胡桃楸不同營(yíng)養(yǎng)器官POD同工酶的動(dòng)態(tài)變化

張麗敏, 薛 晶, 封彥杰, 張衛(wèi)東, 王 仲

(佳木斯大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 黑龍江 佳木斯 154007)

胡桃楸( Juglans Mandshurica Maxim)又名核桃楸、山核桃，為胡桃科胡桃屬落葉喬木。主要分布于中國(guó)東北及華北地區(qū)，是東北地區(qū)著名的“三大硬闊樹(shù)種”之一，為珍貴用材，也是著名的藥用植物。同工酶是基因的直接產(chǎn)物，具有明顯的種屬、組織和發(fā)育階段特異性。過(guò)氧化物酶(POD)同工酶是植物體中常見(jiàn)的氧化酶，廣泛參與多種生理活動(dòng)，植物體內(nèi)的許多生理過(guò)程及植物的不同發(fā)育時(shí)間、環(huán)境條件的變化常與POD同工酶的種類(lèi)及活性有關(guān)[1-3]。目前，有關(guān)胡桃楸研究的報(bào)道較多，但對(duì)胡桃楸P(pán)OD同工酶的研究還未見(jiàn)報(bào)道[4-8]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)胡桃楸不同器官POD同工酶進(jìn)行生長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)測(cè)定、比較分析，旨在掌握其同工酶譜帶的變化規(guī)律，為更好地了解山核桃生長(zhǎng)期特點(diǎn)，探討山核桃生理代謝、發(fā)育特點(diǎn)與同工酶譜帶的關(guān)系，為促進(jìn)胡桃楸食藥用開(kāi)發(fā)利用、引種栽培提供生化水平參考。并試圖為進(jìn)一步探討藥用次生代謝產(chǎn)物的生成與POD活性大小及同工酶譜帶數(shù)的消長(zhǎng)關(guān)系，為探索山核桃藥源不同生長(zhǎng)發(fā)育期的特征提供相應(yīng)的檢測(cè)生化指標(biāo)[1, 9-12]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

胡桃楸整個(gè)生長(zhǎng)周期可分為生長(zhǎng)和休眠兩個(gè)階段，北方樹(shù)種于5月初葉片開(kāi)始萌發(fā)，10月末落葉，即5月—11月為胡桃楸的生長(zhǎng)期，11月—次年4月為休眠期。生長(zhǎng)期內(nèi)生命活動(dòng)旺盛，同工酶類(lèi)、次生代謝產(chǎn)物等表達(dá)和積累豐富，故本供試材料胡桃楸取自黑龍江省佳木斯市四豐山生長(zhǎng)結(jié)實(shí)較好的成片山核桃林，于2012年5月—11月，每月15日—20日取胡桃楸10棵優(yōu)樹(shù)混合得到樹(shù)根、樹(shù)皮(莖皮)、枝皮、樹(shù)枝(當(dāng)年生枝條)、樹(shù)葉5個(gè)營(yíng)養(yǎng)器官樣品。依次用1，2，3，4，5編號(hào)。所采樣品用濕布包裹，塑料袋封裝，盡快帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

將胡桃楸各營(yíng)養(yǎng)器官用清水洗凈，再用蒸餾水漂洗，濾紙吸干后稱(chēng)重，每克鮮重加4 mL提取液(pH值7.2的蔗糖—磷酸緩沖液)，冰浴下研磨至勻漿狀，4層紗布過(guò)濾，將濾液3800 r/min離心15 min，上清液(樣品)置冰箱(-20℃)備用。

1.2.2 電泳

采用聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳方法，分離膠濃度7.5%,濃縮膠濃度3.5%。4℃恒壓(350 V)電泳，電極緩沖液為pH值 8.3 Tris-Gly系統(tǒng)。樣品點(diǎn)樣量均為15 μL，電泳重復(fù)2次。

1.2.3 染色及遷移率(Rf)的測(cè)定

采用醋酸聯(lián)苯胺法染POD，待酶帶顯現(xiàn)清晰后，用流水漂洗后置蒸餾水中保存，Rf測(cè)定按照見(jiàn)參考文獻(xiàn)[13]。

1.2.4 凝膠板的保存

用10%甘油浸泡玻璃紙8 h以上，然后在玻璃板上先放1張玻璃紙鋪平，其上放凝膠，凝膠上再放1張玻璃紙，排除玻璃紙與凝膠間的氣泡，陰干、保存，以備考證。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本譜型

胡桃楸5個(gè)器官疊加后的酶譜型即本實(shí)驗(yàn)所觀察到的胡桃楸P(pán)OD同工酶基本譜型，共顯現(xiàn)29條酶帶，從負(fù)極到正極劃分為A、B、C 3個(gè)區(qū)。A區(qū)Rf=0～0.47，共顯現(xiàn)8條酶帶A1至A8；B區(qū)Rf=0.48～0.70，共顯現(xiàn)14條酶帶B1至B14；C區(qū)Rf=0.71～1.0，共顯現(xiàn)7條酶帶C1至C7，依染色深淺區(qū)分為特強(qiáng)帶、強(qiáng)帶、次強(qiáng)帶、弱帶和痕跡帶5個(gè)級(jí)別。

2.2 不同器官同工酶酶譜動(dòng)態(tài)特征

2.2.1 根中POD同工酶酶譜變化

從電泳圖譜(圖1)可見(jiàn)，5月至11月，各生育階段根中POD酶帶變化明顯。共顯現(xiàn)15條酶帶，A3、A5、A7、B1、B3、B7、B9、B10、C2、C4這10條酶帶始終表達(dá)，為根部的基本譜帶，其中A7、B1、C4在生長(zhǎng)期內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定，強(qiáng)度不變，而其余7條皆隨生長(zhǎng)期不同，酶表達(dá)強(qiáng)度發(fā)生變化，其差異可以作為表達(dá)各生長(zhǎng)發(fā)育階段系統(tǒng)發(fā)育差異的指標(biāo)。其中B3、C2兩條表現(xiàn)出5月、10月表達(dá)較強(qiáng)，其它月表達(dá)較弱的特點(diǎn)。5月天氣漸暖，胡桃楸開(kāi)始萌芽，此時(shí)期屬于休眠轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)期階段，10月天氣轉(zhuǎn)寒，胡桃楸葉片脫落，此時(shí)期屬于生長(zhǎng)轉(zhuǎn)入休眠期階段。這兩個(gè)時(shí)期都為胡桃楸生長(zhǎng)期和休眠期的過(guò)渡時(shí)期，B3、C2在這兩個(gè)時(shí)期表達(dá)較強(qiáng)可作為此過(guò)渡時(shí)期的特征性酶帶。A3、A5、B7、B9、B10 5條隨生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，出現(xiàn)表達(dá)強(qiáng)度的周期變化。A2、B4、B11、B13、C3 5條酶帶表達(dá)均表現(xiàn)出生長(zhǎng)時(shí)期特異性，A2 、B4酶帶出現(xiàn)5、6、7月表達(dá)，8、9月逐漸消失，10、11月又逐漸出現(xiàn)的周期性變化，B11、B13酶帶5、6月表達(dá)，7月消失，8、9月出現(xiàn)，10月消失，11月再度出現(xiàn)，出現(xiàn)周期性變化。

圖1 根POD同工酶

2.2.2 樹(shù)皮(莖皮)中POD同工酶酶譜變化

圖2 莖皮POD同工酶

由電泳圖譜(圖2)可見(jiàn)5月至11月，莖皮中POD酶帶變化明顯，共顯現(xiàn)18條酶帶。A3、A5、A7、B1、B3、B9、B10、B11、C4這9條酶帶皆表達(dá)，為莖皮部的基本譜帶，但皆隨生長(zhǎng)期不同，酶表達(dá)強(qiáng)度發(fā)生變化，其差異可以作為表達(dá)各生長(zhǎng)發(fā)育階段系統(tǒng)發(fā)育差異的指標(biāo)。酶帶C4隨生長(zhǎng)期延長(zhǎng)表達(dá)逐漸減弱為痕跡帶，其余8條酶帶均表現(xiàn)出11月表達(dá)較弱的特點(diǎn)且隨生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，表達(dá)強(qiáng)度表現(xiàn)周期性變化。另外B3酶帶5、10月特異表達(dá)，可作為胡桃楸生長(zhǎng)與休眠過(guò)渡時(shí)期的特異表達(dá)酶帶。B8酶帶7、8月特異表達(dá)，而此兩月中B4、B12酶帶消失，表現(xiàn)出生長(zhǎng)期中生殖生長(zhǎng)階段特異性。此外莖皮的各酶帶的表達(dá)皆出現(xiàn)11月表達(dá)強(qiáng)度下降或酶帶消失的特點(diǎn)。北方胡桃楸10月落葉，11月進(jìn)入冬季，胡桃楸已經(jīng)進(jìn)入休眠期，體內(nèi)的各種生命活動(dòng)，如：呼吸、蒸騰、芽的分化、根的吸收、養(yǎng)分合成和轉(zhuǎn)化等，都進(jìn)行得較微弱和緩慢，所以POD同工酶的表達(dá)也整體較弱。

2.2.3 枝皮中POD同工酶酶譜變化

從電泳圖譜(圖3)可見(jiàn)，6月至11月，枝皮中POD酶帶變化明顯，共顯現(xiàn)17條酶帶。B1、B3、B5、B9、B10、B11、B13這7條酶帶始終表達(dá)，為枝皮部的基本譜帶，其中B1、B3隨生長(zhǎng)期延長(zhǎng)，酶帶表達(dá)呈現(xiàn)由強(qiáng)漸弱的特點(diǎn)，B5、B9、B10、B11、B13 5條酶帶均表現(xiàn)了8月出現(xiàn)表達(dá)強(qiáng)度高峰隨后又下降的趨勢(shì)。8月胡桃楸營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖生長(zhǎng)都達(dá)到了高峰期，POD同工酶作為植物生長(zhǎng)期表達(dá)產(chǎn)生的一種重要的酶類(lèi)，也從一個(gè)側(cè)面體現(xiàn)出胡桃楸各階段的生長(zhǎng)發(fā)育特點(diǎn)。另外 A3、A5、A7、C2、C4 5條酶帶6到10月較穩(wěn)定表達(dá)，11月消失，可作為生長(zhǎng)期特征性表達(dá)酶帶。而A1、A2兩條酶帶從9至11月特異表達(dá)，11月也呈下降趨勢(shì)?？傮w上莖皮的同工酶表達(dá)也出現(xiàn)11月表達(dá)強(qiáng)度下降或酶帶消失的特點(diǎn)。

圖3 枝皮POD同工酶

2.2.4 樹(shù)枝中POD同工酶酶譜變化

圖4 樹(shù)枝POD同工酶

由電泳圖譜(圖4)可見(jiàn)，5月至9月，枝中僅顯現(xiàn)7條酶帶，變化較明顯。A4、B1兩條酶帶始終表達(dá)，為枝部的基本譜帶，且出現(xiàn)弱強(qiáng)弱的強(qiáng)度變化，均為6、7月表達(dá)強(qiáng)，A6、A8兩條酶帶5月不表達(dá)，B2酶帶9月不表達(dá)，B5酶帶5月、9月不表達(dá)，B7酶帶8月特異表達(dá)?？傮w上枝中的同工酶表達(dá)5月酶帶數(shù)量最少，其次是9月，而6、7、8月表達(dá)數(shù)量較多，活性較強(qiáng)。其表達(dá)特點(diǎn)與枝在這3個(gè)月中旺盛生長(zhǎng)表現(xiàn)出一致性。

2.2.5 葉中POD同工酶酶譜變化

由電泳圖譜(圖5)可見(jiàn)，5月至9月，葉中POD酶帶變化明顯，共顯現(xiàn)14條酶帶。A4、B1、B2、B5、C2 5條酶帶始終表達(dá)，為葉部的基本譜帶，大致出現(xiàn)先弱后強(qiáng)再弱的強(qiáng)度變化。 A2、A3兩條酶帶9月不表達(dá)，A8、C3、C4酶帶5月不表達(dá)，6月開(kāi)始出現(xiàn)并漸強(qiáng)，A6酶帶5月、9月不表達(dá)，C5、C7酶帶8、9月特異表達(dá)，C6酶帶7月出現(xiàn)并減弱?？傮w上葉中的同工酶表達(dá)5月酶帶數(shù)量最少，而6、7、9月表達(dá)數(shù)量較多，8月表達(dá)數(shù)量最多，活性7、8月表達(dá)較強(qiáng)?？梢?jiàn)POD同工酶在葉旺盛生長(zhǎng)階段表達(dá)種類(lèi)多，活性強(qiáng)，與枝的POD同工酶表達(dá)特點(diǎn)相似。

圖5 葉POD同工酶

2.3 不同器官酶譜疊加后的同工酶譜帶特征

同工酶的基因表達(dá)存在著時(shí)間和空間的差異，為了更加準(zhǔn)確地描述同工酶各酶帶的顯現(xiàn)情況，將每個(gè)月得到的各器官，根、莖皮、枝皮、枝、葉的酶譜疊加出一個(gè)總酶譜(疊加酶譜)，可以直接觀察到生長(zhǎng)期中每月各器官中顯現(xiàn)哪些酶帶及共有酶帶數(shù)(表1)。

5月POD同工酶4個(gè)器官共顯現(xiàn)20條酶帶，6月POD同工酶5個(gè)器官共顯現(xiàn)25條酶帶，7月POD同工酶5個(gè)器官共顯現(xiàn)27條酶帶，8月POD同工酶5個(gè)器官共顯現(xiàn)27條酶帶，9月POD同工酶5個(gè)器官共顯現(xiàn)26條酶帶，10月POD同工酶3個(gè)器官共顯現(xiàn)19條酶帶，11月POD同工酶3個(gè)器官共顯現(xiàn)19條酶帶，每個(gè)器官酶帶數(shù)及共有酶帶數(shù)見(jiàn)表1。

表1 不同生長(zhǎng)期各器官疊加酶帶特征

2.4 不同時(shí)期酶譜疊加后的同工酶譜帶特征

將根、莖皮、枝皮、枝、葉5個(gè)器官的7個(gè)月份酶譜疊加出一個(gè)總酶譜(疊加酶譜)，可以直接觀察到各器官中每條酶譜帶在生長(zhǎng)期中是否顯現(xiàn)以及顯色強(qiáng)度(以顯色最深時(shí)期為準(zhǔn))。根中5月至11月共顯現(xiàn)15條酶帶，莖皮中5月至11月共顯現(xiàn)18條酶帶，枝皮中6月至11月共顯現(xiàn)17條酶帶，枝中5月至9月共顯現(xiàn)7條酶帶，葉中5月至9月共顯現(xiàn)14條酶帶，各器官酶帶具體分布情況及顯色強(qiáng)度(表2)。

3 討論

3.1 胡桃楸器官POD同工酶表達(dá)具有發(fā)育階段性

通過(guò)胡桃楸根、莖皮、枝皮、枝、葉5個(gè)營(yíng)養(yǎng)器官POD同工酶的測(cè)定分析，可以看出POD同工酶變化因生長(zhǎng)時(shí)期的不同而不同，一方面，不同生長(zhǎng)時(shí)期基本酶帶有表達(dá)強(qiáng)弱的不同，生長(zhǎng)期呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)另一方面，特定時(shí)期某些酶帶特異表達(dá)或消失，反映了代謝活動(dòng)的不同。另外，從不同器官酶譜疊加后7個(gè)月的縱向比較，也可看出從萌芽期到落葉轉(zhuǎn)入休眠期，表達(dá)的POD酶種類(lèi)經(jīng)歷了由少增多再減少的周期性變化。可見(jiàn)POD可以作為一種重要酶類(lèi)反映胡桃楸不同生長(zhǎng)時(shí)期代謝活動(dòng)的不同[1,14]。

3.2 胡桃楸P(pán)OD酶帶的共有性和同工酶的器官特異性[14]

將根、莖皮、枝皮、枝、葉的不同月份的電泳圖譜疊加后可見(jiàn)既有共有酶帶、也有各自的特有酶帶(見(jiàn)表2)。5個(gè)器官電泳圖譜中均有B1帶，可能此酶帶與胡桃楸的共同特性有關(guān)，或者說(shuō)該酶帶可能是胡桃屬的特征性酶帶。從疊加圖譜中還可見(jiàn)到根中POD同工酶帶數(shù)為15條，莖皮中為18條，枝皮中為17條，枝中為7條，葉中為14條，不論從酶譜帶數(shù)目還是特有酶帶上來(lái)看，胡桃楸P(pán)OD同工酶表現(xiàn)出明顯器官特異性。

3.3 胡桃楸pod同工酶分析宜采用根、莖皮、枝皮

胡桃楸5個(gè)器官中根部、莖皮部、枝皮部pod同工酶的種類(lèi)多，活性強(qiáng)，酶帶清晰穩(wěn)定，故pod同工酶分析采用根、莖皮、枝皮部較合適。而枝中整個(gè)生長(zhǎng)期酶帶數(shù)較少(7條)，活性較低；葉中pod同工酶帶分離不清晰，故枝和葉不適合分析測(cè)定。

表2 各器官生長(zhǎng)期疊加酶帶特征

(其中+：有此酶帶；-：無(wú)此酶帶。)

(1級(jí)：特強(qiáng)帶；2級(jí)：強(qiáng)帶；3級(jí)：次強(qiáng)帶；4級(jí)：弱帶；5級(jí)：痕跡帶)

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