豬博卡病毒研究概述

周宏專

（1.北京市農林科學院畜牧獸醫(yī)研究所 畜禽疫病防控技術北京市重點實驗室，北京100097；2.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所礦物元素營養(yǎng)研究室，北京100193）

自2011年以來，國內很多豬場陸續(xù)暴發(fā)了腹瀉性疾病，主要集中在產房哺乳仔豬，據有些發(fā)病豬場反映，哺乳仔豬病死率在70%以上，抗生素治療和腹瀉性疫苗免疫接種均未取得好的效果，疑似為新的傳染性疾病；與此同時科研人員從腹瀉仔豬的糞便中檢測出一種新的病原—豬博卡病毒［1］。從分類上看，豬博卡病毒（Porcine bocavirus，PBoV）為細小病毒科、細小病毒亞科、博卡病毒屬的成員，該屬中還包括牛細小病毒（Bovine parvovirus，BPV）、犬細小病毒（Canine minute virus，MVC）、人博卡病毒（Human bocavirus，HBoV）等［2］。雖然此次國內哺乳仔豬腹瀉的流行與PBoV是否有直接關系仍有待探討，但其已經引起了極大的關注。由于PBoV的發(fā)現相對較晚，很多研究處于起步階段，因此對該病原的全面認識將為下一步深入研究奠定基礎。鑒于此，本文對PBoV國內外最新研究進展做一概述。

1 PBoV的發(fā)現

2009年，Blomstrom A L等［3］利用隨機多重置換擴增方法（random multiple displacement amplification，MDA）在患仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的豬淋巴結中擴增出了一段長1 879bp（FJ872544）的核苷酸序列，該段序列與已知病毒序列比較，發(fā)現其完整的NP1基因及部分VP1/VP2基因與人類博卡病毒相近，故將該病毒定名為豬博卡病毒（PBoV）。

2 基因組結構特征

PBoV為無囊膜單股線狀DNA病毒，除具有細小病毒科其他成員同有的2個開放閱讀框ORF1和ORF2外，其還有第3個博卡病毒特征性的開放閱讀框ORF3［4］。ORF1編碼病毒基因復制相關的非結構性蛋白NS1；ORF2編碼2個結構蛋白，分別為衣殼蛋白VP1和VP2，其中VP1和VP2編碼區(qū)重疊；ORF3編碼高度磷酸化的非結構性蛋白NP1，其功能尚不清楚［2］。

截至2014年1月，GenBank中有完整PBoV基因組序列26條，接近完整的基因組序列3條，此外還有獨立報道的NS1完整編碼基因4條，NP完整編碼基因12條，VP1/2完整編碼基因2條。序列分析顯示，PBoV基因組大小介于4 689bp～5 292bp之間，其中NS1編碼基因介于1 731bp～2 412bp之間，NP編碼基因介于657bp～693bp之間，VP1編碼基因介于1 863bp～2 130bp之間，VP2編碼基因介于1 635bp～1 716bp之間。

3 病毒分型

研究人員起初按照病毒發(fā)現時間的先后順序，結合國際病毒分類委員會（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV http：//www.ictvdb.org/）的分類標準，當NS1基因的核苷酸同源性低于95%時，即判為不同的基因型［2，5］。隨著研究的不斷深入，新的病毒序列不斷被發(fā)現，研究人員對現有的序列進行梳理，通過對基因組序列，NS1/VP1/NP1基因序列遺傳進化分析發(fā)現，豬博卡病毒屬總能出現明顯的3個聚簇，根據發(fā)現的先后順序，研究人員將這些聚簇定為3個型，即PBoV1、PBoV2和 PBoV3［6-7］。

3.1 PBoV1型

最初在瑞士發(fā)現的PBoV-like（FJ872544，1 879bp）可以作為該型的代表序列［3］，在中國發(fā)現的 PBoV-SX （HQ223038）［8］、PBoV1-H18（HQ291308）［9］及 隨 后 在 烏 干 達 發(fā) 現 的 Buk8-1（JX854557）也屬于該型［10］。

3.2 PBoV2型

從中國健康豬糞便中獲得的PBoV1-ZJD（HM053693）和PBoV2-ZJD （HM053694）可以作為該型的代表序列［5］，兩者NS1基因的核苷酸同源性為94.2%。在中國發(fā)現的 PBoV2-A6（HQ291309）也屬于該型，而其與 HM053693及HM053694NS1基因的核苷酸同源性分別為93.2%～94.2%，但研究者仍建議將三者歸于同一型［6，9］。

3.3 PBoV3型

該型是最大的一個聚簇，該簇中包括從北愛爾蘭、美國及中國獲得的多個序列。3型序列間差異較大，同源性在76%～87.9%。研究人員建議按照VP1序列的特點將其分為A、B、C、D和E共5個亞簇［6，9］，認為 PBoV3-SH20F （JF429834）［11］、PBoV4-1-SH17 （ JF429835 ）［11］、 PBoV4-F41（JF512473）［12］、PBoV3C （JN681175）［6］及 PBoV5（JN831651）［13］可以分別作為 PBoV3A、PBoV3B、PBoV3C、PBoV3D 和 PBoV3E 的 代 表 序 列［7］。按照此劃分，屬于PBoV3A型的還有PBoV4-2-SH17 N-2 （JF429836）［11］、PBoV3-64-1 （JF512472）［12］及swBoV CH437（KF360033）［14］；屬于 PBoV3B型的還 有 PBoV3-22/3 （JF713714/5）［9］及 PBoV4-1（JF429835.1）［11］；而 PBoV5 （JN621325） 屬 于PBoV3E型［7］。然而，在具體劃分時，利用全基因組序列，NS1、VP1或NP1序列分別劃分所得到的亞簇結果可能不一致，這可能是由病毒在形成過程中的序列交叉重組所造成［11］；另外，有些序列不全，在分型時也不能準確歸類，如PBoV-6V和7V，缺少NS1和NP1基因序列［5］。這些情況易造成新出現的博卡病毒命名混亂，因此命名時應該慎重并綜合考慮［7］。

4 流行現狀

瑞典學者Blomstrom A L等［3］采用PCR技術對34頭PMWS病豬和24頭健康豬進行了PBoV檢測，結果在PMWS病豬中PBoV陽性率為88%，而健康豬群陽性率為46%，說明PBoV可能在PMWS致病作用中參與了共感染。隨后，Cadar D等［15］于2006年-2007年和2010年-2011年采集了842頭份野豬樣品，經PCR檢測共檢出PBoV陽性109份，陽性率為12.94%，其中2006年-2007年陽性率為9.14%，而2010年-2011年陽性率為17.74%，顯示出上升趨勢。McKillen J等［12］對369份豬血清樣品進行檢測，PBoV3（JF512472，PBoV3A型）和PBoV4（JF512473，PBoV3C型）的陽性率分別為8.7%和9.5%，且發(fā)現的序列與傳統(tǒng)序列不同。Jiang Y H等［16］對美國385份病豬的肺臟、淋巴結、血清和糞便樣品進行檢測其檢測率為21.3%～50.8%，主要為PBoV1型及PBoV3A/3B/3C型，并發(fā)現同一樣品中會含有多種基因型的PBoV。目前，PBoV除在歐洲、亞洲和美國能檢測到之外，在非洲的烏干達和喀麥隆也能檢測到豬博卡病毒序列［10，17］。

國內浙江、江西、安徽、河北、河南、江蘇、北京、上海、新疆、山東、貴州、福建、廣西、甘肅、湖北及湖南等多省市都開展了博卡病毒的相關檢測工作。從檢測的結果來看，有以下特點：①患病豬群的陽性率高于健康豬群。如Zhai S等［18］對2009年送檢的191份疑似豬高熱病病料的檢測，結果檢出PBoV（PBoV1型）陽性75份，陽性率為39.3%，表現呼吸道病癥的斷奶豬PBoV陽性率達69.7%，而其它豬群中陽性率為0%～13.6%。Li B等［19］對258份豬樣品的檢測，顯示總陽性率為44.2%，且發(fā)病豬群的PBoV陽性率56.1%明顯要高于健康豬群的陽性率16.7%。②國內PBoV序列種類多。如Zhang H B等［20］于2010年收集了中國10個省份的166份樣品進行PBoV分型檢測，結果PBoV1-4型的檢測率分別為28.9%、6.6%、19.3%和39.7%，表明檢測的4種基因型（PBoV2型及6V/7V未歸類型）在我國都有發(fā)生。③不同地區(qū)檢測的結果差異較大。如Lau S K等［11］從香港生豬屠宰場和養(yǎng)豬場的健康豬和病死豬中采集了333份樣品，用PCR技術檢出PBoV陽性55份，總陽性率為16.5%。Zeng S等［8］對來自湖北省的120份臨床健康豬進行檢測，結果顯示PBoV1陽性率約為40%。Shan T等［9］對來自上海市、江蘇省、安徽省、山東省和貴州省的豬糞便樣品檢測，其陽性率高達63.2%。胡軍勇等［21］對湖北、湖南、河南省的79個規(guī)?；i場采集的248份病料樣品中有172份樣品為PBoV陽性。Zhang Q等［22］年對985份腹瀉樣品檢測時其陽性率達31.2%，且混合感染嚴重。④某些檢測陽性率高于傳統(tǒng)腹瀉病毒。如焦洋等［23］對60份臨床樣品進行檢測，顯示PBoV 陽性率為21.7%，明顯高于TEGV 和PEDV的陽性率（1.6%/6.7%）。

5 博卡病毒的檢測方法

5.1 PCR檢測法

作為實驗室常用的分子水平檢測方法之一，目前已有多篇關于PBoV檢測的研究報道，設計的引物也針對不同基因。Zhai S等［18］首先根據報道的FJ872544（PBoV1型）序列，針對VP1/2編碼區(qū)設計了一對擴增片段大小為496bp引物用于PBoV1型的檢測；隨后，Zhang H B等［20］根據不同序列特點，針 對 PBoV1（HM053693，PBoV2 型）、PBoV2（HM053694，PBoV2型）、6V（HM053672，序列不全未歸類）及7V（HM053673，序列不全未歸類）分別設計引物，擴增產物分別為430、428、517、527bp；胡軍勇等［21］根據報道的HM053693及HM053694序列，針對NS1編碼區(qū)設計了1對擴增片段大小為482bp的簡并引物用于PBoV2型相關樣品的檢測。為了獲得更多的博卡病毒新序列，Lau S K等［11］在對HBoV、BPV及MVC的NS1編碼基因比對分析的基礎上，設計了簡并引物，其擴增產物長度為144bp，結合來自于VP1編碼基因的特異性引物對用于博卡病毒的檢測。隨著研究的深入，博卡病毒的基因型越來越多，準確對其檢測也成了一個難題，因此，蔡雨函等［24］分別設計出擴增 PBoV1/PBoV2（擴增產物418bp，PBoV2型）及 PBoV3/PBoV4/PBoV5（擴增產物215bp，PBoV3型）的簡并引物，并通過對兩組引物的比例、退火溫度等條件的優(yōu)化，首次建立了同時檢測PBoV1/PBoV2和PBoV3/PBoV4/PBoV5的雙重PCR方法。除此之外，焦洋等［23］還建立了 TGEV、PEDV和PBoV多重PCR檢測方法。

5.2 實時熒光定量PCR檢測法

Li B 等［19］根 據 GU902967-GU902971、HQ223038及FJ872544的NP1序列（PBoV1型）保守區(qū)設計引物和Taq Man探針建立了實時熒光定量PCR檢測方法，其敏感性、重復性和特異性較好。鄧波等［25］則根據報道的 FJ872544（PBoV1型）序列，通過VP1/2基因設計引物和Taq Man探針建立了實時熒光定量PCR檢測方法，具有很好的靈敏性和特異性。

5.3 LAMP檢測法

Li B等［26］報道以 VP1/2基因序列（PBoV1型）為基礎，建立了一種PBoV的環(huán)介導等溫擴增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）技術檢測方法，所建立的方法高度特異，與PRRSV、PCV2、PPV和CSFV無交叉反應，最低可檢測10個拷貝，敏感性是傳統(tǒng)PCR方法的100倍。

5.4 ELISA 檢測法

McNair I等［27］報道用細胞培養(yǎng)分離的PBoV制備單克隆抗體，并選取了其中的2株IgG2a亞型單抗建立了檢測抗原的ELISA方法。作者指出，所制備的單克隆抗體非常特異，選取的PBoV3（JF512472，PBoV3A 型）mAb不 能 用 來 檢 測PBoV4（JF512473，PBoV3C型），反之亦然。

6 其他相關研究

李彬等［28-29］分別對PBoV的NP1基因和VP2基因進行了原核克隆表達，為研究相關蛋白的功能及建立相應的血清學診斷方法奠定了基礎。楊晚竹等［30］利用半套式PCR方法在健康豬糞便標本中篩查出2株PBoV環(huán)狀附加體PBoV-G2-episome和PBoV-G3-episome。通過測序和拼接得到其末端非編碼區(qū)序列（405nt和511nt）。經過分析及二級結構預測，發(fā)現PBoV-G2-episome與人博卡病毒3附加體（HBoV3-episome）結構相似，而PBoV-G3-episome與博卡病毒屬其他成員的末端二級結構存在較大差別。該研究表明某些博卡病毒與其他細小病毒的復制方式存在一定差異，也為今后博卡病毒感染性克隆的構建提供了一個思路。

總之，隨著研究的不斷深入，對PBoV在病原學，流行病學及診斷方法方面的認識逐漸加深。然而對于病毒體外培養(yǎng)體系的建立，目前僅有1篇相關報道［12］。此外，PBoV的基因型分型、感染性克隆研究、致病機理及動物模型的建立等方面的研究薄弱，這也將會是今后研究的重點方向。作為同為博卡病毒屬的HBoV，研究者已開展了相關蛋白自身結構［31］及其在病毒復制［32］、細胞阻滯及凋亡［33-34］、調節(jié)宿主免疫實現免疫逃逸［35-37］和病毒對于其他病毒免疫應答系統(tǒng)的調節(jié)作用［38］等方面的基礎研究，這些研究也可為進一步探索PBoV的感染致病機制及免疫防控提供借鑒。

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