As2O3對(duì)人胃癌多藥耐藥細(xì)胞模型的逆轉(zhuǎn)耐藥作用

，，，，

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科，山東 青島 266003)

胃癌的早期癥狀不易被發(fā)現(xiàn)，近80%的病人發(fā)現(xiàn)時(shí)已為晚期，只能接受全身化療維持或延長(zhǎng)生命。而化療因?yàn)閲?yán)重的副作用及多藥耐藥的產(chǎn)生并不能明顯提高生存率[1-3]。目前，多藥耐藥成為臨床癌癥病人化療失敗的主要原因。三氧化二砷(As2O3)已有2 000多年的應(yīng)用歷史，目前主要用于治療急性早幼粒細(xì)胞白血病。近期研究顯示，As2O3能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞化療敏感性[4]。本課題組以往研究結(jié)果顯示，As2O3對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞具有耐藥逆轉(zhuǎn)及誘導(dǎo)凋亡作用[5]。目前，關(guān)于胃癌多藥耐藥細(xì)胞株模型的建立及其對(duì)多種化療藥物交叉耐藥方面的研究鮮有報(bào)道。本研究旨在應(yīng)用阿霉素(ADM)短期誘導(dǎo)建立人胃癌多藥耐藥細(xì)胞株，探討胃癌多藥耐藥機(jī)制及As2O3對(duì)其逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人胃癌親本細(xì)胞系(SGC7901/S)，由我院實(shí)驗(yàn)中心惠贈(zèng)。RPMI 1640，GIBCO公司；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清，杭州四季青生物材料研究所；As2O3，北京雙鷺?biāo)帢I(yè)有限公司；ADM,浙江海正藥業(yè)股份有限公司；長(zhǎng)春新堿(VCR)，上海醫(yī)藥集團(tuán)；紫杉醇(TAX)，北京協(xié)和制藥；鼠抗人P-糖蛋白(P-gp)、Caspase3單克隆抗體及免疫組織化學(xué)試劑盒，北京中杉生物技術(shù)有限公司；凋亡試劑盒，Invitrogen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1耐藥細(xì)胞株的建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的敏感細(xì)胞株SGC7901/S，以ADM濃度梯度遞增法誘導(dǎo)細(xì)胞耐藥性。ADM初始濃度為0.01 mg/L，作用24 h后使用PBS洗滌5次，換用新鮮正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定后，繼續(xù)遞增ADM的濃度至0.02 mg/L。依此方法，逐漸增加ADM的濃度，最終濃度達(dá)到0.60 mg/L，獲得多藥耐藥胃癌細(xì)胞株SGC7901/ADM，以ADM濃度0.20 mg/L培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行觀察，PBS沖洗2次，更換新鮮培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.2MTT法體外藥物敏感試驗(yàn) 調(diào)整細(xì)胞密度為2×108/L，然后分別將兩種細(xì)胞(SGC7901/S和SGC7901/ADM)接種于96孔板(每孔200 μL)培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)穩(wěn)定，加入梯度濃度的化療藥物ADM(0～40.0 mg/L)、TAX(0～50.0 mg/L)和VCR(0～20.0 mg/L)，每個(gè)劑量設(shè)3個(gè)復(fù)孔，孵育48 h后每孔加入MTT液10 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄上清后每孔加入DMSO 150 μL，震蕩混勻，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(AR 2010型)測(cè)定每孔490 nm處吸光度(A)值，確定3種藥物對(duì)兩細(xì)胞株生長(zhǎng)抑制50%時(shí)的濃度(IC50)，分別計(jì)算兩種細(xì)胞耐藥倍數(shù)(RI，RI=耐藥細(xì)胞IC50/敏感細(xì)胞IC50)。確定As2O3的無毒劑量和低毒劑量分別為0.1和0.5 μmol/L。將實(shí)驗(yàn)分為SGC7901/ADM+化療藥物+As2O30.1 μmoL/L組(實(shí)驗(yàn)1組)、SGC7901/ADM+化療藥物+As2O30.5 μmol/L組(實(shí)驗(yàn)2組)、SGC7901/ADM+化療藥物組(陰性對(duì)照2組)、SGC7901/S+化療藥物組(陰性對(duì)照1組)及SGC7901/ADM+化療藥物+環(huán)孢素A(CsA)4 mg/L組(陽(yáng)性對(duì)照組)，分別進(jìn)行相應(yīng)處理，每組均作用48 h。 MTT法測(cè)定各組細(xì)胞的IC50,As2O3及CsA作用后SGC7901/ADM細(xì)胞的耐藥倍數(shù)(RI′)，逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)=RI/RI′。

1.2.3免疫組化法檢測(cè)P-gp、Caspase3表達(dá) 將SGC7901/ADM和SGC7901/S細(xì)胞以2×108/L密度接種于裝有載玻片的無菌培養(yǎng)皿，孵育12 h，待細(xì)胞貼壁后分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分組及處理方法同1.2.2。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，分別作用48 h收取載玻片。40 g/L多聚甲醛室溫固定10 min，體積分?jǐn)?shù)0.03的H2O2-甲醇溶液作用10 min，兩次處理后均使用PBS持續(xù)沖洗3 min。載玻片上分別滴加P-gp和Caspase3一抗，37 ℃孵育1 h。用PBS洗滌后，集合物輔助劑作用15 min，加入辣根酶標(biāo)記的二抗作用30 min，DAB顯色2 min，蘇木精復(fù)染2 min。每張載玻片選擇3個(gè)不同視野，使用VIDAS圖像分析儀對(duì)染色進(jìn)行絕對(duì)灰度定量分析。

1.2.4流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率 將SGC7901/ADM細(xì)胞培養(yǎng)于6孔板中(2×108/L)，分別以0.1和0.5 μmoL/L的As2O3、4 mg/L的CsA作用24 h及48 h后收獲細(xì)胞。采用冷PBS洗滌離心后，取100 μL細(xì)胞懸液，加入5 μL的annexinV和1 μL的PI(100 mg/L)，室溫作用15 min，加入400 μL預(yù)冷處理的緩沖液后上流式細(xì)胞儀(B.D.Vantage型，美國(guó))檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，每組重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)

SGC7901/S細(xì)胞經(jīng)ADM誘導(dǎo)后，大部分因死亡而懸浮，剩余貼壁細(xì)胞每次藥物作用后第2～4天開始體積逐漸變大，形態(tài)不規(guī)則，胞漿中有空泡和顆粒形成，核仁變大并多個(gè)，撤藥后貼壁細(xì)胞開始呈鋪路石樣成簇生長(zhǎng)，逐漸恢復(fù)穩(wěn)定，至貼滿瓶壁。

2.2 兩種細(xì)胞對(duì)抗癌藥物的敏感性比較

SGC7901/ADM細(xì)胞(陰性對(duì)照2組)對(duì)3種抗癌藥物ADM、TAX、VCR的IC50均高于SGC7901/S細(xì)胞(陰性對(duì)照1組)，差異有顯著性(F=7.795～12.499，q=5.78～6.15,P<0.05)，SGC7901/ADM細(xì)胞對(duì)ADM、TAX及VCR表現(xiàn)出交叉耐藥性，耐藥倍數(shù)分別為7.49、7.56、5.33。見表1。

2.3 As2O3干預(yù)前后SGC7901/ADM細(xì)胞對(duì)3種抗癌藥物的IC50

經(jīng)藥物干預(yù)48 h后，實(shí)驗(yàn)1組、實(shí)驗(yàn)2組及陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)ADM、TAX和VCR的IC50均較陰性對(duì)照1組、陰性對(duì)照2組降低，差異有顯著意義(F=169.766～1 199.812，q=6.86～70.40,P<0.01)。其中實(shí)驗(yàn)2組IC50明顯低于實(shí)驗(yàn)1組，提示As2O3逆轉(zhuǎn)耐藥能力存在劑量依賴性。見表1。

2.4 As2O3作用前后SGC7901/ADM細(xì)胞內(nèi)P-gp和Caspase3表達(dá)比較

免疫組化染色顯示，P-gp蛋白陽(yáng)性染色表現(xiàn)為棕色顆粒，主要定位于細(xì)胞膜，部分定位于細(xì)胞漿。SGC7901/ADM細(xì)胞中棕色顆粒較SGC7901/S細(xì)胞明顯增多。實(shí)驗(yàn)1、2組及陽(yáng)性對(duì)照組中P-gp表達(dá)量較陰性對(duì)照2組明顯減少，差異有顯著性(F=42.870，q=7.70～21.50，P<0.01)，其中，陽(yáng)性對(duì)照組P-gp表達(dá)減少最明顯。Caspase3陽(yáng)性染色表現(xiàn)為淺棕色顆粒，主要位于核膜，兩細(xì)胞株均表達(dá)較少；實(shí)驗(yàn)2組中Caspase3表達(dá)較陰性對(duì)照2組增多，差異有顯著性(F=7.22，q=6.63，P<0.05)；其他組比較差異無顯著性(P>0.05)。見表2。

2.5 各組細(xì)胞凋亡率比較

以0.1、0.5 μmoL/L劑量的As2O3作用48 h，凋亡率均較SGC7901/ADM組升高，差異有顯著意義(F=1 986.63，q=21.23～95.08，P<0.05)；而作用24 h僅0.5 μmoL/L劑量組凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=859，q=60.37，P<0.05)。CsA作用組24 h及48 h凋亡率與SGC7901/ADM組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表3。

組別IC50(ρ/mg·L-1)ADMTAXVCRRI′ADMTAXVCR陰性對(duì)照1組3.93±0.521.85±0.111.16±0.05陰性對(duì)照2組29.44±0.5514.00±0.606.18±0.51 7.49? 7.56? 5.33?實(shí)驗(yàn)1組16.22±0.8410.05±0.224.92±0.254.785.434.24實(shí)驗(yàn)2組3.02±0.602.38±0.131.62±0.270.771.291.40陽(yáng)性對(duì)照組4.45±0.402.20±0.071.36±0.141.131.191.17

注：*為RI。

表2 各組細(xì)胞P-gp和Caspase3表達(dá)比較

組別24 h48 hSGC7901/ADM組0.46±0.020.61±0.07As2O3作用組 0.1 μmoL/L劑量組0.51±0.055.45±0.16 0.5 μmoL/L劑量組1.68±0.0522.45±0.66CsA作用組0.52±0.041.43±0.11

3 討 論

胃癌細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥的機(jī)制復(fù)雜，是腫瘤細(xì)胞在生存“壓力”下通過多種基因、多種信號(hào)途徑調(diào)控適應(yīng)的結(jié)果[6]。P-gp是一種經(jīng)典的MDR耐藥蛋白，它能夠?qū)⑦M(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)的抗腫瘤藥物排除到細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)的毒性藥物濃度降低而表現(xiàn)為抗藥性，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞自我保護(hù)[7]。另外，P-gp能阻遏多種因素對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)，包括Caspase依賴性凋亡、半胱天冬酶依賴性凋亡、細(xì)胞毒類藥物等。研究顯示，Casepase是細(xì)胞發(fā)生凋亡的主要因素，其中Caspase3是觸發(fā)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的效應(yīng)酶，最終激活DNA酶水解DNA，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，并且目前被證實(shí)在細(xì)胞抗藥性方面有著重要的應(yīng)用潛能[8]。

As2O3是從中國(guó)傳統(tǒng)中藥砒霜中分離出來的成分，在低濃度下對(duì)人體具有有益作用，如刺激造血功能，目前被廣泛用于抗癌治療[9]。體外研究結(jié)果表明，As2O3并不改變P-gp的表達(dá)也不能被其轉(zhuǎn)運(yùn)代謝，可能原因是As2O3與P-gp沒有直接的關(guān)系。As2O3對(duì)包括胃癌在內(nèi)的多種實(shí)體瘤具有誘導(dǎo)凋亡和部分分化效應(yīng)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，它能夠增加移植瘤組織Caspase3的表達(dá)量，并且與其抗腫瘤作用相關(guān)[10]。As2O3能夠通過下調(diào)P-gp表達(dá)，從而與傳統(tǒng)化療藥物ADM具有協(xié)同作用；同時(shí)能通過上調(diào)P53表達(dá)、激活Caspase3誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡。

ADM是一種經(jīng)典的抗癌藥物，廣泛應(yīng)用于臨床，能夠抑制DNA和RNA的合成[11]，是引起腫瘤細(xì)胞耐藥P-gp機(jī)制最主要的底物。P-gp能使細(xì)胞對(duì)親脂類的抗癌藥物不敏感，如抗生素類、生物堿類及植物類，而對(duì)烷化劑及抗代謝類藥物則不起作用[12]。本研究選用ADM濃度梯度遞增法誘導(dǎo)建立耐藥細(xì)胞株SGC7901/ADM，MTT法檢測(cè)顯示，SGC7901/ADM同時(shí)對(duì)ADM、TAX、VCR產(chǎn)生了低倍數(shù)耐藥，經(jīng)As2O3作用后對(duì)3種抗癌藥物的IC50下調(diào)，說明由單純一種抗癌藥物誘導(dǎo)所得耐藥細(xì)胞具有交叉耐藥性，所發(fā)生的耐藥機(jī)制又能被As2O3阻遏而逆轉(zhuǎn)。 SGC7901/ADM經(jīng)低毒劑量As2O3作用后，P-gp蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，但仍高于敏感細(xì)胞SGC7901/S，低毒劑量組IC50接近于敏感細(xì)胞，提示As2O3逆轉(zhuǎn)耐藥機(jī)制除下調(diào)耐藥蛋白外，還可能通過其他多種機(jī)制，如增加Caspase3表達(dá)的誘導(dǎo)凋亡、與化療藥物協(xié)同的細(xì)胞毒作用等，Caspase3相應(yīng)增多及凋亡率升高也證明這一點(diǎn)。

綜上所述，單純化療藥ADM能夠成功誘導(dǎo)多藥耐藥胃癌細(xì)胞株SGC7901/ADM建立，并且對(duì)其他抗癌藥物具有交叉耐藥現(xiàn)象，存在耐藥蛋白P-gp表達(dá)的上調(diào)；As2O3逆轉(zhuǎn)P-gp表達(dá)同時(shí)，有依賴Caspase3凋亡途徑的參與。

本文耐藥細(xì)胞模型的建立為以后研究耐藥機(jī)制及尋求逆轉(zhuǎn)劑提供便利。

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