微囊藻毒素的危害及其分析方法研究進(jìn)展

張庭廷，張勝娟

(安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241000)

微囊藻毒素的危害及其分析方法研究進(jìn)展

張庭廷1，張勝娟2

(安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 蕪湖 241000)

微囊藻毒素在藍(lán)藻水華污染中是出現(xiàn)頻率高、產(chǎn)量大、危害最為嚴(yán)重的藍(lán)藻毒素，其污染已成為亟待解決的全球性環(huán)境問題.本文結(jié)合國(guó)內(nèi)外最新相關(guān)文獻(xiàn)，綜述了微囊藻毒素的產(chǎn)生機(jī)理、理化性質(zhì)，并詳細(xì)介紹了微囊藻毒素對(duì)生物體(動(dòng)物、植物、微生物及人類)的危害及微囊藻毒素測(cè)定方法的研究進(jìn)展，最后對(duì)微囊藻毒素的測(cè)定分析技術(shù)和污染防治的發(fā)展方向進(jìn)行了展望.

微囊藻毒素；藍(lán)藻；毒性；HPLC；ELISA

藍(lán)藻是一種廣泛分布于淡水、海水和陸生環(huán)境的光能自養(yǎng)型革蘭氏陰性微生物，常在夏季富營(yíng)養(yǎng)化的水體中大量繁殖，并形成一層藍(lán)綠色、有腥臭味的浮沫，稱為“水華”.微囊藻毒素(Cicrocystins, MCs)在藍(lán)藻水華污染中是出現(xiàn)頻率高、產(chǎn)量大、危害最嚴(yán)重的一類藍(lán)藻毒素，主要是藍(lán)藻微囊藻、魚腥藻、顫藻和念珠藻等產(chǎn)生的次級(jí)代謝物[1].迄今已發(fā)現(xiàn)90多種MCs異構(gòu)體，均具有肝毒性，其中毒性較強(qiáng)、產(chǎn)量較大的MCs是MC-LR、MC-RR和MC-YR[2].所有MCs均屬于胞內(nèi)毒素，通常對(duì)數(shù)期合成明顯增加，對(duì)數(shù)末期達(dá)到最大含量，藻細(xì)胞死亡解體時(shí)，胞內(nèi)毒素就被釋放出來，造成水質(zhì)惡化并威脅野生動(dòng)植物及人類健康.

1 微囊藻毒素的產(chǎn)生及其理化性質(zhì)

MCs是一種單環(huán)七肽，結(jié)構(gòu)相當(dāng)穩(wěn)定，不易沉淀，不易被沉淀物和懸浮顆粒物吸附，在水中的溶解度>1g/L，具有水溶性和耐熱性.常規(guī)條件下MCs很難被去除，然而，在陽光和光敏劑存在時(shí)，自然水體中的MCs可發(fā)生光催化以促進(jìn)其降解.富營(yíng)養(yǎng)化水體因其透明度低、濁度高，光降解作用很微小.

MCs是通過非核糖體途徑合成的.合成MCs的結(jié)構(gòu)基因在其基因組中以基因簇形式存在，稱為微囊藻毒素合成酶基因簇(mcy)[3].mcy基因簇含有2個(gè)反向轉(zhuǎn)錄的相鄰操縱子，包括10個(gè)開放閱讀框(ORF)，分別為：mcyD-mcyJ，mcyA-mcyC.整個(gè)基因簇編碼一系列的酶，并組成一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，通過各種酶的相互作用最終合成MCs.MCs擁有細(xì)胞外信號(hào)分子的功能，當(dāng)部分藍(lán)藻因受環(huán)境因素誘發(fā)歷經(jīng)細(xì)胞凋亡和裂解時(shí)，胞內(nèi)MCs和其它的二級(jí)肽即被釋放；同時(shí)，該環(huán)境壓力信號(hào)能被剩余藍(lán)藻群體所感知，并通過調(diào)節(jié)MCs的生物合成，增強(qiáng)群體在環(huán)境中的適應(yīng)性[4].

研究顯示[5]，在產(chǎn)毒銅綠微囊藻(toxicMicrocystissp. KLL MG)藻液中，添加加頓多甲藻(Peridiniumgatunense)濾液，將使約75%銅綠微囊藻細(xì)胞溶解，同時(shí)，促使其余存活的微囊藻細(xì)胞McyB基因的轉(zhuǎn)錄活性增加.進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用銅綠微囊藻細(xì)胞抽提物或MC-LR處理銅綠微囊藻，藻細(xì)胞內(nèi)累積的MCs和McyB明顯比對(duì)照組多，這說明微囊藻細(xì)胞溶解，釋放出MCs和其它肽，誘導(dǎo)了大量McyB的基因轉(zhuǎn)錄，提高了剩余微囊藻細(xì)胞中McyB和MCs的生產(chǎn)效率[6].此外，本課題組研究還發(fā)現(xiàn)，在某些抑藻物質(zhì)如亞油酸存在時(shí)，MCs轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)的MC-RR亦增加[7].

2 微囊藻毒素的危害

2.1微囊藻毒素對(duì)植物及其它藻類的危害

MCs是一種生態(tài)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素，可促使藍(lán)藻獲得競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì).高濃度MCs通過對(duì)水生植物產(chǎn)生化感作用與氧化脅迫而影響水生植物種類的多樣性；MCs還可通過參與浮游植物種間的相互作用與種群調(diào)節(jié)改變浮游植物的群落結(jié)構(gòu).如，MC-LR可以改變蘆葦幼苗的微觀結(jié)構(gòu)，并致使植株根部出現(xiàn)異常[8].又如，MC-LR以一種濃度依賴性方式，抑制除自身以外的所有藍(lán)藻的生長(zhǎng).MC-LR可在很多位點(diǎn)活動(dòng)，并通過能量約束干擾灰色念珠藻(Nostocmuscorum)、地木耳(Nostoccommune)、筒形魚腥藻(Anabaenadoliolum)和大型筒孢藻(Cylinderospermummajus)等的固氮作用、呼吸作用及光合作用[9].將與根瘤菌共生的蠶豆幼苗暴露在銅綠微囊藻抽提物中，發(fā)現(xiàn)其影響蠶豆的生理和生物活性，降低蠶豆的光合活性，根瘤數(shù)和氮同化性[10].

2.2微囊藻毒素對(duì)動(dòng)物的影響

長(zhǎng)期暴露于MCs的魚類、蝦蟹等水生動(dòng)物也會(huì)受MCs危害.例如，MC-RR、MC-LR和MC-YR可在維多利亞湖羅非魚(Oreochromisniloticus)的不同器官(腸道、肌肉和肝臟)中富集[11].分別以兩種藻類(藍(lán)藻為可產(chǎn)毒的水華魚腥藻，綠藻為月牙藻)飼養(yǎng)淡水貝類，就會(huì)發(fā)現(xiàn)，喂食水華魚腥藻的貽貝體內(nèi)乙酰膽堿酯酶和脂質(zhì)過氧化酶活性均比用月牙藻飼養(yǎng)的貽貝高，即造成能量消耗和氧化應(yīng)激性[12].

研究還發(fā)現(xiàn)MCs主要以結(jié)合蛋白形式在牙漢魚(Odontesthesbonariensis)的肝臟和腸等組織中快速累積，隨后雖可通過這些組織被消化，但也會(huì)使這些組織受到損傷[13].Lance等[14]以阿氏浮絲藻(Planktothrixagardhii)產(chǎn)生的去甲基化MCs(dmMC-LR、dmMC-RR)和MC-YR處理椎實(shí)螺體(Lymnaeidae)，則其腹足、精子和卵母細(xì)胞中出現(xiàn)MCs富集，并導(dǎo)致其消化腺和腎受損.另外，MCs還會(huì)對(duì)雄性兔子的生殖系統(tǒng)產(chǎn)生毒性損傷[15].總之，MCs不僅以肝臟和腎臟為靶器官，還會(huì)向心臟和其他器官如神經(jīng)和腦部、呼吸系統(tǒng)、睪丸和附睪等發(fā)動(dòng)攻擊，破壞它們的結(jié)構(gòu)或功能.

2.3微囊藻毒素對(duì)人類的危害

國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究一致表明，MCs可破壞細(xì)胞內(nèi)的蛋白磷酸化平衡，改變多種酶活性，引起肝臟病變，具有強(qiáng)烈促肝癌作用.接觸和飲用受污染水體、食用受污染食物、口服受污染藍(lán)藻類保健品、尤其是食用富集MCs的水生動(dòng)物等，均可對(duì)人類健康帶來威脅[16].如曾飲用澳大利亞新南威爾士Malpas水庫之水的高肝損傷率、我國(guó)廈門市同安地區(qū)、江蘇海門市、東南沿海地區(qū)的高肝癌死亡率、巴西Carurau腎透析事件等均與MCs污染相關(guān)[17].無論是純的MCs、濃縮物還是其稀釋水樣都能給人外周血淋巴細(xì)胞DNA帶來不同程度的傷害，且劑量越大，損傷越重[18].

Chen等[19]以巢湖35個(gè)專業(yè)漁民為對(duì)象，研究了慢性MCs暴露對(duì)其健康的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，漁民血清中均存在MCs，且其在血清中的含量與主要肝功能指標(biāo)呈正相關(guān).此外，研究還發(fā)現(xiàn)[20]，烹飪會(huì)加劇鯉魚肌肉中的MCs對(duì)食用者的危害.

3 微囊藻毒素的檢測(cè)方法

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)水體中MCs的檢測(cè)技術(shù)主要分為生物毒理檢測(cè)、化學(xué)分析、生物化學(xué)分析三大類.其中，生物毒理檢測(cè)是通過對(duì)動(dòng)物注射給毒進(jìn)行藻毒素毒性的鑒定；化學(xué)檢測(cè)技術(shù)依賴于薄層色譜(TLC)、氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、液相色譜/質(zhì)譜分析(LC-MS)及毛細(xì)管電泳等化學(xué)檢測(cè)手段，可對(duì)藻毒素精確定性和定量；生物化學(xué)分析主要包括酶聯(lián)分析法(ELISA)、蛋白磷酸酶抑制分析法(PPIA)、免疫檢測(cè)法、蛋白磷酸酶抑制法-比色法、放射性免疫等方法，同時(shí)具有分析速度快和較高的靈敏度.

此外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR在MCs被釋放之前，能夠?qū)ξ⒛以宓漠a(chǎn)毒能力進(jìn)行判斷，為高危水體的早期監(jiān)測(cè)和評(píng)估提供保障.下面結(jié)合最新研究進(jìn)展，對(duì)應(yīng)用較廣泛的幾種檢測(cè)方法和微囊藻的產(chǎn)毒能力檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行詳細(xì)介紹.

3.1蛋白磷酸酶抑制法

MCs能抑制蛋白磷酸酶PP1和PP2A的活性，依據(jù)這種特異性抑制程度對(duì)MCs進(jìn)行檢測(cè)的方法，稱為蛋白磷酸酶抑制法.該方法在分析測(cè)定時(shí)多數(shù)以32P標(biāo)記的糖原磷酸化酶a為底物，此底物只能被PP1和PP2A水解，而PP1和PP2A又可被MCs等抑制.最后根據(jù)蛋白磷酸酶水解糖原磷酸化酶a釋放出32P的量來計(jì)算毒素的量.

這種方法靈敏度高、測(cè)定用時(shí)短、適宜于環(huán)境檢測(cè)，但它只反映MCs總量，不能用于藻毒素同系物的鑒別.Covaci等[21]在人工神經(jīng)網(wǎng)(artificial mearal network)基礎(chǔ)上進(jìn)行酶抑制試驗(yàn)，可辨別MC-LR和MC-YR，且其分析混合物的濃度范圍是8-98pM MC-LR和31-373pM MC-YR，理想狀態(tài)的最佳檢測(cè)極限是21.2pM MC-LR.

3.2酶免檢測(cè)法

酶聯(lián)免疫測(cè)定(ELISA)是根據(jù)抗體對(duì)抗原的特異性識(shí)別，通過MCs誘發(fā)免疫反應(yīng)來對(duì)各種毒素進(jìn)行檢測(cè)的，水體中MCs的檢測(cè)，不需要樣品預(yù)濃縮.該方法靈敏性高、特異性強(qiáng)，在具備MCs抗體、標(biāo)準(zhǔn)純毒素和有關(guān)試劑的前提下，可用于大批量樣品的初篩，簡(jiǎn)單快捷.Theerasak等[22]采用ELISA對(duì)泰國(guó)四個(gè)娛樂水體中的MCs和擬柱孢藻毒素進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其平均最高含量分別達(dá)為0.913μgL-1和0.463μgL-1.

該法針對(duì)的是MCs的功能，測(cè)定的是具有相同功能的MCs總量，如檢測(cè)所用的某種抗體對(duì)MCs其他異構(gòu)體的親和性較低，則不能檢測(cè)出所有的毒素.此外，易出現(xiàn)假陽性，識(shí)別MCs異構(gòu)體的廣譜抗體缺乏，試劑盒可靠性也有待進(jìn)一步檢驗(yàn)[23].

3.3高效液相色譜法

高效液相色譜法(HPLC)是利用MCs的物化性質(zhì)和光電技術(shù)對(duì)其進(jìn)行定性、定量分析.常用配有紫外可見光檢測(cè)器的反相-HPLC，以固定相和流動(dòng)相來鑒別待測(cè)樣品中MCs異構(gòu)體.一般采用C18為填料的反相柱或HLB小柱，而HLB的回收率較高.在實(shí)際操作中常采用多種流動(dòng)相，這樣能鑒別10種以上極性不同的MCs同分異構(gòu)體[23].該法準(zhǔn)確度和靈敏度高，重現(xiàn)性好，能對(duì)不同MCs進(jìn)行定性和定量；缺點(diǎn)是MCs需預(yù)處理和專業(yè)操作人員.

李錚等[24]通過研究固相萃取、富集、凈化這些環(huán)節(jié)，對(duì)前處理及HPLC分析方法進(jìn)行優(yōu)化，使水體樣品中MC-RR、MC-YR和MC-LR均可被檢測(cè).Elbert 等[25]制備的胍鹽末端分子印跡聚合物，對(duì)[精氨酸]-MCs的胍鹽末端具有較強(qiáng)的識(shí)別能力，能夠用于鑒別和提取水中所有[精氨酸]-MCs.因此，它的合成對(duì)固相萃取、液相色譜電噴霧質(zhì)譜法鑒別所有[精氨酸]-MCs提供了基礎(chǔ).

3.4液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法

質(zhì)譜(MS)可根據(jù)待測(cè)樣品離子的質(zhì)荷比來精確測(cè)定微量毒素的相對(duì)分子質(zhì)量，因此，近幾年來，出現(xiàn)了很多液相色譜與各種形式質(zhì)譜串聯(lián)進(jìn)行MCs檢測(cè)的技術(shù).如液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS)技術(shù)在僅知毒素分子量，缺乏標(biāo)準(zhǔn)毒素的條件下，就能對(duì)樣品進(jìn)行定量[26].此方法不受標(biāo)準(zhǔn)品的限制，靈敏性高、選擇性和可靠性高，還能同時(shí)分析出多種MCs，適宜于水域中痕量和超痕量MCs的定性定量[27].但技術(shù)含量高、設(shè)備昂貴、需要專業(yè)人員操作等要求限制了它的廣泛使用.

3.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

在微囊藻毒素被釋放之前，上述檢測(cè)技術(shù)均無法對(duì)微囊藻的產(chǎn)毒能力進(jìn)行判斷，若能通過早期監(jiān)測(cè)高危水體，評(píng)估由產(chǎn)毒微囊藻引發(fā)藍(lán)藻水華的風(fēng)險(xiǎn)，則對(duì)微囊藻毒素的污染防治具有重大實(shí)用價(jià)值.

而實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法.Juliana等[2]在測(cè)序了MCs合成酶mcyD基因的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)mcyD特異片段的引物，采用qRT-PCR評(píng)估水樣中MCs生產(chǎn)者——藍(lán)藻的數(shù)量.該方法具有效率高、引物特異性強(qiáng)，并能檢測(cè)不同藍(lán)藻屬物種.Kyoung-Hee等[28]通過設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增樣品中mcyA基因，將qRT-PCR進(jìn)行開發(fā)和優(yōu)化，可用于評(píng)估產(chǎn)生MCs的銅綠微囊藻在混合藍(lán)藻種群中的比例.因此，采用qRT-PCR技術(shù)可進(jìn)行早期和有效地監(jiān)測(cè)高危水體，以此評(píng)估由產(chǎn)毒微囊藻引發(fā)藍(lán)藻水華的風(fēng)險(xiǎn)性.

4 展望

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，水體富營(yíng)養(yǎng)化的加劇，淡水湖泊藻類水華發(fā)生的頻率和程度都呈快速增長(zhǎng)的趨勢(shì).研究表明，MCs對(duì)植物、藻類、動(dòng)物以及人類都具有嚴(yán)重危害，其污染是全球共同面臨的一個(gè)環(huán)境難題；本文從MCs的檢測(cè)方法及其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估兩個(gè)方面提出以下見解.

(1)生物化學(xué)分析技術(shù)與化學(xué)檢測(cè)手段聯(lián)用將是MCs檢測(cè)方法的一個(gè)發(fā)展方向.目前MCs分析方法受各方面的束縛，都無法廣泛應(yīng)用于實(shí)踐，因此具體實(shí)踐中要靈活運(yùn)用、取長(zhǎng)補(bǔ)短.如ELISA和HPLC各具特色，較理想的檢測(cè)程序是先用ELISA對(duì)水樣進(jìn)行初步快速檢測(cè)，若含有藻毒素，再應(yīng)用化學(xué)檢測(cè)技術(shù)HPLC對(duì)其進(jìn)行鑒定和含量測(cè)定，這樣就充分將前者的前處理要求低、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高和后者的準(zhǔn)確定性定量等優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來了.

(2)要重視對(duì)富養(yǎng)化水環(huán)境進(jìn)行早期監(jiān)測(cè)和MCs發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估.在了解MCs的起源、特性和危害后，更應(yīng)該重視對(duì)富養(yǎng)化水環(huán)境進(jìn)行早期監(jiān)測(cè)，可利用qRT-PCR方法對(duì)毒微囊藻是否產(chǎn)毒進(jìn)行早期評(píng)估，采用有效的生物學(xué)方法對(duì)藍(lán)藻水華進(jìn)行治理[29-30]，從而降低藍(lán)藻尤其是MCs對(duì)水環(huán)境的影響，保證水環(huán)境安全，確保人類的健康和生命安全.

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TheResearchProgressofMicrocystins'sHarmandItsAnalysisTechniques

ZHANG Ting-ting，ZHANG Sheng-juan，

(The Key Laboratory of Biotic Environment and Ecological Safety in Anhui Province, College of Life Sciences, Anhui Normal University, Wuhu 241000, China)

Microcystins is a kind of algae toxins which occurs in high frequency, produces a mass of toxin production, results in the most serious consequence to the pollution of cyanobacterial blooms. The forming mechanisms has become a global environmental issue which needs to be solved. Based on the latest related literatures at home and abroad, this article not only summarized the production and mechanism of microcystins, physical and chemical properties, but also introduced the research progress of its analysis methods as well as the hazards of microcystins to organisms (animals, plants，microorganisms and human) in detail. At last, the development direction of determination analysis technology of microcystins and its pollution control were prospected.

microcystins； cyanobacteria； toxicity； HPLC； ELISA

2013-09-08

國(guó)家自然科學(xué)基金(31170443).

張庭廷(1955-)，女，安徽東至人，教授，博士.

張庭廷，張勝娟.微囊藻毒素的危害及其分析方法研究進(jìn)展[J].安徽師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014，37(1)：53-57.

Q143

A

1001-2443(2014)01-0053-05