酶體外定向進(jìn)化技術(shù)及其發(fā)展

程夢(mèng)婷

摘 要：酶體外定向進(jìn)化技術(shù)可以大幅度提高酶分子的進(jìn)化效率，可以在未知酶空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制下，按照人們的期望實(shí)現(xiàn)特定目標(biāo)化。酶體外定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)酶工程今后的發(fā)展非常重要，對(duì)酶體外定向進(jìn)化技術(shù)的研究方法和發(fā)展前景做了歸納。

關(guān)鍵詞：酶；定向進(jìn)化；蛋白質(zhì)工程；發(fā)展前景

中圖分類號(hào)：Q55 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-6835（2014）02-0001-02

酶的定向進(jìn)化是20世紀(jì)90年代初興起的一種蛋白質(zhì)工程的新策略，近年來(lái)發(fā)展迅速。酶能催化各種各樣的化學(xué)反應(yīng)，可使需要幾天幾個(gè)月甚至幾年時(shí)間完成的轉(zhuǎn)化在幾分鐘甚至幾秒鐘內(nèi)完成，能催化化學(xué)方法難以完成的反應(yīng)，如構(gòu)象的改變等。同時(shí)，它無(wú)毒無(wú)害，對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染，在環(huán)境問(wèn)題日益嚴(yán)重的今天，酶的應(yīng)用顯得至關(guān)重要。

1 概述

酶的體外定向進(jìn)化又稱蛋白質(zhì)分子定向進(jìn)化，是蛋白質(zhì)工程的新策略。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，就是在事先不了解酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制的情況下，在實(shí)驗(yàn)室中通過(guò)模擬達(dá)爾文自然進(jìn)化過(guò)程，讓目標(biāo)酶分子在預(yù)先設(shè)計(jì)好的道路上快速進(jìn)化，獲得有價(jià)值的非天然酶。

定向進(jìn)化是隨機(jī)突變和選擇的結(jié)合，隨機(jī)突變是人為控制某些條件改變而引發(fā)的。后者雖相當(dāng)于環(huán)境，但只作用于突變后的分子群，起選擇預(yù)期方向的突變、排除其他方向突變的作用，整個(gè)進(jìn)化過(guò)程是在人為控制下進(jìn)行的。

定向突變使在自然選擇條件下需幾百萬(wàn)年乃至上億年才能完成的進(jìn)化過(guò)程，縮短到幾年、幾個(gè)月，甚至更短的時(shí)間，加速了酶的進(jìn)化過(guò)程。目前，該方法主要應(yīng)用于提高酶的穩(wěn)定性、酶活性、對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性，擴(kuò)大底物的選擇性，改變光學(xué)異構(gòu)體的選擇性等方面。

在目前已發(fā)現(xiàn)的8 000多種酶中，真正能夠進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用的商品酶并不多，主要原因是天然酶的性質(zhì)與工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境，例如高溫、高壓、有機(jī)溶劑、極端pH等的要求相差甚遠(yuǎn)。天然酶的底物選擇性等性質(zhì)難以滿足工業(yè)對(duì)蛋白酶的需求。酶的定向進(jìn)化技術(shù)是酶工程學(xué)研究的有效工具，該技術(shù)的發(fā)展使酶應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)成為可能。

2 酶體外定向進(jìn)化的常用方法

2.1 易錯(cuò)（error-prone）PCR

易錯(cuò)PCR技術(shù)是指采用Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因時(shí)，通過(guò)調(diào)整反應(yīng)條件，比如提高鎂離子濃度、加入錳離子等方式改變體系中4種dNTP的濃度等，改變Taq酶的突變頻率，從而向目的基因中引入隨機(jī)突變構(gòu)建出突變體庫(kù)，并從中選擇或篩選出所需要的突變體。由于在實(shí)驗(yàn)中僅經(jīng)過(guò)一次易錯(cuò)PCR擴(kuò)增，所以往往很難得到所需的突變，由此而產(chǎn)生了連續(xù)易錯(cuò)PCR擴(kuò)增技術(shù)，即一次PCR獲得的擴(kuò)增基因作為下一次的目的基因進(jìn)行操作，連續(xù)多次進(jìn)行上述PCR過(guò)程，直至獲得突變顯著的結(jié)果基因。

易錯(cuò)PCR是一種相對(duì)簡(jiǎn)單、快速、低廉的方法，但該方法較為費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，一般適用于較小的基因片段（<800 bp）。

目前，使用易錯(cuò)PCR的方法已取得了一定的成果。例如，Moore等對(duì)鼠傷寒沙門菌產(chǎn)生的α-門冬氨酰二肽酶進(jìn)行了改良，提高了酶的活力。Chen等用此方法在非水相溶液中對(duì)枯草桿菌蛋白酶E的活性進(jìn)行了改良。

使用該方法易出現(xiàn)同型堿基轉(zhuǎn)換，可以說(shuō)這種方法是最為基礎(chǔ)的方法，缺點(diǎn)也比較明顯。如何改善其費(fèi)時(shí)、費(fèi)力等缺點(diǎn)將是改進(jìn)技術(shù)的重點(diǎn)。

2.2 DNA改組（DNA shuffling）

DNA改組是Stemmer于1994年建立的模仿自然進(jìn)化的一種DNA體外隨機(jī)突變方法。DNA改組也叫DNA重排，是對(duì)一組同源基因進(jìn)行體外隨機(jī)重組的特殊PCR技術(shù)，也叫作基因洗牌術(shù)。所謂DNA改組，簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，就是將DNA拆散后重排，即將目的基因在DNaseI的作用下隨機(jī)酶切成20～50 bp的片段混合物，然后通過(guò)多次無(wú)引物PCR循環(huán)，各片段之間互為模板和引物，在擴(kuò)增的過(guò)程中進(jìn)行隨機(jī)組合，最終獲得發(fā)生多個(gè)突變位點(diǎn)的全長(zhǎng)基因。

DNA改組可使酶的2個(gè)或更多的已優(yōu)化性狀合為一體。因此，在理論和實(shí)際上，都優(yōu)于連續(xù)易錯(cuò)PCR?？傮w來(lái)說(shuō)，該技術(shù)簡(jiǎn)便、高效，已逐漸成為分子改造的主干技術(shù)。利用DNA改組，Stemmer等成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的定向進(jìn)化，提高了水解頭孢類抗生素的能力。Yano等人用該方法進(jìn)化天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，結(jié)果顯示支鏈氧代氨基酸的活力提高了105倍。

2.3 隨機(jī)引發(fā)重組（RPR）

RPR技術(shù)是Aronld于1998年首先報(bào)道的。其基本原理是以單鏈DNA為模板，隨機(jī)擴(kuò)增出有重疊片段模板的小片段，由于堿基錯(cuò)配和錯(cuò)誤引發(fā)，使這些小片段中也存在少量的突變。在隨后的PCR反應(yīng)中，這些片段互為引物進(jìn)行合成，隨之這些突變也發(fā)生重組，組裝成完整的基因。

RPR技術(shù)與DNA改組相比，具有如下特點(diǎn)：①所需親代DNA的量較少；②無(wú)需DNase I的處理，解決了DNA改組中DNase I所具有的序列偏向性；③組裝前不需進(jìn)行純化操作。

2.4 交錯(cuò)延伸技術(shù)（StEP）

StEP是Aronld等人于1998年建立的一種新的體外重組方法。其原理是，在PCR反應(yīng)中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步，新生鏈再作為引物與模板進(jìn)行退火和延伸，如此重復(fù)進(jìn)行，直到獲得全長(zhǎng)基因。Bulter等通過(guò)易錯(cuò)PCR、交錯(cuò)延伸重組等方法對(duì)漆酶（一種含銅多酚氧化酶）進(jìn)行了體外定向進(jìn)化，篩選得到的突變酶的總活力比原酶提高了160倍。

近年來(lái)，新技術(shù)大量涌現(xiàn)，以上述幾種方法為基礎(chǔ)的各種新方法不斷出現(xiàn)，如過(guò)渡模板隨機(jī)嵌合生長(zhǎng)技術(shù)（RACHHITT）、外顯子重排（Exon Shuffling）、退火低核苷酸基因重排（DOGS）和增加平截雜合酶法（ITCHY）等方法。通常，在酶定向進(jìn)化過(guò)程中，各種方法并不是獨(dú)立的，也沒(méi)有哪一種方法是萬(wàn)能的，因而可通過(guò)多種方法的組合，使酶的性質(zhì)得到更大的提高。

3 討論

基因文庫(kù)的構(gòu)建是酶體外定向進(jìn)化的基礎(chǔ)。在眾多的基因文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)中，易錯(cuò)PCR是最早出現(xiàn)的一種，其后產(chǎn)生的各種各樣的新技術(shù)，或是以其為基礎(chǔ)，或是對(duì)其進(jìn)行改良。時(shí)至今日，易錯(cuò)PCR技術(shù)仍常被用于文庫(kù)的構(gòu)建。每種方法都有其獨(dú)特之處，例如，DNA shuffling是一種產(chǎn)生雜合酶的有效方法，但只能重組2個(gè)親本基因，而且只限于產(chǎn)生單雜交文庫(kù)；RPR技術(shù)可使用單鏈DNA且不需要DNase I的處理；StEP法是一種只依賴于條件嚴(yán)格控制的PCR的不同的體外重組法。選擇合適的方法會(huì)使定向進(jìn)化過(guò)程變得更加簡(jiǎn)單，使結(jié)果更趨于理想。

4 結(jié)束語(yǔ)

成功的定向進(jìn)化需要滿足功能實(shí)際、目標(biāo)功能可行、合適的篩選方法等條件。在一定程度上，現(xiàn)實(shí)中自然進(jìn)化的難易度決定了定向突變能否解決實(shí)際問(wèn)題，因而在做選擇之前，要先對(duì)所需優(yōu)化性狀進(jìn)行可行性分析，應(yīng)選擇易于優(yōu)化的性狀進(jìn)行改良。通常來(lái)說(shuō)，使用上述技術(shù)可實(shí)現(xiàn)已有性狀的優(yōu)化，但是創(chuàng)造全新性狀的新酶，是一項(xiàng)艱巨的工作，因?yàn)橐环N新的功能需要新的順序空間，而人們很難預(yù)測(cè)需要重復(fù)多少次才能得到預(yù)期的答案，可能會(huì)很幸運(yùn)，很快就得到，也可能會(huì)是一個(gè)漫長(zhǎng)而艱難的過(guò)程。

上述定向進(jìn)化方法幾乎可以運(yùn)用到生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。目前，體外定向進(jìn)化的方法不僅被成功地運(yùn)用在酶的改造上，而且還被成功地運(yùn)用于DNA的進(jìn)化（如DNA疫苗等）、酶以外蛋白質(zhì)的進(jìn)化（例如提高抗體基因表達(dá)、對(duì)細(xì)胞因子生長(zhǎng)因子的改造等）。我們堅(jiān)信，這些技術(shù)方法的進(jìn)一步完善和更廣泛的運(yùn)用，必將推動(dòng)很多領(lǐng)域的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)人類認(rèn)識(shí)自然、改造自然史上的又一次飛躍。

參考文獻(xiàn)

[1]胡軍.酶技術(shù)發(fā)展與酶定向進(jìn)化[J].工業(yè)微生，1999，29（4）：37-42.

[2]平麗英，柳志強(qiáng)，薛亞平，等.酶的分子定向進(jìn)化及其應(yīng)用[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28（5）.

[3]蘇龍，莊宇，何冰芳.酶的定向進(jìn)化研究及其在工業(yè)生物催化中的應(yīng)用[J].生物加工過(guò)程，2011，9（4）：69-74.

[4]周亞鳳，張先恩，Cass A E G.分子酶工程學(xué)研究進(jìn)展[J].生物工程學(xué)報(bào)，2002，18（4）：401-406.

[5]劉衛(wèi)曉，錢世鈞.酶分子體外定向進(jìn)化的研究方法[J].微生物學(xué)通報(bào)，2004，31（2）：100-104.

[6]徐威，朱春寶，朱寶泉.酶定向進(jìn)化的研究策略[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)，2004，35（7）：436-441.

[7]曾家豫，楊國(guó)兵，廖世奇.生物酶的定向進(jìn)化及其應(yīng)用[J].衛(wèi)生職業(yè)教育，2007，25（23）：155-159.

[8]方柏山，鄭媛媛.酶體外定向進(jìn)化（Ⅰ）突變基因文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)及其新進(jìn)展[J].華僑大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，4：337-342.

[9]徐卉芳，張先恩，張用梅.體外分子定向進(jìn)化研究進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2002，29（4）：518-522.

〔編輯：曹月〕

Enzyme in Vitro Directed Evolution Technology and Developmen

Cheng Mengting

Abstract： The enzyme in vitro directed evolution technology can greatly improve the efficiency of the evolution of enzyme molecules， the enzyme may be unknown spatial structure and catalytic mechanism， in accordance with peoples expectations of achieving specific goals. Enzyme in vitro directed evolution technology for the future development of enzyme engineering is very important enzyme in vitro directed evolution methods and technology made prospects are summarized.

Key words： enzyme； directed evolution； protein engineering； development prospects