動物腸黏膜上皮細胞與病原菌的鐵競爭機制

王進波 初佳麗 韓 菲 楊 靜 齊莉莉

(浙江大學寧波理工學院，寧波 315100)

鐵(Fe)是生命有機體的必需營養(yǎng)素，在能量代謝、DNA復制、氧的運輸、抗體生成、肝臟解毒及保護機體免受氧化應激等諸多生理過程中發(fā)揮著重要作用［1］。微生物也不例外，F(xiàn)e參與微生物的電子傳遞、糖酵解、DNA合成及對抗自由基損傷等諸多生理代謝過程，對微生物的正常生長、增殖具有重要意義［2］。從宿主體內(nèi)獲取生長、繁殖所必需的Fe，是病原菌侵染宿主的前提。因此，控制病原菌的Fe攝取在機體抵抗病原菌侵染中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

1 哺乳動物的Fe代謝

哺乳動物細胞攝取Fe的方式主要有3種［2］(圖1):1)細胞通過膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor，TFR)與血液中的轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合攝取Fe［3］;2)腸腔中游離的 Fe3+經(jīng)十二脂腸細胞色素b還原酶(duodenal cytochrome b reductase，DCYTB)還原成Fe2+后，通過小腸黏膜細胞刷狀緣上的二價金屬轉(zhuǎn)運載體1(divalent metal transporter 1，DMT1)轉(zhuǎn)入胞內(nèi);3)血紅素鐵(血紅蛋白或結(jié)合珠蛋白形式)可通過巨噬細胞膜上的血紅蛋白清道夫受體——分化抗原簇163(cluster of differentiation 163，CD163)進入胞內(nèi)。Fe進入胞內(nèi)后，有的進入線粒體，用以合成血紅素、鐵硫簇(Fe-S cluster)等，進而參與機體氧的轉(zhuǎn)運及電子傳遞等代謝過程;有的以鐵蛋白的形式存在于胞內(nèi);還有部分Fe經(jīng)轉(zhuǎn)運進入血液循環(huán)系統(tǒng)，參與機體多種生理機能。腸上皮細胞內(nèi)Fe的轉(zhuǎn)出主要由腸絨毛上皮細胞膜上的鐵轉(zhuǎn)運蛋白(ferroportin，F(xiàn)PN)完成，轉(zhuǎn)出的Fe2+在血漿銅藍蛋白或小腸細胞膜鐵轉(zhuǎn)運輔助蛋白作用下成為Fe3+。此過程受肝臟分泌的鐵調(diào)激素調(diào)控，當體內(nèi)Fe濃度增高時，鐵調(diào)激素表達量增加，誘導FPN降解，抑制胞內(nèi)Fe轉(zhuǎn)出，同時抑制Fe吸收;當體內(nèi)Fe濃度低時，鐵調(diào)激素表達量減少，F(xiàn)PN將胞內(nèi)Fe轉(zhuǎn)出進入循環(huán)系統(tǒng)，同時增加腸黏膜Fe的吸收率［4］。

2 病原菌的Fe攝取

Fe在微生物的生長、繁殖、代謝過程中具有很重要的作用。研究指出，病原菌在Fe濃度極低的環(huán)境中亦能正常生長，并感染宿主。這是由于這些病原菌具有高效的Fe攝取機制，能夠從周圍環(huán)境中攝取 Fe，滿足自身需要［5-6］。目前已知的3種病原菌Fe攝取機制為:嗜鐵素系統(tǒng)、血紅素獲取系統(tǒng)和轉(zhuǎn)鐵蛋白/乳鐵蛋白受體［1］(圖2)。嗜鐵素與Fe的結(jié)合常數(shù)超過1050，使細菌能夠高效獲取環(huán)境中的Fe。負載Fe的嗜鐵素能與細菌表面的受體共價結(jié)合，將Fe-嗜鐵素復合物攝入細胞內(nèi)，然后再釋放出游離Fe作為細菌的營養(yǎng)物質(zhì)。血紅素獲取系統(tǒng)主要通過細菌表面的血紅素結(jié)合蛋白受體，從血紅蛋白中獲取血紅素，轉(zhuǎn)運進入細菌胞內(nèi)，然后在血紅素氧化酶或逆鐵螯合酶的作用下，將Fe從血紅素上解離下來。有些細菌具有轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白受體，可以直接識別宿主轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白，從宿主細胞中獲取Fe［6-7］。

圖1 宿主的Fe代謝Fig.1 Iron metabolism in the host［2］

3 宿主與病原菌間的Fe競爭

正常生理條件下，哺乳動物體內(nèi)游離Fe的濃度很低，使體內(nèi)細菌處于Fe饑餓狀態(tài)，從而抑制其生長、繁殖，防止感染的發(fā)生，這是機體對抗病原菌侵染的第1道防線［8］。為了從宿主體內(nèi)獲取生長、繁殖、代謝所需要的Fe，細菌進化出了高效的Fe攝取系統(tǒng)。對此，動物機體也有一些競爭機制，限制細菌對Fe的攝取，從而抑制細菌(尤其是病原菌)的增殖。因此，宿主與病原菌之間Fe的競爭是機體對抗病原菌侵染的重要方式，對機體健康具有重要意義。

動物機體參與Fe競爭的蛋白因子有多種，二價金屬轉(zhuǎn)運載體、細胞色素b、遺傳性血色病蛋白、鐵調(diào)節(jié)蛋白、鐵蛋白、FPN等參與機體Fe平衡代謝的蛋白因子均參與Fe競爭。感染發(fā)生時，機體會上調(diào)Fe攝入相關(guān)蛋白的表達，下調(diào)FPN等Fe轉(zhuǎn)出相關(guān)蛋白的表達，將體內(nèi)Fe大量轉(zhuǎn)入胞內(nèi)，與鐵蛋白形成復合物貯存起來，降低細胞外液中Fe的濃度，抑制病原菌攝取Fe，從而抑制感染的發(fā)生。

脂質(zhì)運載蛋白2(lipocalin-2，Lcn-2)是研究較為廣泛的一種參與Fe競爭的蛋白因子，該蛋白因子又稱噬鐵蛋白、NGAL、24p3等。Flo等［9］運用基因芯片篩選技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)小鼠Lcn-2可與負載Fe的大腸桿菌嗜鐵素結(jié)合，抑制大腸桿菌對Fe的攝取，從而發(fā)揮抗菌作用。Saiga等［10］利用 Lcn-2基因缺陷型小鼠研究發(fā)現(xiàn)，病原菌感染后，機體通過Toll樣受體信號通路激活Lcn-2表達，抑制胞內(nèi)Fe的釋放，防止結(jié)核分枝桿菌對肺泡上皮細胞的感染。Bellmann-Weiler等［11］研究發(fā)現(xiàn)，Lcn-2能夠顯著抑制硫酸鐵(FeSO4)刺激的小鼠胞內(nèi)肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae)增殖，這也說明了Lcn-2可能通過抑制病原菌攝取Fe的方式來發(fā)揮抑菌作用;該研究還發(fā)現(xiàn)白細胞介素-10也可以促進胞內(nèi)鐵蛋白的合成，降低Fe的釋放，進而發(fā)揮抑菌作用。Lcn-2亦在宿主對抗寄生蟲感染過程中發(fā)揮重要作用。Garénaux等［12］對禽致病性大腸桿菌的研究證明，雞Lcn-2同源蛋白Ex-FABP能顯著抑制大腸桿菌Fe的攝取，提示Ex-FABP是雞體內(nèi)重要的Fe競爭蛋白，該蛋白通過與致病菌競爭 Fe，抑制病原菌的生長與增殖。Sazawal等［13］和 Zhao 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e 能刺激瘧原蟲的增殖，加快感染周期。在瘧原蟲感染初期，Lcn-2會抑制腸、肝、脾等的貯存Fe向血液中釋放，從而抑制瘧原蟲的生長與增殖;同時，Lcn-2還會刺激單核細胞和巨噬細胞分裂，激活機體天然免疫系統(tǒng)，發(fā)揮抗寄生蟲作用。Devireddy等［15］研究發(fā)現(xiàn)，小鼠Lcn-2自身并無Fe結(jié)合能力，只有與嗜鐵素結(jié)合后才能與Fe結(jié)合;而哺乳動物細胞自身也能產(chǎn)生類似細菌嗜鐵素的成分，幫助細胞結(jié)合環(huán)境中的Fe。

圖2 病原菌的Fe攝取機制Fig.2 Iron uptake mechanism of bacterial pathogens［1］

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，鐵調(diào)激素也在機體與病原菌的Fe競爭中發(fā)揮重要作用。綠膿桿菌、鏈球菌和伯氏疏螺旋體等病原菌均能刺激動物肝臟、脾臟產(chǎn)生分泌鐵調(diào)激素，該激素進一步誘導腸黏膜細胞、肝細胞、脾細胞FPN降解，顯著降低釋放入血的Fe總量;鐵調(diào)激素還會抑制腸黏膜Fe的吸收，從而抑制侵染進入血液、內(nèi)臟器官的病原菌攝取 Fe［16-17］。Wang 等［18］和 Portugal等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在瘧原蟲感染過程中，肝臟鐵調(diào)激素的表達量顯著上升，血清Fe水平顯著下降，從而抑制血液中瘧原蟲的生長繁殖，這對機體對抗瘧疾發(fā)揮重要作用。機體Fe代謝因子在免疫應答反應中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，Hfe基因缺陷型小鼠的鐵調(diào)激素水平顯著下降，導致巨噬細胞FPN的表達量顯著上升，這會引起腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6等因子的水平顯著下降，從而導致胞內(nèi)傷寒沙門氏菌的數(shù)量顯著增加［20-21］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e代謝主要影響Toll樣受體4(Tolllike receptor 4，TLR4)介導的細胞免疫反應［22］。

大多數(shù)微生物通過高效的Fe攝取系統(tǒng)，從Fe濃度極低的宿主體內(nèi)獲取足夠的Fe，滿足自身生長、繁殖、代謝等的需要。嗜鐵素在細菌Fe競爭中的作用極其重要［7-8］。大腸桿菌嗜鐵素與Fe的解離常數(shù)(Kd)為10-49，而轉(zhuǎn)鐵蛋白與Fe的 Kd則為10-20，嗜鐵素螯合Fe的能力遠強于哺乳動物的轉(zhuǎn)鐵蛋白。宿主肝臟細胞產(chǎn)生的Lcn-2能夠與嗜鐵素競爭Fe，阻礙細菌攝取Fe［23］。為了逃避宿主Lcn-2的競爭，有些細菌的嗜鐵素發(fā)生糖基化修飾或分子線性化，改變分子構(gòu)象，避免被Lcn-2識別、結(jié)合，但其Fe螯合能力并未減弱［8］。此外，細菌還通過Fe2+轉(zhuǎn)運蛋白AB(ferrous iron transport AB，F(xiàn)eoAB)、ATP 結(jié)合盒(ATP-binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運蛋白、乳鐵蛋白/轉(zhuǎn)鐵蛋白/血紅素鐵轉(zhuǎn)運系統(tǒng)等競爭性攝取內(nèi)環(huán)境中的Fe，維持自身需要［7，24］。細菌具有極為精細的 Fe感知系統(tǒng)，通過鐵吸收調(diào)節(jié)因子(ferric uptake regulator，F(xiàn)ur)參與細菌Fe代謝相關(guān)基因的表達調(diào)控。當Fe含量豐富時，F(xiàn)ur會結(jié)合到鐵調(diào)節(jié)相關(guān)基因的上游，抑制這些基因的表達;而當Fe缺乏時，F(xiàn)ur對鐵調(diào)節(jié)相關(guān)基因的阻遏作用解除，鐵調(diào)節(jié)相關(guān)基因開始表達，幫助細菌攝取Fe，這一機制在細菌Fe競爭中具有重要作用［1］。Fur還可通過ryhB RNA的反義作用，調(diào)節(jié)細菌利用Fe相關(guān)基因的表達［25］。

4 Fe對腸道微生物的影響

動物腸道中生存的大量微生物多數(shù)是益生菌，在營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、免疫機能調(diào)節(jié)以及防止病原微生物感染等過程中發(fā)揮著重要作用［26-27］;同時，動物腸道中也存在少量的致病菌或條件性致病菌，在正常生理狀況下，它們不會引起感染性疾病，但在腸道應激、機體免疫機能降低、飼糧改變等條件下會引起感染。許多研究表明，飼糧Fe水平對腸道微生物組成和腸道健康有顯著影響，對幼齡動物的影響尤為明顯［13］。Sazawal等［13］臨床調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，口服Fe會導致腸道感染幾率顯著增加，這是由于高濃度未被吸收的Fe會引起結(jié)腸菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導致致病菌數(shù)量顯著增加，從而誘發(fā)感染。Werner等［28］分別以不同F(xiàn)e水平的飼糧飼喂小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低Fe飼糧(或無Fe飼糧)使鼠腸道益生菌數(shù)量增加，而致病菌的數(shù)量顯著下降。腹瀉是全球范圍內(nèi)兒童最為重要的腸道疾病，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)和美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health，NIH)均已就Fe對腸道感染的影響開展相關(guān)研究，為兒童合理補 Fe提供科學依據(jù)［29］。Zimmermann等［30］研究指出，預防性補 Fe會導致兒童腸道病原菌(如沙門氏菌)數(shù)量增加，誘發(fā)腸道疾病。Buhnik-Rosenblau等［31］利用 Irp2和 Hfe基因缺陷型小鼠進行研究，發(fā)現(xiàn)Fe吸收代謝相關(guān)基因缺陷會導致小鼠腸道微生物區(qū)系發(fā)生顯著變化，進一步證明了宿主Fe吸收代謝與腸道菌群之間的關(guān)系。

飼糧Fe影響腸道微生物的機制尚不清楚。某些益生菌［如植物乳桿菌(L.plantarum)］的生長繁殖并不嚴格依賴Fe，在缺Fe或低Fe環(huán)境中仍能較好生長繁殖，而致病菌幾乎都要依賴Fe才能大量繁殖［32］。多數(shù)益生菌與致病菌一樣，需通過攝取環(huán)境中的Fe以滿足自身需要。Valdebenito等［33］研究發(fā)現(xiàn)，與致病性大腸桿菌類似，益生菌Nissle 1917株也產(chǎn)生系列嗜鐵素，獲取宿主腸道中的Fe，但其不具有致病菌的毒力因子，不會致病。Fe攝取代謝系統(tǒng)與致病菌的毒力密切相關(guān)。沙門氏菌Fur與Fe結(jié)合后，能夠激活HilD(hyperinvasive locus D)蛋白的表達，HilD進而激活其毒力相關(guān)蛋白沙門菌毒力島1(Salmonella pathogenicity island 1，SPI1)的表達，通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)增加細菌毒力，侵染宿主細胞［34-35］。

5 小結(jié)

貧血與腹瀉是影響仔豬健康的兩大重要疾病，而且這2種疾病經(jīng)常同時發(fā)生，對養(yǎng)豬生產(chǎn)的危害極大。為預防仔豬貧血，生產(chǎn)中常通過注射Fe或飼糧添加Fe的方式給仔豬補Fe，然而，不合理地補Fe可能導致仔豬腸道菌群改變，弱化仔豬Fe競爭機制，從而導致病原菌感染發(fā)生。因此，本文針對Fe對仔豬腸道菌群組成的影響、宿主細胞與細菌的Fe競爭機制、益生菌與致病菌在Fe攝取過程中的異同點等問題進行研究，為仔豬生產(chǎn)中合理補Fe提供科學依據(jù)。

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