法舒地爾對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的足細(xì)胞自噬的影響

高雪靜　唐　莎　尹仕偉　張　瑩　謝　京　施維維　王　莉　鄒麗云　牟芝蓉　張靜波

足細(xì)胞損傷是導(dǎo)致蛋白尿產(chǎn)生的主要原因之一。血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的主要效應(yīng)分子，可通過(guò)足細(xì)胞上的1型Ang Ⅱ 受體(AT1R)直接作用于足細(xì)胞，引起細(xì)胞損傷，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和功能失調(diào)甚至數(shù)量的丟失[1]。近年來(lái)大量研究及循證醫(yī)學(xué)證據(jù)均表明無(wú)論是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)還是Ang Ⅱ受體拮抗劑(ARB)都具有獨(dú)立于降壓作用之外的腎臟保護(hù)作用，但其具體的作用機(jī)制尚未完全清楚。

自噬作為維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機(jī)制，通過(guò)對(duì)受損細(xì)胞器和老化蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)進(jìn)行降解及再利用，為新的蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞器的更新提供原料，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。足細(xì)胞作為終末分化細(xì)胞，較高基礎(chǔ)活性的自噬在維持其代謝及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、保持其數(shù)量的恒定中起非常關(guān)鍵的作用，但過(guò)渡的自噬會(huì)導(dǎo)致自噬性程序性死亡增加[2]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)是目前公認(rèn)的標(biāo)記性自噬分子。在自噬發(fā)生過(guò)程中，LC3-Ⅰ被Atg7 和Atg3 在內(nèi)的泛素樣體系修飾和加工，產(chǎn)生相對(duì)分子質(zhì)量較小的LC3-Ⅱ，并定位到自噬小體中，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例變化可用來(lái)判斷自噬是否被誘導(dǎo)[8]。Beclin-1基因是近十多年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與自噬相關(guān)的一種抑癌基因，通過(guò)與Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)形成復(fù)合物調(diào)節(jié)自噬活性，Beclin-1蛋白是研究自噬是另一個(gè)標(biāo)志性蛋白[9]。新近研究發(fā)現(xiàn)，Rho 激酶通路在自噬的調(diào)節(jié)中起重要作用[3,4]。結(jié)合Rho激酶抑制劑法舒地爾對(duì)慢性腎臟病的保護(hù)效應(yīng)[5,6]，本研究體外觀察了法舒地爾對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的足細(xì)胞自噬的干預(yù)作用，為進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)材料條件永生化人足細(xì)胞株(AB 8/13) 由英國(guó)Bristol大學(xué)Moin A Saleem教授惠贈(zèng)。細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)(美國(guó)Gibco)，胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉(ITS)、胰蛋白酶-EDTA(美國(guó)Sigma)，青鏈霉素(美國(guó)Invitrogen)，Ang Ⅱ(美國(guó)Biovision),3-甲基腺嘌呤(3-MA)(美國(guó)InvivoGen),法舒地爾(成都苑東藥業(yè))，兔抗人LC3B多克隆抗體(美國(guó)Sigma)，兔抗人Beclin-1多克隆抗體、兔抗人β-actin多克隆抗體(美國(guó)Santa Crus)，DAPI、RIPA裂解液、PMSF、BCA試劑盒、PVDF膜、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔lgG、ECL發(fā)光劑(上海碧云天)，Alexa Fluor 555山羊抗兔IgG(美國(guó)Invitrogen)。

足細(xì)胞培養(yǎng)及分組永生化人足細(xì)胞株(AB8/13)培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)并稍作修改[7]。足細(xì)胞快速?gòu)?fù)蘇后用含10%FBS、青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml和ITS(胰島素10 μg/ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白5 μg/ml和亞硒酸鈉5 μg/ml)的RPMI1640培養(yǎng)液在33℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中傳代增生，待細(xì)胞融合70%后轉(zhuǎn)入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分化14d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將足細(xì)胞隨機(jī)分為：(1)空白對(duì)照組；(2)Ang Ⅱ刺激組：不同濃度的Ang Ⅱ(10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L)刺激足細(xì)胞24h；(3)Ang Ⅱ刺激細(xì)胞不同時(shí)間組：10-7mol/L Ang Ⅱ分別刺激足細(xì)胞0h、6h、12h、24h、36h；(4)3-MA組：5 mmol/L 3-MA預(yù)孵育30 min后，加入10-7mol/L Ang Ⅱ刺激24h；(5)法舒地爾組：加入10-7mol/L法舒地爾作用24h；(6)法舒地爾+Ang Ⅱ組：10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L法舒地爾預(yù)孵育30 min后，加入10-7mol/L Ang Ⅱ刺激24h。

熒光法檢測(cè)LC3B的表達(dá)及分布LC3是公認(rèn)的自噬分子標(biāo)記物。在自噬過(guò)程中，LC3-Ⅰ被修飾和加工，LC3-Ⅱ定位到自噬小體中，通過(guò)檢測(cè)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例變化來(lái)判斷自噬是否被誘導(dǎo)。將足細(xì)胞(AB8/13)進(jìn)行細(xì)胞爬片，根據(jù)不同分組培養(yǎng)細(xì)胞后4%多聚甲醛4℃固定15 min,0.1%Triton X-100 4℃通透10 min，PBS洗滌3次后5%BSA室溫封閉1h。一抗兔抗人LC3B多克隆抗體(1∶200)4℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次后，Alexa Fluor 555 山羊抗兔IgG(1∶1000)室溫孵育1h,PBS洗滌3次后，DAPI室溫染色3 min,雙蒸水洗滌2次后封片，熒光顯微鏡下觀察、攝像，Image Pro-Plus(IPP)圖像分析軟件測(cè)量熒光強(qiáng)度，結(jié)果以目的蛋白的平均熒光強(qiáng)度值表示。

Western印記法檢測(cè)LC3B[8,9]、Beclin-1蛋白的表達(dá)各組細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每組細(xì)胞加入100 μl RIPA裂解液(含1 mmol/L PMSF)，冰上裂解30 min,4℃預(yù)冷離心機(jī)12 000 r/min離心5 min,收集上清。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)蛋白濃度，加入上樣緩沖液，100℃變性5 min。每組取30 μg蛋白上樣，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳,200 MA,30 min將蛋白電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，室溫5%脫脂奶粉封閉1h，一抗(LC3B 1∶1 000,Beclin-1 1∶500，β-actin 1∶500)4℃過(guò)夜，TBST洗膜3次，每次5 min，加二抗(HRP標(biāo)記山羊抗兔lgG 1∶1 000)室溫孵育1h,TBST洗膜3次，每次5 min，ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析，結(jié)果以目的蛋白/內(nèi)參的灰度比值表示。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，兩組以上比較采用單因素方差分析。采用Graphpad Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

結(jié)　　果

Ang Ⅱ?qū)ψ慵?xì)胞LC3B表達(dá)的影響首先采用不同濃度(10-8～10-6mol/L)Ang Ⅱ分別干預(yù)人足細(xì)胞24h 后，通過(guò)Western印跡法檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3B的變化。在一定范圍內(nèi)隨著劑量的增加，LC3-Ⅱ表達(dá)增加(圖1A)，在10-7mol/L濃度時(shí)達(dá)到峰值，與空白對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1B)；以 10-7mol/L Ang Ⅱ?yàn)楣潭舛却碳ぷ慵?xì)胞，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，LC3-Ⅱ表達(dá)逐漸增強(qiáng)(圖1C)，在24h達(dá)到峰值，與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異，在36h后呈下降趨勢(shì)，但與空白對(duì)照組相比仍具有顯著性差異(圖1D)。進(jìn)一步以 10-7mol/L Ang Ⅱ刺激足細(xì)胞后，免疫熒光檢查觀察到LC3B由散在分布于胞質(zhì)向細(xì)胞核周圍聚集(圖2A)。與正常對(duì)照組相比，Ang Ⅱ刺激足細(xì)胞24h后LC3B的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.030，圖2B)。

圖1　 Ang Ⅱ刺激足細(xì)胞不同濃度、時(shí)間點(diǎn)LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)(Western印跡)

圖2　Ang Ⅱ刺激足細(xì)胞后LC3B表達(dá)的變化(IF，×400)

Ang Ⅱ?qū)ψ慵?xì)胞Beclin-1蛋白表達(dá)的影響采用不同濃度Ang Ⅱ(10-8～10-6mol/L)分別干預(yù)人足細(xì)胞24h 后，通過(guò)Western印跡法檢測(cè)自噬標(biāo)志物Beclin-1的變化。在一定范圍內(nèi)隨著劑量的增加，Beclin-1表達(dá)增加(圖3A)，在10-7mol/L濃度時(shí)達(dá)到峰值，與空白對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖3B)；以 10-7mol/L Ang Ⅱ?yàn)楣潭舛却碳ぷ慵?xì)胞，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，Beclin-1表達(dá)逐漸增加，在24h達(dá)到峰值，與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.01)，在36h后呈下降趨勢(shì)，但與空白對(duì)照組相比仍具有顯著性差異(P<0.01)(圖3C、D)。

3-MA對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)足細(xì)胞LC3B表達(dá)的影響用5 mmol/L 3-MA預(yù)孵育足細(xì)胞30 min，隨后加入10-7mol/L Ang Ⅱ刺激足細(xì)胞24h后，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)LC3B的表達(dá)。與Ang Ⅱ刺激組相比，3-MA抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)足細(xì)胞LC3B的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)，同時(shí)抑制LC3B向細(xì)胞核周圍聚集(圖4)。

圖3　Ang Ⅱ刺激足細(xì)胞不同濃度、時(shí)間點(diǎn)Beclin-1蛋白的表達(dá)(Western印跡)

圖4　3-MA對(duì)Ang Ⅱ(10-7mol/L)誘導(dǎo)足細(xì)胞LC3B表達(dá)的影響(IF，×400)

法舒地爾對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)足細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白表達(dá)的影響采用不同濃度(10-8～10-6mol/L)的法舒地爾預(yù)孵育足細(xì)胞30 min，加入10-7mol/L Ang Ⅱ刺激足細(xì)胞后，通過(guò)Western印跡法檢測(cè)自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ(圖5A、B)和Beclin-1(圖5C、D)的表達(dá)。結(jié)果顯示，Ang Ⅱ可明顯增加足細(xì)胞LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白的表達(dá)(均P<0.01)；雖然法舒地爾本身并不能影響足細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的轉(zhuǎn)換及Beclin-1的變化，但可降低Ang Ⅱ誘導(dǎo)的足細(xì)胞LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達(dá)，在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴，10-7mol/L時(shí)抑制作用最強(qiáng)，與Ang Ⅱ刺激組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，10-6mol/L時(shí)抑制作用減弱，但與Ang Ⅱ刺激組相比仍具有顯著性差異(圖5)。

圖5　不同濃度法舒地爾對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)足細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1蛋白表達(dá)的影響

免疫熒光觀察法舒地爾對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)足細(xì)胞LC3B表達(dá)的影響采用法舒地爾(10-7mol/L)預(yù)孵育足細(xì)胞30 min，加入Ang Ⅱ10-7mol/L刺激足細(xì)胞24h后，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)法舒地爾抑制LC3B向細(xì)胞核周圍聚集。與Ang Ⅱ刺激組相比，法舒地爾明顯抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)足細(xì)胞LC3B的表達(dá)(P=0.012)(圖6)。

圖6　法舒地爾對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)足細(xì)胞LC3B表達(dá)的影響

討　　論

足細(xì)胞在維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用。RAS激活是導(dǎo)致足細(xì)胞損傷的重要因素。無(wú)論是免疫、代謝因素還是血流動(dòng)力學(xué)的變化，均可刺激腎臟局部包括足細(xì)胞在內(nèi)的RAS激活，導(dǎo)致Ang Ⅱ釋放增加。van Kats等[10]報(bào)道，腎組織AngⅡ濃度是循環(huán)中AngⅡ濃度的60～100倍，其中85%為器官局部產(chǎn)生。這些高濃度的AngⅡ可導(dǎo)致足細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)及功能改變，甚至凋亡[1，2]。足細(xì)胞作為分枝狀結(jié)構(gòu)的終末分化細(xì)胞，具有較高的基礎(chǔ)自噬活性以維持其數(shù)目的穩(wěn)定性[2,11]。適度的自噬有利于細(xì)胞存活，但過(guò)度自噬則可導(dǎo)致Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡[1,2]。本研究證實(shí)AngⅡ可誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬明顯增加，并呈時(shí)間依賴性，結(jié)果與文獻(xiàn)一致[1]。而Rho激酶抑制劑法舒地爾對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)的自噬有干預(yù)作用。

本研究發(fā)現(xiàn)Ang Ⅱ處理足細(xì)胞6h 即出現(xiàn)自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化，并呈時(shí)間依賴性；Beclin-1于6h開(kāi)始表達(dá)上調(diào)，24h達(dá)最高峰，提示AngⅡ誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生自噬。無(wú)論是LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化還是Beclin-1 的表達(dá)在36h均有所下調(diào)，可能由于隨著刺激的延長(zhǎng)，導(dǎo)致足細(xì)胞內(nèi)caspase-3活化增強(qiáng)，活化的caspase具有剪切Beclin-1的作用[11,12]。3-MA是PI3K的抑制劑[12]，通過(guò)抑制Beclin-1復(fù)合物可特異性阻斷自噬體的形成，被廣泛用作自噬的抑制劑。本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用3-MA 預(yù)處理后能夠抑制AngⅡ誘導(dǎo)的足細(xì)胞自噬，進(jìn)一步證實(shí)Ang Ⅱ誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。

有研究證實(shí)Ang Ⅱ是Rho 激酶通路激活的主要因子[13]，但具體機(jī)制依然不清。Rho激酶又稱Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK) ，作為小GTP結(jié)合蛋白R(shí)ho 的下游效應(yīng)分子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞收縮、遷移、增生和凋亡。Rho 激酶途徑參與多種腎臟疾病如缺血-再灌注損傷、糖尿病腎病、梗阻性腎病、高血壓腎損害及免疫介導(dǎo)的腎臟損傷。法舒地爾作為Rho激酶抑制劑在這些因素導(dǎo)致的腎臟損傷中的保護(hù)作用及防止腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及纖維化被廣泛證實(shí)[14-16]。新近研究表明，Rho 激酶通路在自噬的調(diào)節(jié)中起重要作用[3,4]。本研究發(fā)現(xiàn)法舒地爾單獨(dú)刺激足細(xì)胞并不影響LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值及Beclin-1的變化，但法舒地爾不僅抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的足細(xì)胞LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)換，還可抑制LC3B蛋白及Beclin-1蛋白的表達(dá)，與Bessho等[17]報(bào)道Rho激酶抑制劑y-27632單獨(dú)并不影響大鼠心肌母細(xì)胞瘤細(xì)胞h9c2自噬活性的結(jié)果類似。近來(lái)Iorio等[18,19]基于藥物靶點(diǎn)相似性推理預(yù)測(cè)法舒地爾可作為自噬增強(qiáng)劑，并在體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中得到證實(shí)，這可能與細(xì)胞類型相關(guān)。最新的研究表明，活性氧簇(ROS)，特別是線粒體源性ROS，作為信號(hào)分子參與自噬的調(diào)節(jié)。Yadav等[1]研究發(fā)現(xiàn)，Ang Ⅱ可導(dǎo)致足細(xì)胞ROS產(chǎn)生，抗氧化劑可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的自噬。Li等[20]研究表明法舒地爾可通過(guò)降低ROS的聚集達(dá)到氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果也提示法舒地爾可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的足細(xì)胞自噬，可能與其降低了Ang Ⅱ誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生相關(guān)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，Ang Ⅱ 可誘導(dǎo)人足細(xì)胞自噬增強(qiáng)，而Rho激酶抑制劑法舒地爾可明顯抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的自噬發(fā)生，其機(jī)制可能與Ang Ⅱ 上調(diào)Rho激酶途徑相關(guān)，抑制Rho/Rho激酶信號(hào)通路可能成為改善腎臟局部RAS系統(tǒng)過(guò)度激活導(dǎo)致腎臟損傷的靶點(diǎn)。

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