六種動(dòng)物蟲媒病病原檢測(cè)方法研究進(jìn)展

王 晶，王慧煜，賈廣樂，胡永婷，韓雪清＊

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京100029；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西太谷030800）

蟲媒病是指通過吸血昆蟲叮咬敏感的脊椎動(dòng)物而在人、畜間傳播的一類疾病。國(guó)際上已發(fā)現(xiàn)537種，其中140余種可引起人、畜疾病，表現(xiàn)為發(fā)熱、皮疹、關(guān)節(jié)痛、出血熱甚至病毒性腦炎等。在歷史上曾使成千上萬的人、畜患病或死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著全球氣候的變化，現(xiàn)代化的交通工具使國(guó)際間的貿(mào)易、旅游交往日益頻繁，為蟲媒病的遠(yuǎn)距離傳播和流行提供了更廣泛的可能性。蟲媒與蟲媒性動(dòng)物疫病的防控直接關(guān)系到我國(guó)人民身體健康、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生態(tài)環(huán)境及社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展。蚊、蜱、蠓等蟲媒通過飛機(jī)、輪船、陸地等邊境口岸傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)非常高，蟲媒傳播的疫情也有可能隨蟲媒傳入我國(guó)。其中最有代表性的，即非洲豬瘟（African swine fever，ASF）、西尼羅熱（West Nile fever）、水皰性口炎（Vesicular stomatitis，VS）、藍(lán)舌?。˙lue tongue disease）、萊姆?。↙yme disease）和鹿流行性出血病（Epizootic hemorrhagic disease of deer，EHD），這些動(dòng)物疫病近年來在周邊國(guó)家的暴發(fā)流行已對(duì)我國(guó)形成威脅。因此，非常有必要開展蟲媒性動(dòng)物疫病病原檢測(cè)方法的研究。

隨著分子診斷技術(shù)的不斷發(fā)展，一些分子檢測(cè)方法如普通PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、多重PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)等相繼應(yīng)用到動(dòng)物蟲媒病分子生物學(xué)檢測(cè)中。特別是在20世紀(jì)80年代隨著生物芯片技術(shù)的問世，人們對(duì)有效、快速、高通量的檢測(cè)方法展開了大量的研究。蟲媒基因芯片檢測(cè)技術(shù)在多基因、微量化等診斷方面顯示出了其較大的優(yōu)勢(shì)，為多種生物樣本在同一平臺(tái)上進(jìn)行快速檢測(cè)與鑒定提供了很好的技術(shù)支撐。

本文就近年在動(dòng)物蟲媒病的病原學(xué)、分子生物學(xué)檢測(cè)方法以及基因芯片技術(shù)等方面的最新研究進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要回顧，為進(jìn)一步建立不同蟲媒攜帶多種病原的高通量生物芯片篩查方法，并為我國(guó)邊境口岸建立有效、快速的動(dòng)物蟲媒病分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)，提高我國(guó)在防范蟲媒性外來動(dòng)物疫病跨境傳播的綜合防控能力，有力保障我國(guó)畜牧業(yè)與衛(wèi)生、社會(huì)、經(jīng)濟(jì)的健康發(fā)展提供參考。

1 蟲媒病病原檢測(cè)方法

1.1 西尼羅熱

1.1.1 病原學(xué) 西尼羅熱是由西尼羅病毒（West Nile virus，WNV）引起，主要由庫(kù)蚊作為媒介進(jìn)行傳播的一種疾病。西尼羅病毒為單股正鏈RNA，屬黃病毒科黃病毒屬。該病毒因于1937年從烏干達(dá)的西尼羅地區(qū)一位發(fā)熱婦女的血液中首次分離到而得名。病毒核酸編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白，3種結(jié)構(gòu)蛋白分別是病毒殼蛋白C、包膜蛋白（E）和前膜蛋白（prM）。E蛋白參與病毒與宿主細(xì)胞親和、吸附及細(xì)胞融合過程，是病毒親嗜性及毒力的主要決定蛋白。

1.1.2 分子診斷檢測(cè)技術(shù) 陳曉等［1］針對(duì)E基因設(shè)計(jì)了一組引物及探針，建立了一步法實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)西尼羅病毒的方法。該方法對(duì)乙型腦炎病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒和博爾納病毒的檢測(cè)結(jié)果為陰性，特異性好，其最低檢出濃度為3.6×102拷貝/μL，具有較高敏感性。唐泰山等［2］以E基因和3′UTR非編碼區(qū)，建立的 WNYC和 WNYA Taq Man探針的實(shí)時(shí)定量PCR法，具有高的敏感性和特異性，可以作為檢測(cè)西尼羅病毒的技術(shù)儲(chǔ)備。綜合上述研究，E基因可作為設(shè)計(jì)引物和探針的靶基因，因?yàn)槟夷さ鞍祝‥）的結(jié)構(gòu)域上含有WNV特異性抗原表位［3］，可以將 WNV與相關(guān)的黃病毒進(jìn)行鑒別。

1.2 水皰性口炎

1.2.1 病原學(xué) 水皰性口炎是由水皰性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）所引起的人畜共患高度接觸性傳染的病毒性疾病。其主要的傳播媒介是蚊媒，該病毒屬于彈狀病毒科水皰病毒屬，分為2種血清型，即印第安型（IND）和新澤西型（NJ）。VSV為單股負(fù)鏈RNA病毒，共編碼5種主要病毒蛋白，即糖蛋白（G）、基質(zhì)蛋白（M）、核蛋白（N）、磷酸蛋白（NS）及病毒RNA聚合酶（L）。其中N蛋白具高度保守性，呈現(xiàn)群特異性，為所有型的VSV所共有，誘導(dǎo)產(chǎn)生非中和抗體，與其他彈狀病毒無任何交叉反應(yīng)，它在病毒RNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著核心作用。

1.2.2 分子診斷檢測(cè)技術(shù) 祁會(huì)彩等建立了一種能同時(shí)檢測(cè)豬VSV等3種病原體的多重RT-PCR方法。該法以VSV的N基因保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，待PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化后，結(jié)果同時(shí)得到了3條特異性條帶，且對(duì)豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和豬傳染性胃腸病毒（TGEV）核酸擴(kuò)增結(jié)果為陰性，病毒RNA模板檢出的最小量均為10fg。楊桂梅等選取VSV具有高度保守性的N基因序列設(shè)計(jì)引物，建立了VSV的RT-PCR快速檢測(cè)方法。應(yīng)用此法檢測(cè)VSV-NJ株、VSVIND株均為陽(yáng)性；而檢測(cè)其他相關(guān)病毒性疾病的病毒如牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、藍(lán)舌病病毒（BTV）等均為陰性結(jié)果，表明該方法具有良好的特異性。綜合上述研究結(jié)果，在開展水皰性口炎病毒分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)研究中，選用具有高度保守性的N基因序列設(shè)計(jì)引物和探針，可達(dá)到既不漏檢又不出現(xiàn)假陽(yáng)性的目的。

1.3 非洲豬瘟

1.3.1 病原學(xué) 非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸傳染性疾病，由蜱媒傳播，其臨床癥狀表現(xiàn)為高熱、皮膚充血、流產(chǎn)、水腫及臟器出血等，病死率高達(dá)100%，是我國(guó)一類動(dòng)物疫病和世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（Word Organisation for Animal Health，OIE）規(guī)定的必須報(bào)告的動(dòng)物疫病。ASFV是雙股DNA病毒，屬非洲豬瘟病毒科，是目前惟一已知的代表種，編碼至少34種結(jié)構(gòu)蛋白。

1.3.2 分子診斷檢測(cè)技術(shù) 曾少靈等［4］根據(jù)非洲豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因vp73的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性檢測(cè)引物，擴(kuò)增片段251bp，建立了檢測(cè)ASFV的PCR方法。與OIE推薦使用的2組PCR引物進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果表明，研究設(shè)計(jì)的引物靈敏度至少高出100倍，并且特異性強(qiáng)。張泉用P72基因設(shè)計(jì)并合成引物以及熒光標(biāo)記的Taq Man探針，建立了常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，除了對(duì)含ASFV的P72基因的質(zhì)粒PcDNAP72可產(chǎn)生特異性反應(yīng)外，對(duì)其他豬病毒的cDNA或DNA都不能產(chǎn)生特異信號(hào)，具有很好的反應(yīng)特異性。李洪利等［5］根據(jù)GenBank公布的23株編碼結(jié)構(gòu)蛋白P72的基因序列，設(shè)計(jì)引物和探針，建立了一套快速、靈敏、特異的檢測(cè)非洲豬瘟病毒的實(shí)時(shí)定量PCR的檢測(cè)方法。王彩霞等［6］以ASFV P72基因設(shè)計(jì)內(nèi)外引物，建立了一種快速高效檢測(cè)非洲豬瘟病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）方法，同時(shí)進(jìn)行了敏感性和特異性試驗(yàn)，其最低檢測(cè)限為10拷貝質(zhì)粒DNA，且具有良好的特異性。由于P72蛋白是ASFV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，高度保守，并且不同地區(qū)非洲豬瘟毒株P(guān)72基因在NCBI中同源性比較均在95%以上，因此在非洲豬瘟分子生物學(xué)檢測(cè)方法的建立過程中，可選擇P72基因作為靶基因設(shè)計(jì)引物和探針。

1.4 藍(lán)舌病

1.4.1 病原學(xué) 藍(lán)舌病是由藍(lán)舌病病毒（Blue tongue disease virus，BTV）引起，由庫(kù)蠓傳播的一種出血性疾病，主要侵害綿羊或牛及部分鹿種群。該病毒屬于呼腸病毒科環(huán)狀病毒屬。藍(lán)舌病病毒由10個(gè)節(jié)段的雙股RNA組成，編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1-VP7）和4種非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2、NS3a和NS3b）。VP7攜帶有群特異性抗原決定簇，由病毒抗原決定簇產(chǎn)生的抗體多數(shù)是針對(duì)VP7的。NS1非結(jié)構(gòu)蛋白由M5編碼，尹惠瓊對(duì)BTV不同血清型的保守基因VP7、NS1的堿基序列分析，發(fā)現(xiàn)NS1基因的5′端基因片段最為保守。

1.4.2 分子診斷檢測(cè)技術(shù) 宋紅梅等從感染BTV1的BHK-21細(xì)胞中提取RNA，以cDNA為模板對(duì)VP7基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的片段大約1 000bp，與預(yù)期大小1 050bp相符。尹惠瓊等［7］選取NS1最保守基因片段設(shè)計(jì)引物及Taq Man探針，建立了BTV RT-PCR檢測(cè)方法，用該體系對(duì)BTV-1、3、5、8、10、11、15、16、18、20、21、22 和EHDV-5進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果BTV各血清型標(biāo)準(zhǔn)毒株均呈陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，EHDV-5為陰性，即可有效檢出不同血清型BTV，與親緣關(guān)系最近的EHDV無交叉反應(yīng)，特異性好。綜合上述研究，根據(jù)NS1最保守基因序列設(shè)計(jì)引物和探針，與OIE陸生動(dòng)物手冊(cè)推薦的診斷靶基因片段相同，以此來建立藍(lán)舌病特異性的分子檢測(cè)方法，可對(duì)不同血清型BTV進(jìn)行通用檢測(cè)。

1.5 萊姆病

1.5.1 病原學(xué) 萊姆病是媒介蜱傳播的由伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi）引起的人獸共患病，其基本結(jié)構(gòu)類似于細(xì)菌。與其他主要的細(xì)菌類群不同，隸屬螺旋體科疏螺旋體屬，其結(jié)構(gòu)由表層、外膜、鞭毛、原生質(zhì)4部分組成。外膜表面蛋白OspA、OspB、OspC等抗原具有高度免疫原性。其中OspA產(chǎn)生抗體持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，與其他微生物的交叉反應(yīng)性低，并具有良好的免疫原性。

1.5.2 分子診斷檢測(cè)技術(shù) 付鈺廣［8］通過伯氏疏螺旋體16SrRNA基因序列，設(shè)計(jì)通用引物和探針，建立該序列的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法，該方法可特異性的檢測(cè)出阿氏疏螺旋體、伽氏疏螺旋體和狹義伯氏疏螺旋體，而與泰勒蟲、巴貝斯蟲、無漿體、衣原體和支原體病原無交叉反應(yīng)，其敏感性為常規(guī)PCR的104倍，能從22.88fg的基因組DNA中檢測(cè)到伯氏疏螺旋體核酸。牛慶麗等［9］設(shè)計(jì)伯氏疏螺旋體OspA基因片段的通用引物，獲得1對(duì)特異性引物，優(yōu)化反應(yīng)條件后建立用于檢測(cè)蜱體內(nèi)伯氏疏螺旋體的PCR方法，該方法可檢測(cè)出10pg的阿氏疏螺旋體、1pg的伽氏疏螺旋體和0.01pg的狹義伯氏疏螺旋體的3種不同基因型的伯氏疏螺旋體的OspA基因組DNA，表明其敏感性較好，適用于蜱感染伯氏疏螺旋體狀況的調(diào)查?？傊?，在建立檢測(cè)伯氏疏螺旋體的分子生物學(xué)方法中，對(duì)OspA基因設(shè)計(jì)引物是適合的，因?yàn)镺spA存在于90%的萊姆病螺旋體，應(yīng)用OspA基因設(shè)計(jì)引物均能檢測(cè)出3種致病型，敏感性相比付鈺廣以16SrRNA基因序列建立的實(shí)時(shí)定量PCR更高，并且與其他微生物的交叉反應(yīng)性低。

1.6 鹿流行性出血病

1.6.1 病原學(xué) 鹿流行性出血?。‥HD）是由庫(kù)蠓傳播的鹿、綿羊等反芻動(dòng)物的一種動(dòng)物蟲媒傳染病。鹿流行性出血病病毒屬呼腸病毒科環(huán)狀病毒（EHDV）屬，是雙股RNA病毒，由10個(gè)片段組成，編碼7個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（VP1-VP7）和4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2、NS3a和 NS3b）。VP7蛋白是 EHDV的群特異性抗原，與BTV陽(yáng)性血清沒有交叉反應(yīng)［10］。非結(jié)構(gòu)蛋白基因相當(dāng)保守，且與BTV相應(yīng)片段有顯著差異。其中NS3基因有群特異性，在EHDV-1和EHDV-2之間同源性為96.3%。

1.6.2 分子診斷檢測(cè)技術(shù) 張彩虹等［11］選用NS3基因作為目標(biāo)檢測(cè)基因，建立了能同時(shí)檢測(cè)并鑒別BTV和EHDV的二重LUXTM熒光PCR方法，該二重LUXTM熒光PCR的BTV和EHDV各自引物只對(duì)相應(yīng)的病毒呈陽(yáng)性反應(yīng)，兩者之間沒有交叉反應(yīng)，對(duì)其他幾種相似疾病的病毒呈陰性反應(yīng)。靈敏度分別為10個(gè)TCID50和1個(gè)TCID50。同時(shí)，與VP7基因作為靶基因建立的常規(guī)RT-PCR作比較，后者的靈敏度不及LUXTM熒光PCR方法。詹愛軍等［12］對(duì)EHDV的VP7基因進(jìn)行序列分析，設(shè)計(jì)EHDV特異性探針并用生物素標(biāo)記，與熒光編碼微球偶聯(lián)后與病毒VP7基因的PCR產(chǎn)物雜交反應(yīng)，建立了可檢測(cè)EHDV的液相芯片快速檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)結(jié)果顯示，該法具有較好的特異性，而與BTV的VP7基因、VSV的NP基因、WNV的E基因和AKV的N基因的PCR產(chǎn)物L(fēng)QRR值都小于2，即不與其他蟲媒病病毒反應(yīng)，檢測(cè)靈敏度為100個(gè)TCID50。上述研究表明，選擇NS3基因設(shè)計(jì)引物和探針，可用于鹿流行性出血熱病毒普通PCR鑒定、實(shí)時(shí)定量PCR和基因芯片的建立，尤其在高通量基因芯片技術(shù)的研究中，對(duì)探針特異性的嚴(yán)格要求，以NS3設(shè)計(jì)探針可以將同一個(gè)屬的藍(lán)舌病病毒鑒別出來。

2 蟲媒病的基因芯片檢測(cè)技術(shù)

生物芯片的概念來源于計(jì)算機(jī)芯片，借用了計(jì)算機(jī)芯片的集成化特點(diǎn)，將生物活性大分子或細(xì)胞等密集排列固定在固相載體上形成微型檢測(cè)器件，通過檢測(cè)每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息，一次試驗(yàn)就可以對(duì)上萬種基因進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)。自美國(guó)Affymetrix公司于1992年研制出第一張基因芯片開始，生物芯片就在生命科學(xué)領(lǐng)域迅速發(fā)展起來。目前生物芯片有著廣泛的應(yīng)用，包括疾病診斷和治療、藥物篩選、農(nóng)作物的優(yōu)育優(yōu)選、司法鑒定、食品衛(wèi)生監(jiān)督、環(huán)境檢測(cè)、國(guó)防、航天等領(lǐng)域。生物芯片種類主要分為基因芯片、蛋白芯片、組織芯片等，其中基因芯片是最早產(chǎn)生的一類芯片，也是現(xiàn)在使用最廣泛的一類。

基因芯片在國(guó)外研究較成熟，應(yīng)用范圍也較廣，其中在蟲媒病毒的研究應(yīng)用也逐漸發(fā)展起來。2006年，F(xiàn)itzgibbon J E等［13］建立了正痘病毒和甲病毒的多重RT-PCR，并且PCR產(chǎn)物與基因芯片上的探針成功的進(jìn)行了雜交，結(jié)果用包括委內(nèi)瑞拉馬腦炎、天花病毒等3種甲病毒和2種正痘病毒進(jìn)行驗(yàn)證具有高度特異性。Grinev A等［14］開發(fā)了西尼羅病毒（WNV）DNA微陣列試驗(yàn)并進(jìn)行優(yōu)化，DNA微陣列包括263條寡核苷酸探針被有序的固定在氨基化修飾的載玻片上，能同時(shí)檢測(cè)在WNV的整個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域的任何核苷酸突變，并且用2002年-2005年美國(guó)流行株的23個(gè)西尼羅病毒對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證。隨后在2012年對(duì)來自2007年-2009年的11個(gè)WNV株也進(jìn)行了驗(yàn)證［15］，結(jié)果檢測(cè)寡核苷酸為基礎(chǔ)的WNV陣列明確了所有突變的各結(jié)構(gòu)區(qū)域，針對(duì)突變的WNV基因組所開發(fā)的芯片鑒定技術(shù)，可潛在地作為一種高通量、快速、有效的檢測(cè)方法。Jack P J M等［16］利用寡核苷酸芯片技術(shù)檢測(cè)識(shí)別可引起水皰樣病變的18種家畜病毒，包括口蹄疫病毒血清型的代表，2種水皰性口炎病毒、豬水皰病病毒、豬水皰疹流感病毒、牛皰疹病毒Ⅰ、羊口瘡病毒、偽牛痘病毒、藍(lán)舌病病毒血清型Ⅰ和牛病毒性腹瀉病毒Ⅰ，并成功鑒定到屬的水平，表明進(jìn)一步開發(fā)這種芯片分析可能是水皰樣疾病診斷的重要途徑。Baner J等［17］使用掛鎖探針和基因芯片檢測(cè)和鑒定口蹄疫病毒、豬水皰病病毒和水皰性口炎病毒，成功地檢測(cè)和識(shí)別出不同地域的39個(gè)cDNA樣本代表的3種病毒，結(jié)果與已確定的血清型完全一致。Houck J A等［18］開發(fā)了3種不同的芯片平臺(tái)進(jìn)行蜱中螺旋體的檢測(cè)，結(jié)果顯示可以同時(shí)檢測(cè)和區(qū)分不同的疏螺旋體基因，至少能檢測(cè)出疏螺旋體DNA的單一拷貝。Gardner S N等［19］利用SNP基因芯片技術(shù)對(duì)馬腦炎病毒、正痘病毒、漢坦病毒等不同病毒的基因分型進(jìn)行研究，及時(shí)跟蹤病原毒株的疫情及變異，具有高通量、敏感性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。同年，Berthet N等［20］建立了檢測(cè)登革熱病毒、西尼羅病毒、基孔肯雅病毒的重測(cè)序DNA微陣列（RMA）技術(shù)，從生物樣品中提取病毒RNA進(jìn)行RT-PCR，得到的DNA片段用于PID2-RMA雜交，結(jié)果顯示具有很好的特異性，且靈敏度高，還可以有效的進(jìn)行感染登革熱病毒后的不同血清型的基因分析。

近年來，我國(guó)在蟲媒病檢測(cè)技術(shù)方面的研究步伐大大加快。詹愛軍等［21］利用液相芯片技術(shù)建立了可同時(shí)檢測(cè)鹿流行性出血熱病毒、阿卡斑病毒、藍(lán)舌病病毒和水皰性口炎病毒的快速高通量液相芯片技術(shù)，該方法具有較好的特異性，偶聯(lián)特異性探針的微球只與相應(yīng)的病毒基因的PCR產(chǎn)物反應(yīng)，而不與其他蟲媒病病毒反應(yīng)，檢測(cè)靈敏度達(dá)到50個(gè)～100個(gè)TCID50。羅淵等［22］在黃病毒屬高度保守的NS5區(qū)設(shè)計(jì)屬通用引物和種特異檢測(cè)探針，成功建立了同時(shí)檢測(cè)1～4型登革病毒、乙型腦炎病毒、西尼羅病毒、森林腦炎病毒和黃熱病病毒等5種蟲媒病毒的懸浮芯片檢測(cè)方法。通過多批次的試驗(yàn)，變異系數(shù)均小于8%，表明該方法的特異性和穩(wěn)定性均較好，對(duì)乙型腦炎病毒和黃熱病病毒的檢測(cè)敏感性可達(dá)到1.4個(gè)PFU，對(duì)西尼羅病毒可達(dá)14個(gè)PFU。朱曉光等［23］以甲病毒屬的東方馬腦炎病毒、西方馬腦炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、辛德畢斯病毒和馬雅羅病毒，黃病毒屬的登革熱病毒、西尼羅病毒、日本腦炎病毒和森林腦炎病毒，漢坦病毒屬的漢坦病毒及布尼亞病毒屬的布尼安亞病毒等13種主要蟲媒病毒為研究對(duì)象，利用基因芯片技術(shù)，設(shè)計(jì)針對(duì)以上病毒的種及屬水平的寡核苷酸探針，建立能對(duì)這些病毒進(jìn)行屬水平篩查及種水平鑒定的基因芯片技術(shù)，通過屬和種水平的檢測(cè)結(jié)果相互驗(yàn)證，為蟲媒病毒的檢測(cè)與鑒定提供一種高通量的新方法。郭歡歡等［24］根據(jù)乙型腦炎病毒的PrM和E基因序列的差異性，構(gòu)建了乙型腦炎病毒分型基因芯片，用于乙型腦炎病毒的分型，具有檢測(cè)乙型腦炎病毒和同步鑒別乙型腦炎病毒Ⅰ型和Ⅲ型的功能；張海燕等制備了乙型腦炎病毒與黃熱病病毒聯(lián)合診斷基因芯片，結(jié)果乙型腦炎病毒、黃熱病病毒探針與相應(yīng)的熒光標(biāo)記樣本雜交后，均能檢測(cè)出陽(yáng)性熒光信號(hào)，可應(yīng)用于多病毒臨床鑒別診斷。鄭夔等［25］研究建立了1型～4型登革病毒、乙型腦炎病毒、西尼羅病毒和基孔肯雅病毒等7種毒株、1種黃熱病毒疫苗株和1種裂谷熱病毒的6種蟲媒病毒微孔膜芯片檢測(cè)方法，具有快速、準(zhǔn)確、自動(dòng)化和高通量等特點(diǎn)，為快速應(yīng)對(duì)口岸輸入性發(fā)熱病例提供了非常有價(jià)值的檢測(cè)手段。凡敏等［26］根據(jù)GenBank中收錄的基孔肯亞病毒和辛德畢斯病毒基因的保守序列，合成2種病毒E基因序列及引物，設(shè)計(jì)針對(duì)2種病毒的寡核苷酸探針，初步建立了基孔肯亞病毒與辛德畢斯病毒特異性檢測(cè)基因芯片技術(shù)。

3 小結(jié)

受全球氣候變化及畜產(chǎn)品貿(mào)易的影響，蟲媒病在全球逐漸蔓延呈現(xiàn)出向高緯度蔓延的流行趨勢(shì)，部分動(dòng)物蟲媒病遺傳特性發(fā)生改變導(dǎo)致病毒毒力改變、致病力增強(qiáng)、造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。只有從根源著手，阻斷動(dòng)物蟲媒病的傳播與蔓延，才能使人類免于蟲媒病的危害。因此加強(qiáng)動(dòng)物蟲媒病病原基因的調(diào)查與監(jiān)測(cè)，病原學(xué)基礎(chǔ)研究具有重要意義。隨著生物芯片技術(shù)的發(fā)展，基因芯片技術(shù)以其準(zhǔn)確、高通量、快速、靈敏、特異、操作簡(jiǎn)便等顯著優(yōu)點(diǎn)成為一種極具吸引力的大規(guī)模生物檢測(cè)平臺(tái)，幾乎可用于任何分子相互作用的檢測(cè)。這為建立不同蟲媒攜帶多種病原的高通量生物芯片篩查方法奠定了基礎(chǔ)。也預(yù)示著該技術(shù)不僅在臨床診斷、農(nóng)業(yè)檢測(cè)等領(lǐng)域大大推進(jìn)，而且還將豐富獸醫(yī)科學(xué)實(shí)驗(yàn)手段與基礎(chǔ)研究進(jìn)程。

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