7.162，P<0.01)。見圖1。Cox單因素和多因素分析顯示，NEDD9表達和TNM分期是判斷結直腸癌病人預后的獨立因素。見表2。

3 討 論

盡管外科手術及放化療技術逐步發(fā)展，但局部復發(fā)及遠處轉移仍然是結直腸癌病人死亡的主要因素。CEA、CA199和CA125已廣泛應用于結直腸癌病人隨訪，但仍不能準確預測復發(fā)和轉移[9]。因此，急需新的標記物監(jiān)測結直腸癌病人療效及判斷預后。本文的研究結果顯示，NEDD9在結直腸癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織，差異有顯著意義；NEDD9高表達與腫瘤的進展密切相關，隨著腫瘤TNM分期的增加，NEDD9的表達增加；生存分析結果顯示，NEDD9高表達的結直腸癌病人與低表達的病人相比5年生存率更低；多因素分析結果顯示，NEDD9可以作為判斷結直腸癌預后的獨立因素。本文的研究結果與文獻報道相似[1-4]。說明NEDD9表達與結直腸癌的進展和預后密切相關， NEDD9高表達的結直腸癌病人更容易出現腫瘤進展與轉移，進而導致較差的預后。

表1結直腸癌病人NEDD9表達與臨床病理特征的相關性(例)

臨床病理參數nNEDD9高表達χ2值P值年齡(歲) <603828 ≥6054400.0020.967性別 男5239 女40290.0730.787病理類型 管狀腺癌7757 黏液腺癌129 乳頭狀腺癌320.0900.956部位 乙狀結腸和直腸5741 右半結腸2620 左半結腸970.3080.857TNM分期 Ⅰ157 Ⅱ3021 Ⅲ3730 Ⅳ101010.6300.014pT T184 T2157 T33225 T4373211.4760.009pN N04528 N12823 N219188.6280.013pM M08258 M110103.9600.047

圖1 結直腸癌病人NEDD9高表達與低表達者5年生存曲線比較

表2結直腸癌病人5年生存率單因素和多因素Cox比例風險分析

影響因素單因素RR95%CIP值多因素RR95%CIP值年齡1.0030.968～1.0210.838性別1.3220.974～1.0330.326病理類型1.4350.590～3.4900.980部位0.7300.387～1.3760.330TNM分期1.5041.033～1.3760.0441.4721.018～2.1300.040NEDD9表達2.1911.020～4.7080.0332.4351.120～5.2950.025

NEDD9最早發(fā)現在小鼠早期胚胎的大腦組織中表達，現研究證實其存在于所有的脊椎動物中。在人正常組織中，NEDD9的mRNA及蛋白產物主要集中在肺、腎、含有大量未成熟淋巴樣細胞組織及胚胎期大腦組織(成人大腦含量降低)。已有研究結果顯示，NEDD9參與成膠質細胞瘤、黑色素瘤、乳癌的轉移過程，認為NEDD9與腫瘤細胞的侵襲、遷移、轉移有關。SIMA等[6]研究結果顯示，骨架蛋白NEDD9在宮頸癌組織中高表達，高表達的NEDD9 能夠促進宮頸癌細胞的遷移與侵襲，這可能是通過黏著斑激酶(FAK)與酪氨酸激酶(SRC)的磷酸化及EMT作用實現的。KIM等[4]研究顯示，NEDD9表達與黑色素瘤的轉移有密切關系，在體內、體外試驗中都能夠增強腫瘤細胞的侵襲性；轉移的黑色素瘤與原發(fā)黑色素瘤相比較，NEDD9有更高的表達強度。KONG等[2]研究顯示，NEDD9在進展期乳癌組織中高表達，NEDD9通過上調EMT促進腫瘤的侵襲與轉移。

腫瘤的增殖、侵襲與轉移是一個復雜連續(xù)的過程。NEDD9在其中的作用機制仍然不清楚。可能是FAK與SRC磷酸化及EMT共同作用的結果。目前，多個研究小組一致認為，細胞的黏附作用能夠引發(fā)SRC、NEDD9和FAK的相互作用，三者中任何一種蛋白的高表達或異常激活都能夠促進FAK-CRK-SRC復合物的形成，它們的相互作用提高了SRC和FAK的活化作用，促進NEDD9廣泛的磷酸化，進而在SH2結構域中為效應蛋白創(chuàng)造結合位點。SIMA等[6]研究結果顯示，NEDD9的磷酸化與 FAK或SRC可能存在正反饋循環(huán)。腫瘤的侵襲通常需要EMT，細胞失去相互附著的能力，更加具有活動性。張紅梅等[10]研究結果顯示，EMT的發(fā)生率與胰腺癌的轉移有密切聯(lián)系，EMT在胰腺癌的分化、浸潤和轉移中起到重要作用。EMT能下調細胞之間起黏附作用的E-鈣黏蛋白，導致細胞黏著連接不穩(wěn)定。TIKHMYANOVA 等[3]的研究結果顯示，NEDD9是通過SRC將E-鈣黏蛋白從細胞膜表面移除并被溶酶體溶解。

綜上所述，NEDD9參與了結直腸癌的進展與轉移，并能夠準確判斷預后；NEDD9可作為判斷預后的標記物并可為結直腸癌病人提供一個新的分子治療靶點。

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