復(fù)合PRP與BMP-4的Nano-HA并髓心減壓治療兔股骨頭壞死

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(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科,山東 青島 266003; 2 青島市市立醫(yī)院腎內(nèi)科)

目前，股骨頭壞死臨床發(fā)病率越來(lái)越高，晚期股骨頭壞死的主要治療方法為髖關(guān)節(jié)置換，雖然該技術(shù)已較為成熟，但仍存在假體使用年限有限等缺點(diǎn)，因此臨床治療中盡量保留股骨頭很有必要。髓心減壓術(shù)是保留股骨頭的手術(shù)治療方法之一，可通過(guò)減少淤血降低髓內(nèi)壓力從而促進(jìn)新生血管形成。近年來(lái)，隨著組織工程學(xué)和基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)富含血小板血漿(PRP)含有多種生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)新生骨形成[1]；骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖、分化和凋亡，而其主要的生物學(xué)作用是誘導(dǎo)骨形成[2]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用BMP-4協(xié)同PRP搭載納米羥基磷灰石(Nano-HA)聯(lián)合髓心減壓術(shù)修復(fù)兔股骨頭壞死，并且通過(guò)組織學(xué)觀察及骨密度檢測(cè)探討其修復(fù)股骨頭壞死的可行性。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 股骨頭壞死模型的制備及分組

健康6月齡新西蘭大白兔40只，體質(zhì)量2～3 kg，雌雄不限，每周2次臀肌注射醋酸潑尼松龍，每次8 mg/kg,連續(xù)6周,制備股骨頭壞死模型。同時(shí)，每周2次肌肉注射青霉素鈉4萬(wàn)單位以預(yù)防感染。模型制備成功后取36只大白兔，隨機(jī)分為A、B、C共3組，每組12只，在相同條件下飼養(yǎng)。

1.2 含PRP與BMP-4活性Nano-HA材料的制備

①采用低密度兩次離心法制備PRP：使用裝有100 g/L枸櫞酸鈉溶液0.5 mL的注射器從兔耳中央動(dòng)脈采集血液，將其搖勻，分別以2 400 r/min離心10 min、3 600 r/min離心15 min, 制備PRP后置-70 ℃冰箱凍存。 ②將80 mg粉末狀BMP-4 溶于2 mL無(wú)菌生理鹽水中，并加入PRP 0.6 mL制備混合溶液, 混勻，將Nano-HA材料浸泡于該溶液中混合塑形，然后于真空凍干機(jī)中凍干48 h，60Co輻照消毒，無(wú)菌封裝，備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

B組和C組大白兔耳緣靜脈麻醉后，股骨頭區(qū)域常規(guī)消毒，鋪無(wú)菌單，切開(kāi)皮膚，暴露股骨頭，用直徑約3 mm的鉆頭從股骨頸后內(nèi)側(cè)向股骨頭內(nèi)鉆入3 mm行髓心減壓術(shù)，B組髓心減壓術(shù)后逐層縫合，關(guān)閉切口；C組髓心減壓術(shù)后植入一約3 mm×3 mm×3 mm大小、含PRP與BMP-4的Nano-HA，縫合關(guān)閉切口。術(shù)后連續(xù)3 d肌注青霉素(每天20萬(wàn)單位)預(yù)防感染。A組不做任何處理。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1一般情況 實(shí)驗(yàn)期間觀察大白兔進(jìn)食、活動(dòng)、切口愈合等一般情況。

1.4.2組織學(xué)觀察 術(shù)后2、4、8周每組均處死3只兔，切取股骨頭，沿冠狀面剖開(kāi)，置于40 g/L 多聚甲醛溶液中固定,脫鈣液脫鈣，石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色, 光鏡下觀察新骨形成情況。

1.4.3骨小梁圖像分析 取B、C組術(shù)后2、4、8周股骨頭切片， 100倍顯微鏡下取5個(gè)視野，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)測(cè)定骨小梁占骨缺損面積比例，取平均值。

1.4.4骨密度測(cè)定 術(shù)后8周切取3只兔股骨頭，應(yīng)用單光子骨密度測(cè)量?jī)x測(cè)量股骨頭骨密度，測(cè)量位置為股骨頭冠狀面中部，測(cè)3次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大白兔一般情況

術(shù)后2 d各組大白兔進(jìn)食均較少，精神狀況較差，2 d后進(jìn)食逐漸增加至正常水平，活動(dòng)增加。3組大白兔切口均愈合良好，未見(jiàn)明顯炎性反應(yīng)。

2.2 各組組織學(xué)觀察

A組：術(shù)后2周，大量骨細(xì)胞及骨髓組織壞死，髓腔中充滿壞死的組織碎片，骨小梁壞死、斷裂，可見(jiàn)大量骨陷窩；術(shù)后4周，缺損邊緣可見(jiàn)少量新生骨及纖維肉芽組織；術(shù)后8周，周邊有骨組織形成，中心為纖維組織，無(wú)骨組織充填。B組：術(shù)后2周，骨缺損區(qū)可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞，缺損邊緣可見(jiàn)成骨細(xì)胞，并有少量骨小梁出現(xiàn)；術(shù)后4周，骨缺損邊緣區(qū)成骨細(xì)胞及骨小梁增多；術(shù)后8周，缺損邊緣逐漸形成骨壁，缺損區(qū)仍然在修復(fù)，可見(jiàn)大量的骨髓組織。C組:術(shù)后2周，骨缺損區(qū)充滿大量的成骨細(xì)胞，邊緣區(qū)可見(jiàn)新生骨小梁；術(shù)后4周，股骨頭內(nèi)大量骨小梁形成，骨小梁表面有成骨細(xì)胞覆蓋，小梁間新生毛細(xì)血管豐富；術(shù)后8周，骨缺損區(qū)基本消失，可見(jiàn)大量成熟的骨小梁充填其中，骨髓組織形成。

2.3 B組、C組骨小梁占缺損區(qū)面積比例比較

術(shù)后2、4、8周，C組骨小梁占缺損區(qū)面積比例均高于B組，差異有顯著性(t=2.459～2.949,P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 B組、C組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)骨小梁占缺損區(qū)面積比例

2.4 各組骨密度比較

術(shù)后8周，A、B、C組骨密度分別為(0.334±0.024)、(0.388±0.021)、(0.445±0.032)g/cm2，C組骨密度高于A組和B組，B組高于A組，差異均有顯著性(F=13.655,P<0.05)。

3 討 論

目前,股骨頭壞死已經(jīng)成為臨床中較為常見(jiàn)的疾病，股骨頭一旦壞死，難以自身修復(fù)，這主要與其自身血液循環(huán)較少、新骨形成緩慢但骨小梁吸收過(guò)快等有關(guān)。因此，促進(jìn)新生血管與新骨形成是早期股骨頭壞死治療的關(guān)鍵。本文組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，B組4周及8周時(shí)具有一定的骨小梁修復(fù)骨壞死及促進(jìn)新生骨形成的能力，其基本原理是通過(guò)降低股骨頭內(nèi)壓力，延緩骨壞死進(jìn)展，刺激周?chē)苄纬?，從而提高股骨頭的血流量以改善血液循環(huán),增強(qiáng)骨修復(fù)時(shí)的爬行替代，較快修復(fù)壞死灶。目前，髓心減壓術(shù)治療股骨頭壞死已經(jīng)被證實(shí)有效、可靠[3]。本文研究結(jié)果顯示，B組雖然進(jìn)行了髓心減壓，組織學(xué)觀察顯示也有骨小梁的修復(fù)及新生骨的形成，但由于股骨頭壞死區(qū)周?chē)狈Υ龠M(jìn)骨修復(fù)的生長(zhǎng)因子，導(dǎo)致股骨頭修復(fù)不完全。本實(shí)驗(yàn)C組同時(shí)將含PRP與 BMP-4的Nano-HA植入髓心減壓后的壞死股骨頭中，組織學(xué)觀察表明術(shù)后4周即有明顯的成骨反應(yīng)，并有明顯的新生骨形成；術(shù)后8周組織學(xué)觀察及骨密度檢測(cè)結(jié)果表明，C組的骨修復(fù)能力明顯好于B組，認(rèn)為與PRP及BMP的骨誘導(dǎo)作用及良好的支架材料對(duì)兩種生長(zhǎng)因子的理想搭載有關(guān)。

隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，PRP促進(jìn)骨缺損修復(fù)正逐漸成為研究熱點(diǎn)，PRP在骨缺損的修復(fù)治療方面取得了很好的效果[4]。PRP能增強(qiáng)體內(nèi)成骨愈合，其機(jī)制可能為：活化血小板釋放多種生長(zhǎng)因子,如血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)、類胰島素生長(zhǎng)因子(IGF)、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子-β(TGF-β) 等[5]，其中PDGF能促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)新生血管形成[6]；IGF可調(diào)整成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的分化[7]；TGF-β能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化、促進(jìn)新骨形成[8]。PRP中含有的各種生長(zhǎng)因子符合人體的比例，因此成為臨床應(yīng)用中的理想生長(zhǎng)因子來(lái)源。BMP是目前已知的確定具有骨誘導(dǎo)功能的生長(zhǎng)因子[9]。關(guān)于BMP在骨形成中的作用機(jī)制主要集中在以下兩個(gè)方面：①募集間充質(zhì)細(xì)胞并誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化；②聯(lián)合其他生長(zhǎng)因子共同參與骨組織的形成[10]。有研究結(jié)果顯示，BMP的作用與距離呈反比，當(dāng)骨缺損超過(guò)一定范圍時(shí)，機(jī)體自身的BMP已經(jīng)難以起到誘導(dǎo)骨形成的功能，因此適當(dāng)補(bǔ)充外源性的BMP十分必要。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，人們已經(jīng)研制出了活性高、成本低的BMP,這使得外源性BMP的來(lái)源問(wèn)題得到了解決。

PRP與BMP本身無(wú)固定與支撐功能，植入體內(nèi)骨缺損部位后容易被擴(kuò)散稀釋或吸收降解，難以持久地在骨缺損處發(fā)揮作用。因此，尋找一種生物相容性較好的材料一直是材料學(xué)與臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重大研究任務(wù)。本文組織學(xué)研究結(jié)果顯示，Nano-HA具有良好的生物活性，具有誘導(dǎo)成骨活性的能力，新生的組織中含有促進(jìn)骨形成的生長(zhǎng)因子及具有成骨潛能的細(xì)胞，而且該材料具有較高的比表面積，容易吸收，在新骨形成的同時(shí)逐漸降解[11]，并被新生的骨組織替代。其具有的多孔結(jié)構(gòu)使得成骨細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)容易爬行附著，骨缺損的爬行替代過(guò)程縮短，并能夠?yàn)樾律芗吧L(zhǎng)因子提供附著支撐。同時(shí)，本文組織學(xué)觀察未見(jiàn)明顯炎性反應(yīng)，說(shuō)明Nano-HA有良好的生物相容性。已有研究結(jié)果證實(shí)，Nano-HA對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，是一種理想的骨移植替代材料[12]。

本文研究結(jié)合了組織工程治療與外科治療的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用髓心減壓術(shù)減輕骨內(nèi)高壓與靜脈淤血，促進(jìn)了股骨頭的血液循環(huán)；通過(guò)生長(zhǎng)因子的植入，提高了骨修復(fù)的能力，加速了骨的形成過(guò)程，這為臨床上早期股骨頭壞死的治療提供了新的思路。但本文研究中也有一些需要進(jìn)一步研究的地方，如無(wú)法證實(shí)生長(zhǎng)因子的濃度與骨誘導(dǎo)的關(guān)系。希望今后能對(duì)此進(jìn)行研究并確定生長(zhǎng)因子作用的最佳濃度。

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