平喘固本合劑對哮喘小鼠氣道急性炎癥的影響

，，，

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肺功能室，山東 青島 266003； 2 青島市婦女兒童醫(yī)院)

支氣管哮喘是一種常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，可累及不同年齡組的人群，其發(fā)病率持續(xù)上升，給哮喘病人的家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。目前,兒童支氣管哮喘的治療以全球哮喘病防治會議委員會(GINA)方案推薦的吸入糖皮質(zhì)激素抗炎治療為主，但長期應(yīng)用的安全性存在爭議[2]，探討新的治療方法和治療途徑有深遠(yuǎn)的意義。平喘固本合劑是在人參五味子湯及小青龍湯基礎(chǔ)上通過辨證形成的中藥制劑，主要由人參、白術(shù)、茯苓、炙甘草、五味子等組成。本文探討平喘固本合劑對哮喘小鼠急性氣道炎癥的影響及相關(guān)機(jī)制，旨在為中藥治療支氣管哮喘提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康雌性昆明小鼠40只，3～4周齡，體質(zhì)量為15～19 g，由青島市實(shí)驗(yàn)動物中心提供,飼養(yǎng)于我院SPF級實(shí)驗(yàn)動物中心。卵清蛋白干粉劑(OVA)，美國Sigma公司生產(chǎn)；氫氧化鋁粉，石家莊五岳制藥廠生產(chǎn)；平喘固本合劑，自制；空氣驅(qū)動霧化器，德國百瑞公司；白細(xì)胞介素4(IL-4)、干擾素γ(IFN-γ)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒，美國R&D公司生產(chǎn)。

1.2 平喘固本合劑制備

平喘固本合劑的組成：人參8 g，白術(shù)6 g,茯苓10 g,炙甘草3 g, 五味子6 g等。制備方法：所有藥物冷水浸泡0.5 h，陶器砂鍋武火煮沸后，文火煎15 min，過濾，留取藥汁；藥渣加冷水煮沸后，再熬10 min，留取藥汁，兩次藥汁共約100 mL混合，裝入已消毒玻璃容器，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?所有中藥的保存時間均不超過4 d)。

1.3 動物分組及處理方法

將小鼠隨機(jī)分為正常對照組(A組)、哮喘模型組(B組)、平喘固本合劑治療組(C組)，每組8只。根據(jù)文獻(xiàn)[3-5]方法，B、C組分別于實(shí)驗(yàn)的第1、8、15天腹腔注射含OVA 100 μg和氫氧化鋁粉2 mg的混懸液0.3 mL，A組于相同時間腹腔注射磷酸鹽緩沖液(PBS)0.3 mL。第22天起將B、C組小鼠分別放于4 L自制玻璃霧化箱內(nèi)，以50 g/L 的OVA 進(jìn)行霧化吸入激發(fā)， 每日1 次, 每次30 min，連續(xù)10 d。A組霧化吸入PBS液。同時,C組每天給予平喘固本合劑0.6 mL(含生藥0.4 g)胃飼。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞計數(shù)及分類 各組小鼠于末次激發(fā)24 h內(nèi)腹腔注射100 g/L水合氯醛0.5 mL/kg麻醉，放血處死后，常規(guī)消毒頸、胸皮膚，開胸(避免損傷肺臟)，結(jié)扎左肺，用5號注射針頭插入小鼠主氣管，再以1 mL注射針管取PBS液0.5 mL進(jìn)行肺泡灌洗，反復(fù)進(jìn)行3次，每次灌注后立即回吸，回收率達(dá)70%～80%。將回收的BALF存放在1.5 mL的EP管中，取0.1 mL于血細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞總數(shù)測定；剩余BALF離心(1 500 r/min，10 min，4 ℃)后，取其上清液置于-80 ℃冰箱中待測。沉渣于1 h涂片，Wright-Giemsa染色，光鏡下計數(shù)200個細(xì)胞，計算各種細(xì)胞的數(shù)量及百分比。

1.4.2組織病理學(xué)觀察 打開小鼠胸腔，觀察肺臟的大體改變；取左側(cè)肺臟，經(jīng)40 g/L多聚甲醛液固定約24 h，脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制備厚3 μm的標(biāo)準(zhǔn)切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，電子顯微鏡下觀察。

1.4.3BALF中IL-4、IFN-γ的測定 采用ELISA法檢測BALF中IL-4、IFN-γ的含量，按試劑盒說明書操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，多組數(shù)據(jù)間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組BALF中細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類比較

與A組比較，B組BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞明顯增多(F=85.70～127.69，P<0.05)，哮喘模型制作成功；C組細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞較B組均明顯減少，但較A組明顯升高，差異有顯著意義(q=2.15～10.08，P<0.05)。見表1。

2.2 各組BALF中IL-4和IFN-γ含量比較

與A組比較，B組中IL-4含量、IL-4/IFN-γ明顯升高，IFN-γ明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=186.17～378.06,q=17.02～21.46,P<0.05)。與B組比較，C組IL-4、IL-4/IFN-γ降低，IFN-γ升高,差異有顯著性(q=4.80～7.18，P<0.05)。見表2。

nA80.77±0.210.02±0.010.27±0.070.51±0.10B88.77±1.390.72±0.31 2.52±0.793.79±0.57C84.65±1.20 0.22±0.09 1.43±0.36 2.41±0.68

nIL-4(ρ/ng·L-1)IFN-γ(ρ/ng·L-1)IL-4/IFN-γA865.69±3.53653.73±24.750.09±0.01B8103.02±5.59 390.21±21.790.26±0.01 C890.27±4.82 444.73±26.320.20±0.02

2.3 各組小鼠呼吸道組織病理改變

A組細(xì)支氣管纖毛排列整齊，管腔黏膜完整；血管腔、肺泡腔、肺間質(zhì)均未見到明顯炎癥細(xì)胞(嗜酸性粒細(xì)胞)浸潤。B組小鼠支氣管上皮細(xì)胞增生，黏膜層增厚，局部脫落，管腔內(nèi)充滿大量黏液；支氣管壁周圍有大量炎癥細(xì)胞(嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)浸潤，支氣管壁痙攣明顯。C組炎癥反應(yīng)較B組明顯減輕，黏膜上皮無脫落，增生不明顯，黏液分泌較少，含有少量的炎癥細(xì)胞。

3 討 論

哮喘是由包括嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等在內(nèi)多種細(xì)胞共同參與的氣道慢性炎癥性疾病。其發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，至今仍未完全明了，但目前普遍認(rèn)為Th1/Th2免疫失衡是哮喘發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)[6-7]。Th2細(xì)胞通過分泌IL-4、IL-5、IL-9、IL-10等多種細(xì)胞因子促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞炎癥反應(yīng)及漿細(xì)胞釋放免疫球蛋白(IgE)，而IgE又可以觸發(fā)組胺、白三烯等多種炎癥遞質(zhì)的釋放，引起支氣管痙攣、黏膜水腫、黏液分泌增加，從而導(dǎo)致哮喘的典型癥狀[8]。其中最具有代表性的是IL-4,它是驅(qū)動Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化的重要因子，一方面可以抑制嗜酸性粒細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)氣道嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤，發(fā)生炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)黏液素基因表達(dá)和氣道黏液高分泌，從而引起氣道的阻塞狹窄；另一方面，它還參與哮喘氣道高反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展[9-10]。NAKAJIMA等[11]研究結(jié)果表明，敲除或者封閉IL-4能夠抑制過敏性疾病和其他哮喘癥狀的發(fā)生。Th1細(xì)胞則主要分泌IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-β等介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答和遲發(fā)性超敏反應(yīng)，其中IFN-γ可通過激活I(lǐng)L-17F干擾素誘導(dǎo)蛋白信號-10通路、T盒轉(zhuǎn)錄因子蛋白、一氧化氮途徑以及下調(diào)嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子受體等途徑抑制哮喘的炎癥反應(yīng)[12]。IFN-γ和IL-4是一對相互拮抗的細(xì)胞因子，其比例的失衡，是哮喘病人體內(nèi)IgE合成過多的主要原因[13]，且血清IL-4/IFN-γ的升高與哮喘嚴(yán)重程度有關(guān)，其水平在有效治療后下降[14]。

平喘固本合劑是在人參五味子湯及小青龍湯治療哮喘研究基礎(chǔ)上，通過辨證形成的方劑。前期研究結(jié)果表明，人參五味子湯及小青龍湯能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡等有效地改善氣道炎癥反應(yīng)，緩解或抑制氣道重塑，治療效果與吸入布地奈德相似[15-16]。藥理學(xué)研究表明，平喘固本合劑組方中多種中藥具有平喘作用，如甘草酸是從甘草中分離出來的三萜類成分，甘草酸苷能減少哮喘大鼠外周血及肺組織中IL-4的表達(dá)，促進(jìn)IFN-γ的表達(dá)，減輕中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞的產(chǎn)生及浸潤，明顯緩解大鼠哮喘發(fā)作程度[17]；麻黃為宣肺平喘的藥物，其主要成分為麻黃堿、右旋麻黃堿和麻黃惡唑酮，具有興奮支氣管平滑肌細(xì)胞膜上β2受體之作用，并可升高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，通過鈣離子激活鉀通道等，舒張支氣管平滑肌。熊瑛等[18]研究結(jié)果顯示，麻黃提取物對哮喘豚鼠氣道炎癥有明顯的調(diào)控作用，使豚鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞明顯減少；氣道黏膜上皮損傷與脫落以及炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕。黃芩主要成分為黃芩素，黃芩素可以抑制嗜酸性粒細(xì)胞募集相關(guān)的嗜酸細(xì)胞活化趨化因子的產(chǎn)生起到治療支氣管哮喘的作用。

本實(shí)驗(yàn)采用OVA致敏的哮喘小鼠作為研究對象，模擬哮喘發(fā)作的急性期，以BALF中IL-4和IFN-γ的濃度、細(xì)胞計數(shù)與分類為研究指標(biāo)，結(jié)合其病理改變來觀察平喘固本合劑對哮喘小鼠氣道急性炎癥的影響。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，哮喘模型組小鼠BALF中細(xì)胞數(shù)增多，IL-4和IFN-γ比例失衡，肺組織氣道黏膜上皮損傷重、炎性細(xì)胞浸潤增多，差異有顯著性，提示造模成功。與哮喘模型組比較，平喘固本合劑治療組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞明顯減少；HE染色觀察顯示，肺組織氣道黏膜上皮損傷脫落以及炎性細(xì)胞浸潤情況明顯減輕；反映Th1和Th2細(xì)胞平衡的IL-4和IFN-γ含量及比例亦明顯改善，提示平喘固本合劑治療哮喘有效。

綜上所述，平喘固本合劑對哮喘小鼠氣道炎癥有明顯的調(diào)控作用，其作用機(jī)制可能與抑制IL-4的表達(dá)、抑制炎性細(xì)胞聚積及促進(jìn)IFN-γ的表達(dá)等有關(guān)。但其信號傳導(dǎo)有待于進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]BAHADORI K, DOYLE W M, MARRAC, et al. Economic burden of asthma: a systematic review[EB/OL]. http://www.biomedcentral.com/1471-2466/9/24.

[2]王濤,李云,葉義言,等. 吸入性糖皮質(zhì)激素對哮喘兒童骨齡及生長發(fā)育的影響[J]. 中國當(dāng)代兒科雜志, 2012,14(5):359-361.

[3]朱艷芬,宋澤慶. 小鼠支氣管哮喘模型的研究現(xiàn)狀[J]. 國際呼吸雜志, 2009,29(7):438-442.

[4]楊召川,陳蕾,劉秀美,等. 中藥二步序貫治療對哮喘小鼠氣道組織核因子κB系統(tǒng)的影響[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合兒科學(xué), 2011,3(1):23-26.

[5]王立生,張春玲. 氯吡格雷對支氣管哮喘小鼠腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子影響[J]. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志, 2011,26(5):438-442.

[6]WILLS-KARP M, NATHAN A, PAGE K, et al. New insights into innate immune mechanisms underlying allergenicity[J]. Mucosal Immunology, 2010,3(2): 104-110.

[7]DEO S S, MISTRY K J, KAKADE A M, et al. Role played by Th2 type cytokines in IgE mediated allergy and asthma[J]. Lung India: Official Organ of IndianChest Society, 2010,27(2):66-71.

[8]LEMANSKE R F, BUSSE W W. Asthma: clinical expression and molecular mechanisms[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2010,125(2 Suppl 2): S95-102.

[9]KIRSTEIN F G, HORSNELL D A, KUPERMAN X, et al. Expression of IL-4 receptor alpha on smooth muscle cells is not necessary for development of experimental allergic asthma[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2010, 126(2):347-354.

[10]PERKINS C, YANASE N, SMULIAN G, et al. Selective stimulation of IL-4 receptor on smooth muscle induces airway hyperresponsiveness in mice[J]. Journal of Experimental Me-dicine, 2011,208(4):853-867.

[11]NAKAJIMA H, TAKATSU K. Role of cytokines in allergic airway inflammation[J]. International Archives of Allergy and Immunology, 2007,142(4):265-273.

[12]KAWAGUCHI MIO, KOKUBU F, HUANG S K, et al. The IL-17F signaling pathway is involved in the induction of IFN-gamma-inducible protein 10 in bronchial epithelial cells[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2007, 119(6): 1408-1414.

[13]韓征利,董翠香,曲政海,等. 小青龍湯和人參五味子湯二步序貫治療對哮喘小鼠呼吸道炎癥與重塑的影響[J]. 實(shí)用兒科臨床雜志, 2011,26(4):289-292.

[14]劉偉,李潔,李玉蘭,等. 胸腺素α1對支氣管哮喘病人IFN-γ/IL-4 失衡及肺功能的調(diào)節(jié)作用[J]. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2007,43(6):494-496.

[15]曲政海,劉小梅,謝寧,等. 人參五味子湯預(yù)防小鼠哮喘的作用機(jī)制研究[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志, 2008,15(4):201-204.

[16]劉秀美,曲政海,洪爽. 中藥二步序貫治療對哮喘小鼠肺組織GATA-3表達(dá)及氣道炎癥的影響[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合兒科學(xué), 2009,1(4):304-307.

[17]呂小華,吳鐵,覃冬云. 甘草對慢性小鼠哮喘模型氣道炎癥及外周血Th-1/Th-2失衡的影響[J]. 中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué), 2006,11(5):532-534.

[18]熊瑛,熊彬,王宋平,等. 麻黃水提物對哮喘豚鼠氣道炎癥和氣道上皮細(xì)胞STAT1信號傳導(dǎo)影響[J]. 西部醫(yī)學(xué), 2008,20(5):913-916.