解淀粉芽孢桿菌及其作為益生菌的應(yīng)用

張 娟 楊彩梅 曹廣添 曾新福 劉金松

(1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州 310058;2.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，臨安 313000;3.浙江惠嘉生物科技有限公司，安吉 313307)

解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)為芽孢桿菌屬，是一種與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)親緣性很高的細(xì)菌，其在生長(zhǎng)過程中可以產(chǎn)生一系列能夠抑制真菌和細(xì)菌活性的代謝物。2007年公布的解淀粉芽孢桿菌FZB42的全基因組測(cè)序使得人們對(duì)這種具有多種次生代謝物生產(chǎn)能力的芽孢桿菌有了更深層次的認(rèn)識(shí)，促進(jìn)了解淀粉芽孢桿菌的生物利用。本文旨在就解淀粉芽孢桿菌的生理生化特性、抑菌物質(zhì)及其作為益生菌的應(yīng)用等方面進(jìn)行綜述。

1 解淀粉芽孢桿菌的生理生化特性

解淀粉芽孢桿菌可產(chǎn)生多種α－淀粉酶及蛋白酶，與枯草芽孢桿菌在形態(tài)、培養(yǎng)特征及生理生化特性方面非常相似;屬兼性厭氧菌，菌落在LB培養(yǎng)基上和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上呈淡黃色不透明菌落，表面粗糙，有隆起，邊緣不規(guī)則，在多種培養(yǎng)基上均不產(chǎn)色素;液體培養(yǎng)靜止時(shí)有菌膜形成;革蘭氏染色呈陽性，桿狀，可形成內(nèi)生芽孢，呈橢圓形，兩端鈍圓，芽孢囊不膨大，中生到次端生，有運(yùn)動(dòng)性;水解淀粉和明膠，乙酰甲基甲醇(V-P)試驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原試驗(yàn)陰性，苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基紅(MR)試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)均為陰性［1－3］。

研究表明，不同的解淀粉芽孢桿菌菌株對(duì)培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件要求不同，但是總體來說維持在一定的范圍內(nèi)，在基本培養(yǎng)基中能夠良好的生長(zhǎng)，其培養(yǎng)溫度一般為31～37℃，培養(yǎng)液pH為中性，180～200 r/min培養(yǎng)時(shí)間16～24 h為宜［4－6］。

2 解淀粉芽孢桿菌的抑菌物質(zhì)

自Johnson等［7］報(bào)道枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生抑菌物質(zhì)以來，國內(nèi)外學(xué)者先后從不同芽孢桿菌中分離得到多種抑菌物質(zhì)，包括多肽類、脂肽類及抑菌蛋白類等。解淀粉芽孢桿菌作為一種益生菌，在其生長(zhǎng)過程中可產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，為其在動(dòng)植物生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用提供了可能。

2.1 抑菌蛋白類

Wong等［8］從解淀粉芽孢桿菌 NK10中分離純化得到對(duì)多種病菌具有抑制活性的抑菌蛋白baciamin，分子質(zhì)量為50 ku，可以使病原真菌的膜通透性增加，降低人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，同時(shí)對(duì)肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌細(xì)胞具有抑制作用。Kim等［9］用30%的硫酸銨溶液純化，經(jīng) Centricon 10濃縮，二乙基氨基乙基(DE-AE)瓊脂糖(快速流柱)及Sephacryl S-100凝膠過濾層析得到純化的解淀粉芽孢桿菌MET0908產(chǎn)生的抗真菌蛋白，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對(duì)植物炭疽病具有防治作用，十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)測(cè)得其分子質(zhì)量為40 ku。其作用機(jī)理可能是此蛋白質(zhì)作用于炭疽病菌的細(xì)胞壁，進(jìn)而抑制其生長(zhǎng)。

2.2 脂肽類抗生素

Arrebola等［10］用甲醇提取及色譜分析法分析解淀粉芽孢桿菌PPCB004抑菌物質(zhì)的成分，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的主要抑菌物質(zhì)為伊枯草菌素A。Hiradate等［11］從桑葉中分離得到1株解淀粉芽孢桿菌RC-2，其細(xì)菌培養(yǎng)上清液對(duì)桑炭疽病具有預(yù)防作用，用高效液相色譜分析分離出7種抗真菌化合物，核磁共振譜(NMR)和快速原子轟擊質(zhì)譜(FABMS)方法分析其化學(xué)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)7種物質(zhì)均為伊枯草菌素，其中化合物7為一種新的伊枯草菌素，β－側(cè)鏈分子中具有—(CH2)10CH(CH3)CH2CH3基團(tuán)。Koumoutsi等［12］研究了解淀粉芽孢桿菌FZB42由基因引導(dǎo)、非核糖體合成的生物活性環(huán)脂肽的結(jié)構(gòu)與功能，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生抑菌效果的主要物質(zhì)為表面活性物質(zhì)(surfactin)、芬芥素(fengycin)及芽孢菌素D(bacillomycin D)，兩兩相互作用共同抑制病原真菌的生長(zhǎng)。Souto等［13］從解淀粉芽孢桿菌BNM122代謝產(chǎn)物中分離得到具有抗植物病原真菌如鐮孢菌、絲核菌的物質(zhì)，經(jīng)核磁共振氫譜(1H-NMR)和薄層色譜分析發(fā)現(xiàn)其中含有脂肽類物質(zhì)及伊枯草菌素類似物。

2.3 其他

2.3.1 大環(huán)內(nèi)酯類

楊橋等［3］分離得到1株解淀粉芽孢桿菌，對(duì)其產(chǎn)生的活性物質(zhì)經(jīng)分離純化及化學(xué)結(jié)構(gòu)解析，確定其主要成分為大環(huán)內(nèi)酯類抗生素家族(mcrolactin)的一個(gè)新成員，與該家族中最早發(fā)現(xiàn)的成員macrolactin A相比，其12位碳上的氫原子被第4個(gè)羥基取代，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑制效果。

2.3.2 寡肽酶

Chao等［14］報(bào)道了解淀粉芽孢桿菌23-7A產(chǎn)生的一種新型寡肽酶，其氨基酸序列與酶活性和細(xì)菌PepFs(金屬肽酶M3系列)類似。

2.3.3 肽類

王英國等［15］從堆肥中分離到1株對(duì)尖孢鐮刀菌等病原真菌具有強(qiáng)烈抗性的解淀粉芽孢桿菌菌株，將其發(fā)酵液分離純化得到一種抗真菌活性物質(zhì)，通過紅外和質(zhì)譜方法分析推測(cè)該物質(zhì)為肽類，分子質(zhì)量為1 498 u，具有很好的水溶性，并且含有甲硫氨酸。

2.3.4 聚酮化合物

Arguelles-Arias等［16］分析了解淀粉芽孢桿菌GA1基因組序列，發(fā)現(xiàn)開放閱讀框(ORFs)中的8個(gè)基因簇參與聚酮化合物的合成，與Chen等［17］發(fā)現(xiàn)的解淀粉芽孢桿菌FZB42有關(guān)合成聚酮化合物的基因mln、bae及dfn序列一致。

3 解淀粉芽孢桿菌作為益生菌的應(yīng)用現(xiàn)狀

3.1 解淀粉芽孢桿菌在抑制病原菌方面的應(yīng)用

近年來，不少學(xué)者從不同材料中分離鑒定出對(duì)其他致病菌具有拮抗效果的解淀粉芽孢桿菌。曹海鵬等［18］從養(yǎng)殖池污泥中分離篩選出1株解淀粉芽孢桿菌G1，對(duì)鱘源嗜水氣單胞菌S1具有抑菌效果。王選等［19］從健康青年牛的糞便中篩選出1株對(duì)痢疾病原菌有拮抗作用的解淀粉芽孢桿菌N-4。姜軍坡等［1］從健康牛的糞便中篩選出1株解淀粉芽孢桿菌BN-9，發(fā)現(xiàn)其對(duì)大腸桿菌有較強(qiáng)抑制效果。Aunpad 等［20］、Kaewklom 等［21］分別從不同食物和土壤中分離得到1株解淀粉芽孢桿菌SP-1-13LM，其產(chǎn)生的一種生物活性肽對(duì)金黃色葡萄球菌及單核細(xì)胞增生李斯特菌有抑制效果。

Sutyak等［22］從益生菌乳制品中分離得到1株解淀粉芽孢桿菌，其細(xì)胞的無菌上清液可以對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌、鏈球菌屬及腸道加德菌產(chǎn)生抑菌作用，而對(duì)腸道乳酸桿菌不產(chǎn)生作用。范會(huì)蘭等［23］的研究表明:解淀粉芽孢桿菌能夠抑制犢牛腹瀉病原菌大腸桿菌。時(shí)威等［24］研究了解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)冷卻肉的防腐保鮮效果，結(jié)果顯示，解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液組可將冷卻肉的保質(zhì)期延長(zhǎng)6～9 d，而且效果優(yōu)于Nisin，解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液對(duì)冷卻肉中主要污染菌假單胞菌和潛在致病菌單核細(xì)胞增生李斯特菌有較好的抑制效果。呂利群等［25］分離得到1株解淀粉芽孢桿菌Sh1，其對(duì)引起淡水魚最常見的真菌病——水霉病的水霉菌有較強(qiáng)抑制效果，動(dòng)物安全性試驗(yàn)表明，腹腔注射1×108CFU/mL的Shl對(duì)草魚的生長(zhǎng)沒有任何不良影響。Halimi等［26］研究表明，解淀粉芽孢桿菌GA1能夠產(chǎn)生一種新的細(xì)菌素amyloly-sin，對(duì)在真空包裝中低溫冷藏的食物中存在的單核細(xì)胞增生李斯特菌有抑制作用，試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)雞胸肉接種2×103CFU/g單核細(xì)胞增生李斯特菌，4℃儲(chǔ)存21 d，儲(chǔ)存期間對(duì)照組(不添加amylolysin)單核細(xì)胞增生李斯特菌呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，而添加amylolysin的試驗(yàn)組則受到抑制，最終為1.9 ×103CFU/g。Kaewklom 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌SP-1-13LM產(chǎn)物amysin(一種細(xì)菌素)對(duì)博洛尼亞香腸切片中存在的單核細(xì)胞增生李斯特菌有抑制效果，與只接種同劑量單核細(xì)胞增生李斯特菌組相比，同時(shí)接種解淀粉芽孢桿菌SP-1-13LM部分純化產(chǎn)物及濃度為2×103CFU/g的單核細(xì)胞增生李斯特菌組在接種7 d后顯著降低博洛尼亞香腸切片中單核細(xì)胞增生李斯特菌的活菌數(shù)。

3.2 解淀粉芽孢桿菌在環(huán)境保護(hù)方面的應(yīng)用

李超等［2］從滇池富營養(yǎng)化水體中分離得到1株解淀粉芽孢桿菌DC1，并探討了其對(duì)魚腥藻的抑藻效果及機(jī)理，發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌DC1菌體濃度越大，對(duì)魚腥藻的去除效果越明顯，其主要抑藻機(jī)理是通過分泌胞外物質(zhì)的間接方式起到溶藻作用，該物質(zhì)具有很強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，是非蛋白質(zhì)類物質(zhì)。譚文捷等［27］研究了解淀粉芽孢桿菌對(duì)水中丁草胺的降解效果，發(fā)現(xiàn)丁草胺初始質(zhì)量濃度越高，其降解速率和降解效率也越高，堿性條件下丁草胺的降解率明顯比酸性條件下高，腐殖酸對(duì)丁草胺的微生物降解有很大的促進(jìn)作用。高大響等［4］從雞糞中分離到1株解淀粉芽孢桿菌，具有除臭作用。

3.3 解淀粉芽孢桿菌在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用

李衛(wèi)芬等［28］探討了添加1×105CFU/g復(fù)合芽孢桿菌(枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌比例為1∶1)對(duì)草魚生長(zhǎng)、腸黏膜抗氧化功能及養(yǎng)殖水體水質(zhì)的影響，結(jié)果表明在飼料中添加芽孢桿菌可改善養(yǎng)殖水質(zhì)，增強(qiáng)消化酶活性、機(jī)體免疫和腸黏膜抗氧化功能，顯著促進(jìn)草魚生長(zhǎng)，并降低死亡率。孫笑非等［29］從新鮮豬糞中分離得到1株解淀粉芽孢桿菌，具有耐酸和豬膽汁的特點(diǎn)。沈濤等［30］研究表明:解淀粉芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌以1∶1比例混合飼喂草魚，可顯著提高草魚腸道內(nèi)容物胰蛋白酶活性和肝胰腺脂肪酶活性，顯著提高腸道芽孢桿菌數(shù)量，顯著降低弧菌和大腸桿菌數(shù)量。曹海鵬等［31］研究了水產(chǎn)養(yǎng)殖用解淀粉芽孢桿菌微膠囊的安全性，結(jié)果表明:解淀粉芽孢桿菌微膠囊實(shí)際無毒，對(duì)養(yǎng)殖水中氨氮、亞硝酸鹽氮、硫化物和pH等理化因子的影響均控制在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的安全濃度范圍內(nèi)，研究結(jié)果為解淀粉芽孢桿菌的安全應(yīng)用提供了重要的科學(xué)依據(jù)。沈勇濤［32］通過對(duì)妊娠及產(chǎn)后哺乳期母豬飼喂解淀粉芽孢桿菌，觀察其對(duì)母豬微生態(tài)的影響以及對(duì)初生仔豬微生態(tài)及其生長(zhǎng)性能和健康狀況的影響，結(jié)果表明:在妊娠母豬產(chǎn)前10天至仔豬斷奶期間在母豬飼糧中添加解淀粉芽孢桿菌1×107CFU/g可以改變母豬腸道微生態(tài)體系，通過母豬微生態(tài)的影響可以改變仔豬微生態(tài)體系并幫助初生仔豬建立其腸道微生態(tài)體系，同時(shí)可以顯著提高仔豬生長(zhǎng)性能，而且在母豬飼糧中添加解淀粉芽孢桿菌可以增加妊娠母豬短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，增加初生仔豬短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，而且仔豬年齡越小，效果越明顯。Mallo等［33］研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌CECT 5940孢子制劑添加到肉雞飼糧中可以降低產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌、鼠桿菌等致病菌的數(shù)量，增加飼糧中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪及淀粉的消化率。González-Ortiz等［34］研究了解淀粉芽孢桿菌CECT 5940和屎腸球菌CECT 4515(添加量均為0.5×108CFU/g)的混合劑對(duì)健康成年狗營養(yǎng)物質(zhì)消化率和糞便微生物數(shù)量變化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)飼喂益生菌制劑的試驗(yàn)組與飼喂基礎(chǔ)飼糧的對(duì)照組相比，消化率沒有顯著變化，但糞便中致病菌梭狀芽孢桿菌數(shù)量顯著降低。但Jerzsele等［35］的研究表明:解淀粉芽孢桿菌對(duì)人工感染產(chǎn)氣莢膜梭菌而引起的肉雞壞死性腸炎的治療無顯著效果，說明不同的解淀粉芽孢桿菌菌株抑菌能力和作用效果存在差異。

4 小結(jié)

目前，國內(nèi)外研究人員對(duì)關(guān)于從植物及土壤中分離鑒定得到不同解淀粉芽孢桿菌菌株的報(bào)道較多，并且進(jìn)一步分析研究了其代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)對(duì)多種植物病原真菌及細(xì)菌有較好的抑制效果;也有不少學(xué)者從動(dòng)物糞便及腸道中分離得到新的解淀粉芽孢桿菌，并將其作為益生菌添加劑添加到飼糧中用于動(dòng)物生產(chǎn)，有較好抑制致病菌的效果，提高動(dòng)物生產(chǎn)。解淀粉芽孢桿菌作為新的益生菌添加劑具有廣闊的應(yīng)用前景，有必要進(jìn)一步篩選出更適宜在飼糧中添加的新菌種，使其能作為益生菌在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用。另外目前關(guān)于其抑菌機(jī)理及促生長(zhǎng)等方面的報(bào)道并不多，因此還需要進(jìn)一步進(jìn)行深入研究，在分子及基因水平闡述作用機(jī)理。

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