低溫β－半乳糖苷酶分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究

張 雪 華 霄 許 琪 楊瑞金 范宇婷

（1．江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2．云南省中小企業(yè)服務(wù)中心，云南 昆明 650000）

β－D－半乳糖苷酶（EC 3．2．1．23）具有催化乳糖中β－半乳糖苷鍵水解為葡萄糖和半乳糖及轉(zhuǎn)移半乳糖苷的活力［1］。乳品工業(yè)中，乳糖酶用于水解乳制品中的乳糖，緩解乳糖不耐受癥［2］。中國(guó)90%左右的成人有乳糖不耐癥［3］，生產(chǎn)提供低乳糖乳是解決乳糖不耐問題的有效途徑［4］。

乳品工業(yè)中使用的β－半乳糖苷酶多來源于微生物，利用微生物生產(chǎn)β－半乳糖苷酶，具有產(chǎn)量高、成本低、周期短等優(yōu)點(diǎn)［5］，但目前商業(yè)β－半乳糖苷酶大多為中溫酶，最適溫度在37 ℃左右或者更高［6］，而乳品加工中許多長(zhǎng)時(shí)間的工藝以及貯運(yùn)均在低溫下進(jìn)行［7］，不利于β－半乳糖苷酶活力發(fā)揮，低溫β－半乳糖苷酶在低溫下具有較高酶活，因此在乳制品加工及儲(chǔ)運(yùn)過程中能夠高效水解乳糖，且低溫有利于抑制常溫微生物生長(zhǎng)，提高了乳制品安全性，且在反應(yīng)結(jié)束后可通過適當(dāng)升高體系溫度來阻止乳糖酶的進(jìn)一步反應(yīng)，以保證食品風(fēng)味的統(tǒng)一性［8］。理論研究方面，分離純化得到純酶可進(jìn)行酶蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)、低溫酶的催化反應(yīng)機(jī)制及低溫酶的結(jié)構(gòu)與其熱敏性關(guān)系的研究。1996年，得到第一個(gè)低溫酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)，該酶是來自南極的革蘭氏陰性菌所產(chǎn)的a－淀粉酶，隨后得到三級(jí)結(jié)構(gòu)的低溫酶分別是鈣離子鋅離子蛋白酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、檸檬酸合成酶、蘋果酸酶，通過這些低溫酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)研究低溫酶的低溫適應(yīng)性［9］。

目前國(guó)內(nèi)外研究的大多數(shù)低溫β－半乳糖苷酶產(chǎn)生菌為節(jié)桿 菌（arthrobacter）［10，11］和 交 替 假 單 胞 菌（Pseudoalteromonas）［12－14］。本研究中產(chǎn)低溫乳糖酶的耐冷菌Rahnellasp．R3屬于拉恩氏屬［15］。與劉文玉等［16］所研究的低溫乳糖酶產(chǎn)生 菌Rahneua aquatilis sp．14．1 屬 同 一 菌 屬，但 通 過16SrRNA 序列分析可知，這兩株菌的基因序列有較大差異［15］，是不同的菌株。

本研究擬采用硫酸銨分級(jí)沉淀、Phenyl Sepharose CL－4B疏水層析、Q Sepharose High Performance陰離子交換層析、Sephacryl S－200High Resolution凝膠過濾層析對(duì)該酶進(jìn)行分離純化，通過SDS－PAGE證實(shí)得到純酶，之后對(duì)純酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，包括最適溫度和pH，溫度和pH 穩(wěn)定性，金屬離子對(duì)該酶的激活或鈍化作用，以及酶催化的米氏方程。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

陰離子交換層析填料（Q sepharose high performance）、凝膠層析填料（sephacryl S－200high resolution）、疏水層析填料（phenyl sepharose CL－4B）：美國(guó)GE Healthcare公司；

鄰硝基苯－β－D－半乳糖苷（ONPG）：國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司；

高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白：大連寶生物公司；

其他試劑未加說明均為分析純；

電腦全自動(dòng)部分收集器：DBS－100型，上海滬西分析儀器廠；

電腦數(shù)顯恒流泵：DHL－A 型，上海滬西分析儀器廠；

紫外檢測(cè)器：HD－3型，上海滬西分析儀器廠；

梯度混合器：TH－300型，上海滬西分析儀器廠；

雙門層析柜：REC5004V20型，美國(guó)Revco公司；

紫外分光光度計(jì)：UV－100型，尤尼柯儀器有限公司。

1．2 菌株及培養(yǎng)基

菌株：產(chǎn)低溫乳糖酶的耐冷菌Rahnella sp．R3，本實(shí)驗(yàn)室篩選并保存；

活化 培 養(yǎng) 基（1／4TSB）：胰 蛋 白 胨1．5%，大 豆 蛋 白胨0．5%，氯化鈉0．5%，pH （7．2±0．2）；

發(fā)酵培養(yǎng)基：乳糖3．0%，蛋白胨1．5%，酵母浸膏1．0%，NaCl 0．3%，pH （7．0±0．2）。

1．3 酶活力測(cè)定

吸取0．8mL 2．5g／L ONPG 于試管中，15℃預(yù)熱，添加0．2mL酶液，15 ℃恒溫反應(yīng)5min，加入1mL 10% NaCO3溶液終止反應(yīng)。適當(dāng)稀釋于420nm 處測(cè)吸光值，空白以去離子水代替酶液［15］。酶活定義為一定條件下，1 min 水解ONPG 產(chǎn)生1μmol鄰硝基苯酚（ONP）所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位（U）。

1．4 蛋白濃度的測(cè)定

采用Bradford法［17］，以牛血清白蛋白質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量。

1．5 低溫乳糖酶的純化

1．5．1 菌株培養(yǎng)及粗酶液的制備 細(xì)菌由活化培養(yǎng)基活化培養(yǎng)24h（15 ℃，200r／min），然后按4%的接種量轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)32～34h（15 ℃，200r／min）。發(fā)酵完成后，發(fā) 酵 液 離 心10 min（4 ℃，8 000r／min），收 集 菌 體，用pH 7．1的Tris－HCl緩沖液清洗兩次，重懸后高壓細(xì)胞破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎，然后離心30min（4 ℃，8 500r／min），得到粗酶液。

1．5．2 硫酸銨飽和度的確定 向7個(gè)50mL的燒杯中分別加入20mL 粗酶液，按硫酸銨飽和度為10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%依次向燒杯中加入已研磨硫酸銨粉末，緩慢 攪 拌 至 溶 解，4 ℃靜 置2h，離 心30 min（4 ℃，8 500r／min），取上清液，測(cè)上清液酶活。

1．5．3 Phenyl Sepharose CL－4B 疏 水 層 析 預(yù) 先 用 加有0．8mol／L 氯 化 鈉 的20 mmol／L Tris－ HCl 緩 沖 液（pH 7．5）平衡Phenyl Sepharose CL－4B（2．6cm×40cm）疏水層析柱，流速0．8 mL／min。將硫酸銨鹽析后得到的粗酶液經(jīng)0．22μm 的微孔濾膜后，15 mL 上樣Phenyl Sepharose CL－4B（2．6cm×40cm）疏水層析柱，用含有0．8mol／L氯化鈉的pH 7．5，20 mmol／L 的Tris－HCl緩沖液洗脫，待OD280 值低于0．05時(shí)，使用不含鹽的20 mmol／L 的Tris－HCl緩沖液（pH 7．5）洗脫，收集并檢測(cè)酶活力，收集有酶活的部分。

1．5．4 Q Sepharose High Performance離子交換層析 預(yù)先用加有0．3 mol／L 氯化鈉的20 mmol／L Tris－HCl緩沖液（pH 7．1）平衡Q Sepharose High Performance（2．6cm×15cm）陰離子交換層析柱，流速1 mL／min。將通過Phenyl Sepharose CL－4B收集到 的 有 酶 活 的30 mL 上 樣Q Sepharose High Performance 陰 離 子 交 換 層 析，先 用 加 有0．3mol／L氯化鈉的20mmol／LTris－HCl緩沖液（pH 7．1）以相同的流速洗脫，待OD280低于0．05時(shí)，再用加有0．3～0．8mol／L氯化鈉的20mmol／L Tris－HCl（pH 7．1）緩沖液線性梯度洗脫，收集并檢測(cè)酶活力，收集有酶活的部分。

1．5．5 Sephacryl S－200High Resolution凝膠過濾層析 預(yù)先用20mmol／L的Tris－HCl緩沖液（pH 7．1）平衡Sephacryl S－200 High Resolution（1．6cm×100cm）凝膠過濾層析柱，流速0．5 mL／min。將離子交換層析得到的有酶活的部分15mL濃縮到3mL后經(jīng)0．22μm 的微孔濾膜，上樣 到 Sephacryl S－200 High Resolution 凝 膠 過 濾 層析，20mmol／L的Tris－HCl緩沖液（pH 7．1）洗脫，收集并檢測(cè)酶活力，收集有酶活的部分。以上所有操作均在4 ℃層析柜中進(jìn)行。

1．5．6 純度鑒定和分子量測(cè)定 按Laemmli等的方法［18］進(jìn)行SDS－PAGE，采用分離膠濃度為7．5%，濃縮膠濃度為5%，將樣品和標(biāo)準(zhǔn)蛋白（高分子量標(biāo)準(zhǔn)200，116，97．2，66．4，44．3kDa）進(jìn)行SDS－PAGE，然后通過凝膠成像分析軟件Image lab 3．0計(jì)算酶的表觀分子量。

1．6 酶學(xué)性質(zhì)的研究

1．6．1 酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性研究 選取4，15，25，35，45，55，65 ℃7個(gè)反應(yīng)溫度，測(cè)定酶活，考察不同反應(yīng)溫度對(duì)酶活性的影響。根據(jù)溫度對(duì)酶活力的影響選取4，15，25，35，45 ℃5個(gè)溫度，保溫，每隔15 min測(cè)一次酶活，考察酶的熱穩(wěn)定性。

1．6．2 酶的最適pH 及pH 穩(wěn)定性研究 選取pH 5．0，5．5，6．0，6．5，7．0，7．5，8．0，8．5，9．0，在各個(gè)pH 條件下測(cè)定酶活，考察pH 對(duì) 酶活性影 響。在25 ℃、pH 5．0，5．5，6．0，6．5，7．0，7．5，8．0，8．5，9．0維持24h，測(cè)定酶活，考察pH 的穩(wěn)定性。

1.勞動(dòng)力資源短缺?！捌匠删皻狻?使得日本經(jīng)濟(jì)對(duì)勞動(dòng)力的供需矛盾進(jìn)一步凸顯，日本在1988年的有效求人倍率開始大于1，并不斷增加。1989年，日本制造業(yè)勞動(dòng)力的供需矛盾在質(zhì)與量上均呈現(xiàn)供給不足，技術(shù)人才短缺成為主要矛盾。根據(jù)《日本工業(yè)新聞》的一項(xiàng)調(diào)查統(tǒng)計(jì)：日本電氣電子行業(yè)、信息通信行業(yè)、機(jī)械制造行業(yè)的技術(shù)人員嚴(yán)重短缺。被調(diào)查的企業(yè)中，超過50%的機(jī)械制造行業(yè)表示技術(shù)人員嚴(yán)重不足；汽車制造、船舶制造和建筑行業(yè)表示技術(shù)人員缺乏的比例為54%；69%的基礎(chǔ)材料企業(yè)表示五年后將出現(xiàn)嚴(yán)重的技術(shù)人才短缺。

1．6．3 金屬離子對(duì)酶活性的影響 選取Na＋、Mg2＋、K＋、Ca2＋、Cu2＋、Al3＋、Zn2＋7 種 金 屬 離 子，離 子 濃 度 均 為5mmol／L，考察這7種金屬離子對(duì)酶活性的影響。

1．6．4 酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究 以不同濃度的ONPG 為底物，以Tris－HCl為緩沖液（pH 7．1），在25 ℃測(cè)不同濃度底物的反應(yīng)速率。以底物濃度的倒數(shù)1／［S］為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)速率的倒數(shù)1／V 為縱坐標(biāo)，作圖，得到Km、Vmax的值。

2 結(jié)果與分析

2．1 鹽析

硫酸銨分級(jí)沉淀結(jié)果見圖1。由圖1可知，在20%飽和度時(shí)，上清液中的酶活力很高，在硫酸銨飽和度40%以上時(shí)，上清液中的酶活很弱。綜合考慮酶的純化倍數(shù)和回收率，選擇20%～40%飽和度進(jìn)行硫酸銨分級(jí)沉淀，將得到的沉淀用20mmol的Tris－HCl緩沖液（pH 7．5）重溶。

圖1 鹽析曲線Figure1 Salting－out curve

圖2 Phenyl Sepharose CL－4B疏水層析Figure2 Phenyl Sepharose CL－4Bhydrophobic interaction chromatography

圖3 Q Sepharose High Performance陰離子交換層析Figure3 Q Sepharose High Performance anion exchange chromatography

2．2 Phenyl Sepharose CL－4B疏水層析的結(jié)果

Phenyl Sepharose CL－4B洗脫曲線見圖2。由圖2可知，分離得到3個(gè)較大的蛋白峰，收集后酶活性檢測(cè)到第3個(gè)蛋白峰有酶活性，酶活峰與蛋白峰重合。酶活出峰位置出現(xiàn)在低鹽洗脫階段，說明目標(biāo)蛋白疏水性較強(qiáng)。從洗脫曲線來看，疏水層析效率較高，除去了大量的雜蛋白。

2．3 Q Sepharose High Performance陰離子交換層析

Q Sepharose High Performance陰離子交換層析洗脫曲線見圖3。由圖3可知，圖中出現(xiàn)2個(gè)峰，收集后酶活性檢測(cè)到第2個(gè)峰有酶活，根據(jù)線性洗脫曲線顯示，第2個(gè)峰出峰位置出現(xiàn)在NaCl濃度為0．45～0．60mol／L處。酶活峰與蛋白峰重合，酶活峰比較集中，離子交換層析去除一部分雜蛋白。

2．4 Sephacryl S－200High Resolution凝膠過濾層析結(jié)果

Sephacryl S－2 0 0High Resolution凝 膠 過 濾 層 析 結(jié) 果見圖4。由圖4可知，凝膠過濾層析出現(xiàn)2個(gè)峰，經(jīng)酶活性檢測(cè)到第2個(gè)峰有酶活性，酶活曲線與蛋白曲線重合，酶活峰比較集中，凝膠過濾層析的純化效率較高。

2．5 酶的純化結(jié)果

由表1可知，經(jīng)過4 步純化最終得到純化倍數(shù)為35．6的低溫乳糖酶，得率為21．3%。

2．6 相對(duì)分子量的測(cè)定

純化后的酶液，通過SDS－PAGE 分析，得到單一條帶見圖5。由圖5可知，得到的低溫乳糖酶已經(jīng)達(dá)到電泳純。SDS－PAGE通過凝膠成像分析軟件Image lab 3．0計(jì)算得表觀分子量為57．3kDa。

圖4 Sephacryl S－200High Resolution凝膠過濾層析Figure4 Sephacryl S－200High Resolution gel filtration chromatography

表1 Rahnella sp．R3的低溫β－半乳糖苷酶分離純化Table1 The purification of a new cold－adapted lactase fromRahnella sp．R3

圖5 純化的低溫β－半乳糖苷酶SDS－PAGE圖Figure5 SDS－PAGE pattern of purifiedβ－galactosidase

2．7 低溫乳糖酶酶學(xué)性質(zhì)

2．7．1 酶的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性 在pH 7．5條件下，4～65 ℃測(cè)定酶活力與溫度的關(guān)系。由圖6可知，作用溫度為45 ℃時(shí)該酶具有最高酶活，故確定該酶的最適作用溫度為45℃；15℃下的酶活為最高酶活的40%，4℃下是最高酶活的23%。由圖7可知，該酶對(duì)熱敏感，45℃保溫45min酶活幾乎全部喪失。在4，15，25 ℃溫度下保溫90min，酶活保留率均在90%以上，說明該酶在4，15，25 ℃溫度下穩(wěn)定性較好。

圖6 溫度對(duì)酶活性的影響Figure6 Effect of temperature on enzyme activity

圖7 溫度對(duì)酶穩(wěn)定性的影響Figure7 Effect of temperature on the stability of enzyme

圖8 pH 對(duì)酶活性的影響Figure8 Effect of pH on enzyme activity

圖9 pH 對(duì)酶穩(wěn)定性的影響Figure9 Effect of pH on the stability of enzyme

2．7．2 酶的最適pH 及pH 的穩(wěn)定性 由圖8可知，該酶在pH 6．5～7．5時(shí)酶的活性較高，該酶的最適pH 為7．0。由圖9可知，在25 ℃、pH 6．5～7．5維持24h，酶活保持86%以上，即在pH 6．5～7．5時(shí)該酶具有較高的穩(wěn)定性。

2．7．3 金屬離子對(duì)酶活力的影響 由圖10可知，5mmol／L Na＋、Ca2＋、Cu2＋、Al3＋、Zn2＋對(duì)酶活力有不同程度的抑制作用，其中Al3＋抑制作用最強(qiáng)，Na＋、Ca2＋抑制作用不明顯。5mmol／L Mg2＋、K＋對(duì)酶活力具有促進(jìn)作用，其中Mg2＋促進(jìn)作用較強(qiáng)，使其酶活提高到1．19倍。

圖10 金屬離子對(duì)酶活性的影響Figure10 Effect of metal ions on enzyme activity

2．7．4 動(dòng)力學(xué)Km值及Vmax的測(cè)定 以不同濃度的ONPG為底物，以Tris－HCl為緩沖液（pH 7．1），在25 ℃測(cè)不同濃度底物時(shí)的反應(yīng)速率。以底物濃度的倒數(shù)1／［S］為橫坐標(biāo)，以反應(yīng)速率的倒數(shù)1／V 為縱坐標(biāo)作圖見圖11，計(jì)算得Km值為4．64mmol／L，Vmax為7．19mol／（min·mL）。

圖11 純化的低溫β－半乳糖苷酶的Lineweaver－Burk 圖Figure11 Lineweaver－Burk pattern of purified β－galactosidase

3 結(jié)論

產(chǎn)低溫乳糖酶的耐冷菌Rahnella sp．R3是從天山凍土中篩選得到的一株野生菌，且所產(chǎn)的胞內(nèi)低溫乳糖酶的酶量很低，通過四步純化步驟純化得到低溫乳糖酶。低溫酶在高溫下很難保持酶活，整個(gè)純化過程均在4 ℃層析柜中進(jìn)行，最終得到純化倍數(shù)35．6%，產(chǎn)率21．3%。通過SDS－PAGE電泳分析，顯示為單帶，表觀分子量為57．3kDa。對(duì)酶學(xué)性質(zhì)的研究表明，該酶酶活在pH 6．5～7．5范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，且Ca2＋對(duì)于酶活的抑制作用不明顯，這為該酶在乳制品中應(yīng)用提供了條件。然而野生菌中酶產(chǎn)量較低，可通過構(gòu)建工程菌手段來提高產(chǎn)量。而該酶的基因序列未知，需通過純化得到純酶后進(jìn)行氨基酸序列測(cè)定，利用氨基酸序列設(shè)計(jì)引物，再結(jié)合分子手段可以得到編碼該酶的基因序列，為后期分子工作的開展和低溫乳糖酶的大規(guī)模生產(chǎn)提供了條件。

目前，國(guó)內(nèi)外研究的大多數(shù)低溫β－半乳糖苷酶產(chǎn)生菌為節(jié)桿菌（arthrobacter）［10，11］和交替假單胞菌（Pseudoalteromonas）［12－14］。本研究中產(chǎn)低溫乳糖酶的耐冷菌Rahnella sp．R3屬于拉恩氏屬［15］，純化所得到的酶與新疆石河子大學(xué)從新疆低溫環(huán)境分離篩選到的低溫乳糖酶產(chǎn)生菌Rahneua aquatilis sp．14．1［16］進(jìn) 行 比 較，發(fā) 現(xiàn) 該 酶 的 純 化 倍 數(shù)為35．6，明顯高于其純化倍數(shù)4．19，取得了更好的純化效果。SDS－PAGE電泳結(jié)果顯示表觀分子量為57．3kDa，不同于其表觀分子量60kDa。在酶學(xué)性質(zhì)方面，該酶最適反應(yīng)溫度為45 ℃，45 ℃保溫45 min酶活全部喪失，純酶最適反應(yīng)pH 值為6．5～7．5，Rahneua aquatilis sp．14．1所產(chǎn)的低溫乳糖酶，酶的最適反應(yīng)溫度為35 ℃，45 ℃保溫2h，酶完全失去活力，最適反應(yīng)pH 值為6．5～7．0均有所不同。

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