不同劑量電離輻射對SKOV3裸鼠移植瘤組織HIF-1α及p53表達影響

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(青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院,山東 青島 266003 1 腫瘤科； 2 中心實驗室)

乏氧是實體腫瘤中一種常見現(xiàn)象，腫瘤微環(huán)境中都存在不同程度的乏氧。乏氧可以使腫瘤細胞內(nèi)的一系列基因發(fā)生變化，從而使相應基因所在的傳導通路的上游基因發(fā)生變化，這些基因的產(chǎn)物引起乏氧腫瘤細胞的一系列生物學行為改變。乏氧時腫瘤細胞在適應乏氧微環(huán)境的同時，又與腫瘤放化療抵抗、惡性進展、遠處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]，低氧誘導因子-1α(HIF-1α) 為其中關(guān)鍵作用因子，與放化療抗拒、浸潤轉(zhuǎn)移等均有密切關(guān)聯(lián)[2]。p53基因是一種常見的抑癌基因，乏氧和DNA損傷可以導致p53表達增多，且HIF-1α與p53的關(guān)系密切[3]。小劑量電離輻射可以產(chǎn)生抑瘤效應[4]，但這種效應機制不明。本實驗旨在觀察小劑量和大劑量X線照射后SKOV3裸鼠移植瘤內(nèi)HIF-1α和p53表達情況的差異，探討小劑量輻射產(chǎn)生抑瘤效應的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

卵巢上皮性癌細胞株SKOV3，購于中國科學院上海細胞庫。BALB/C雌性裸鼠，4～5周齡，體質(zhì)量10～13 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。Trizol RNA提取試劑，購自美國Invitrogen公司；TAKARA PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司；兔HIF-1α單抗，購自Abcam香港有限公司；HIF-1α、p53引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；免疫組化鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶(SP) 試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑，均購自北京中山生物金橋技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1移植瘤動物模型建立 SKOV3卵巢癌細胞于含體積分數(shù)0.10新生小牛血清的DMEM-1640培養(yǎng)液中，37 ℃、含體積分數(shù)0.05的CO2條件下傳代培養(yǎng)，收集細胞，調(diào)整細胞密度為3×1011/L，于裸鼠右側(cè)股內(nèi)側(cè)皮下接種6×107個SKOV3細胞，接種后待移植瘤長至最大直徑2 cm。

1.2.2動物分組及照射 將荷瘤裸鼠隨機分成對照組(A組)、小劑量照射組(B組)、大劑量照射組(C組)和聯(lián)合照射組(小劑量誘導+大劑量照射，D組)，每組6只。A組不做任何處理，其余各組均采用劑量率為3.0 Gy/min的瓦里安23-EX直線加速器、 6 MV的X射線進行腫瘤局部單次照射，B組照射劑量為0.5 Gy;C組照射劑量為3.0 Gy;D組先照射0.5 Gy，24 h后再照射3.0 Gy。

1.2.3腫瘤標本采集及處理 各組裸鼠分別于照射后48 h采用脫頸法處死，立即取完整腫瘤標本，切取部分腫瘤組織置40 g/L中性甲醛固定液中固定6～18 h，標本脫水后石蠟包埋備用。剩余腫瘤標本于-80 ℃液氮冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4腫瘤標本總RNA的提取 將超低溫冷凍的腫瘤組織用電子天平稱取100 mg，用剪刀冰上剪成小碎塊后放入新的EP管(1.5 mL)中，按照Trizol RNA提取說明書的步驟提取RNA，放入-70 ℃冰箱中保存。

1.2.5引物設(shè)計及其合成 檢索NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫分別獲得目的基因(HIF-1α、p53)及內(nèi)參基因(GAPDH)的全長序列，利用引物和探針設(shè)計軟件Premier 5.0設(shè)計目的基因及內(nèi)參基因的引物序列，擴增引物序列及擴增片段長度見表1。

1.2.6半定量RT-PCR 將提取的4組RNA在紫外線分光光度儀上測定A260/A280比值，并調(diào)整各組的濃度相一致。按照TAKARA PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2試劑盒說明書，分別進行HIF-1α和p53基因的RT-PCR。

表1 HIF-1α、p53及其內(nèi)參基因GAPDH的引物序列及擴增片段長度

1.2.7PCR產(chǎn)物測定及圖像分析 取PCR產(chǎn)物5 μL,以DNA Marker作為PCR片段大小指示劑，20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，120 V電壓電泳20 min，在紫外線燈下觀察PCR擴增的特異產(chǎn)物。經(jīng)凝膠掃描系統(tǒng)進行吸光度積分掃描，實驗重復6次，以GAPDH為內(nèi)參計算HIF-1α、p53積分吸光度比值進行定量分析。

1.2.8免疫組化染色檢測HIF-1α蛋白的表達 取經(jīng)中性甲醛固定液固定的腫瘤標本切片，應用免疫組化SP法檢測HIF-1α蛋白的表達。每只小鼠取1張切片，每組共取6張切片，以PBS作陰性對照, HIF-1α陽性的宮頸癌手術(shù)標本作陽性對照。隨機選擇4個高倍視野(400倍)，根據(jù)陽性細胞所占比例及著色強度判定結(jié)果。染色強度分為4個等級：無染色為 0，弱染色(淺黃色)為 1，中等染色(棕黃色)為 2，強染色(黃褐色)為 3。陽性細胞所占比例分為5個等級：陽性細胞數(shù)量<5%為0，陽性細胞5%～24%為1，陽性細胞25%～49%為2，陽性細胞50%～74% 為3，陽性細胞75%～100%為4。細胞陽性染色強度和陽性細胞比例的計分平均數(shù)相乘從而得到加權(quán)得分，加權(quán)得分0～3為陰性(-)；4～6為(+)；7～9為()；10～12為()。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 各組腫瘤組織HIF-1α mRNA表達比較

各組腫瘤組織中HIF-1α mRNA均有一定量的表達(圖1)，4組間相比較差異有統(tǒng)計學意義(F=116.897,P<0.05)。其中，與A組相比較，B組HIF-1α mRNA表達明顯下降，C組明顯升高，差異有顯著性(t=10.14、8.78，P<0.05)；A、D兩組比較HIF-1α mRNA表達差異無顯著意義(t=1.84，P>0.05)。見表2。

2.2 各組腫瘤組織p53 mRNA表達比較

各組腫瘤組織中p53 mRNA表達比較，差異有顯著性(F=353.794，P<0.05)。其中，與A組比較，B組p53 mRNA表達明顯下降，C組明顯升高，差異有顯著性(t=8.84、22.36，P<0.05)；A、D兩組間p53 mRNA表達比較差異無顯著意義(t=1.28，P>0.05)。見表2、圖2。

圖1 各組腫瘤組織HIF-1α瓊脂糖凝膠電泳圖

表2 各組腫瘤組織中HIF-1α mRNA和p53 mRNA表達比較

2.3 各組腫瘤組織HIF-1α蛋白表達

圖2 各組腫瘤組織p53瓊脂糖凝膠電泳圖

A：對照組；B：小劑量照射組；C：大劑量照射組；D：聯(lián)合照射組。伊紅-蘇木精染色，400倍。

3 討 論

乏氧是影響腫瘤放射治療敏感性的重要因素。電離輻射對腫瘤細胞的生物效應需要氧的存在。在有氧存在的情況下，氧與電離輻射產(chǎn)生的自由基形成有機過氧基，電離輻射引起的DNA損傷被有機過氧基化學固定下來，導致腫瘤細胞的死亡。實體瘤中很多區(qū)域的血供不能滿足腫瘤生長的需要，這些區(qū)域腫瘤細胞因供氧不足而營養(yǎng)不良，被稱為乏氧細胞。乏氧細胞對電離輻射抗拒，導致放療后實體瘤腫瘤細胞殘存，增加了腫瘤復發(fā)的風險[5]。因此，如何在放射治療過程中盡可能減少乏氧細胞的數(shù)量，改善實體瘤的乏氧情況，成為了一個亟待解決的問題。

目前，測定實體瘤乏氧程度的方法有很多，如氧敏感微電極法[6]、DNA彗星分析法[7]、腫瘤細胞乏氧生物學指標法[8]等。本文采用免疫組化方法，檢測常用乏氧生物學指標HIF-1α在SKOV3裸鼠移植瘤組織的表達情況，以判定腫瘤組織的乏氧情況。已有研究結(jié)果顯示，常規(guī)電離輻射可導致腫瘤細胞中HIF-1α蛋白表達上調(diào)，并使腫瘤相關(guān)巨噬細胞釋放的NO與HIF-1α蛋白發(fā)生S-亞硝基化，從而使HIF-1α穩(wěn)定性明顯增加，導致腫瘤血管生成，對放化療抗拒和浸潤轉(zhuǎn)移[9]。小劑量電離輻射是否可以通過改善實體瘤的乏氧情況而增加常規(guī)誘導的效果研究較少。本文結(jié)果表明，小劑量電離輻射可以降低腫瘤組織中HIF-1α蛋白的表達，即可以改善乏氧；小劑量誘導加大劑量照射與直接大劑量照射相比，前者腫瘤組織乏氧程度較輕，表明小劑量照射可以改善實體瘤的乏氧情況，增強腫瘤組織的放射敏感性。

本實驗結(jié)果還顯示，小劑量照射可以降低HIF-1α及p53 mRNA的表達水平，小劑量誘導加大劑量照射組腫瘤組織中兩者的表達水平與對照組比較差異無顯著性，而單純大劑量照射組腫瘤組織中兩者表達水平較對照組明顯升高。HIF-1α mRNA表達增加可以使放療抵抗、血管生成增多，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移，導致腫瘤復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移的概率增加[10]。因此，小劑量照射可通過降低HIF-1α mRNA表達，減少腫瘤的血管形成，使病人有更好的預后。多項研究顯示，乏氧與DNA損傷可以上調(diào)p53 mRNA的表達，但低氧不引起野生型p53基因的轉(zhuǎn)錄水平升高，在低氧區(qū)域，p53野生型腫瘤細胞會發(fā)生凋亡，這導致了突變型p53腫瘤細胞的殘存和擴增，這些細胞具有更高的凋亡閾值及乏氧耐受能力[11]，這導致腫瘤放射敏感性降低，預后變差。本文結(jié)果顯示，大劑量組p53 mRNA表達較對照組升高，表明突變型p53基因轉(zhuǎn)錄增加，導致腫瘤放射敏感性降低，腫瘤侵襲程度增加，腫瘤出現(xiàn)局部復發(fā)和轉(zhuǎn)移；而小劑量誘導加大劑量照射組p53 mRNA表達與對照組比較差異無顯著性，可能與小劑量誘導加大劑量照射組的乏氧程度較大劑量照射組輕有關(guān)。

綜上所述，腫瘤病人接受大劑量放療前1 d先進行小劑量的誘導照射，可顯著降低腫瘤組織的乏氧狀況，降低HIF-1α與p53 mRNA的表達水平，從而增加放療敏感性，減少腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移。其機制尚需進一步研究。探討其可能機制，可為改善臨床放射治療模式，提高放射敏感性，降低轉(zhuǎn)移風險等提供更好的理論基礎(chǔ)和方案。

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