急性髓細胞白血病微小殘留病的不同檢測方法及臨床意義的研究進展

潘登

中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液科，沈陽 110001

急性髓細胞白血病微小殘留病的不同檢測方法及臨床意義的研究進展

潘登#

中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液科，沈陽 110001

急性髓細胞白血病是一大類異質(zhì)性疾病，預后差別較大，微小殘留病檢測對該病的預后判斷有重要意義。近年來，采用定量PCR方法檢測融合基因和基因突變、采用流式細胞術(shù)方法檢測異常抗原表達及染色體異常等指標判斷微小殘留病的研究取得了一定進展。盡管目前對于具體的檢測方法和檢測結(jié)果的臨床意義評估尚有爭論，但多數(shù)研究顯示微小殘留病與疾病的復發(fā)高度相關(guān)。本文綜述了不同檢測方法的優(yōu)缺點及不同時機不同檢測結(jié)果的臨床意義，并進一步探討了未來的研究方向及這些研究結(jié)果在我國的應用前景。

急性髓細胞白血病;微小殘留病;融合基因;流式細胞術(shù)

急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia，AML，不包括M3)是一大類異質(zhì)性疾病，預后差別較大。獲得形態(tài)學的完全緩解是急性髓細胞白血病患者獲得徹底治愈的前提，但僅僅獲得形態(tài)學緩解不能保證患者得到治愈。潛在的或隱藏的白血病細胞在患者體內(nèi)殘留被稱為微小殘留病(minimal residual disease，MRD)。MRD的檢測有助于判斷患者體內(nèi)白血病的真實狀態(tài)，對于某些特定類型的白血病(急性早幼粒細胞白血病和慢性粒細胞白血病)已被用于指導治療，在急性淋巴細胞白血病的治療中也有重要意義［1-3］。但對于AML患者而言，MRD的檢測方法及其臨床意義均在研究中，可檢測的項目包括融合基因、基因突變或過表達以及異常的免疫表型等。

1 融合基因

融合基因指的是由于染色體易位，兩段本不相連的基因錯誤相連形成的在正常情況下檢測不到的基因片段。檢測融合基因是目前應用最廣泛的AML MRD的檢測方法［4］。約20%的成人AML患者有RUNX1-RUNX1T1(既往稱AML1-ETO)和CBFβ-MYH11融合基因的表達或MLL基因的易位，并且在兒童AML患者中的比例更高。檢測融合基因的標準方法為實時定量PCR，該方法的靈敏度在0.1%～0.001%之間。

該方法的優(yōu)點是靈敏度較高;缺點包括:①僅有20%的AML患者可采用，不能普遍應用;②檢測所得為克隆數(shù)，由于單個細胞產(chǎn)生的克隆數(shù)不清，自然也就無法判斷體內(nèi)究竟有多少殘存的AML細胞;③某些已經(jīng)失去克隆增生能力的白血病細胞也可能持續(xù)表達這些融合基因，所以檢測陽性的患者并不代表必然未獲治愈［5］。

盡管多數(shù)研究證實融合基因可作為MRD的檢測指標，但不同研究采用的標準和檢測時間差別較大。一項對53例CBFβ-MYH11陽性的AML患者的研究發(fā)現(xiàn)，在鞏固治療期間出現(xiàn)至少一次該融合基因陰性的患者2年無病生存率較高(79%vs 54%)［6］。另一項278例患者的研究發(fā)現(xiàn)，誘導治療后融合基因轉(zhuǎn)錄水平下降少于3個數(shù)量級提示復發(fā)率高［7］。對15例RUNX1-RUNX1T1陽性患兒的研究發(fā)現(xiàn)，治療期間融合基因表達的增高提示更高的復發(fā)率［8］。對MLL基因的研究也發(fā)現(xiàn)治療后該融合基因陰性的患者預后相對好［9］。但也有研究認為單一的檢測數(shù)值或連續(xù)的變化指標與復發(fā)并無必然聯(lián)系［10-11］。盡管通過檢測融合基因判斷MRD已獲公認，但究竟如何確定檢測時間以及采用何種指標進行判斷目前尚無統(tǒng)一標準。而且目前的研究多集中于一些常見的融合基因，盡管從理論上推測，少見的融合基因也應具有類似意義，但目前尚無明確的研究支持這一推測。

2 基因突變或過表達

約30%的患者可以檢測到NPM基因的突變，25%的患者具有FLT3內(nèi)部串聯(lián)重復(FLT3-internal tandem duplications，F(xiàn)LT3-ITD)，20%的患者有DNMT3A基因突變［12］?；蛲蛔兛梢宰鳛镸RD的檢測方法。其優(yōu)缺點與檢測融合基因類似，但需注意的是由于基因突變的不穩(wěn)定性，許多復發(fā)的AML患者可能不再具有先前的突變，使得該方法的靈敏度受到一定影響。據(jù)報道，具有FLT3-ITD的患者在復發(fā)時，約1/4的患者不再能檢測到該突變，對于NPM突變，這一比例為10%［13-14］。

NPM突變是最早用于MRD檢測的基因突變，有研究對245例具有該突變的AML患者選擇不同的檢測點進行了比較。誘導治療后突變檢測轉(zhuǎn)陰的患者4年復發(fā)率僅為6.5%(陽性者為53%);而鞏固治療后轉(zhuǎn)陰的患者該比率為15.7%(陽性者為66.5%)［15］。其他的一些研究結(jié)論類似，同時有研究認為該指標較后文提到的WT1基因的檢測更靈敏［16］。

另一個可能用于MRD檢測的基因是Wilms′瘤基因(WT1)。由于有70%～90%的AML患者有該基因的過表達，檢測該基因可能適于多數(shù)患者。但由于該基因在正常人群有基礎表達，而AML患者經(jīng)過誘導治療后該基因的表達迅速下降，如要保證此時的表達仍高于正常人群，患者發(fā)病時該基因的表達至少應達到正常人群的100倍(發(fā)病時該基因的表達越低，靈敏度越差)。實際上對于骨髓樣本可能僅有10%～20%患者滿足這一條件，限制了該方法的應用。盡管如此，也有少量研究顯示治療后該基因表達下降迅速者預后好［17］。

3 異?？乖瓩z測

通過流式細胞術(shù)檢測AML細胞表達的異?？乖蓞^(qū)分AML細胞與正常骨髓細胞。約90%的AML患者可以采用這種方法檢測MRD。如果采用更先進的技術(shù)(6～8通道)或新發(fā)現(xiàn)的抗體可能使檢測的靈敏度達到0.1%甚至0.01%。該方法的缺點是需要專業(yè)的操作者進行操作，與ALL相比AML患者需要檢測的抗體更多，各實驗室技術(shù)缺乏統(tǒng)一標準等。

與其他方法相似，不同的研究也報道了在不同的時期檢測的結(jié)果與預后的關(guān)系。有研究顯示在首次化療結(jié)束后使用流式細胞術(shù)檢測MRD，根據(jù)表達量將患者分為三組，表達量分別為＜0.1%組、0.1%～0.5%組和＞0.5%組，三組的3年無復發(fā)生存(relapse-free survival，RFS)率分別為85%、64%和14%［18］。一項對誘導緩解后的188例兒童AML的研究發(fā)現(xiàn)，46例患兒MRD仍為陽性，其3年RFS率僅有30%，明顯低于陰性組的65%［19］。鞏固治療結(jié)束后的檢測結(jié)果與此類似，一項對137名染色體屬于預后良好和預后中等的患者的研究發(fā)現(xiàn)，鞏固治療結(jié)束后，僅有32%的患者采用流式細胞術(shù)分析MRD為陰性，陰性組和陽性組的復發(fā)率分別為27%和74%，兩者有明顯差異［20］。

4 其他方法以及不同方法聯(lián)合應用

約55%的AML患者發(fā)病同時存在染色體的異常，該異常通常用來判斷患者的預后，但在某些情況下也可以作為MRD檢測的手段。MD Anderson的一項研究發(fā)現(xiàn)誘導治療后獲得CR的患者如仍可檢測到染色體異常(71%)，則RFS期和總生存期(overall survival，OS)都更短，而干細胞移植可以延長此類患者的RFS期［21］。該研究與前期的兩項研究的結(jié)論相同，但究竟該在何時(誘導后、鞏固后還是移植前)檢測MRD仍不確定。該方法優(yōu)點是超過一半的AML患者可采用，費用較低，各實驗室的操作方法差異不大。缺點是操作費時，靈敏度差(通常檢測20個間期細胞，陽性率可理解為5%)，以及必須要有足夠的間期細胞。雖然FISH方法可以進一步提高檢測的靈敏度，也不需要間期細胞，但操作更為復雜，費用也更高，難以廣泛開展。

將不同檢測方法相結(jié)合也是臨床常用的方法。通常融合基因的檢測結(jié)論與流式細胞術(shù)的檢測結(jié)論具有較好的一致性，不過由于一個細胞可能產(chǎn)生多個克隆，所以融合基因的檢測方法較流式方法更為靈敏。一項對80例患者的508次樣本的檢測證實了這一點，對于429個融合基因表達低于0.1%的樣本，98%的樣本經(jīng)流式細胞術(shù)檢測所得結(jié)果也低于0.1%。而對于另外79個融合基因表達高于0.1%的樣本，75%的流式檢測結(jié)果仍低于0.1%［11］。還要注意MRD檢測與形態(tài)學結(jié)論也可能并不完全一致。一項研究發(fā)現(xiàn)形態(tài)學緩解的患者經(jīng)流式細胞術(shù)檢測所得結(jié)果中惡性細胞可能超過5%，而形態(tài)學未緩解的患者也可能被流式細胞術(shù)檢測證實為完全緩解，并獲得長期生存，提示綜合多項檢查的必要性［19］。

5 總結(jié)和展望

MRD檢測較普通的形態(tài)學方法能更好地預測復發(fā)，可用于早期判斷復發(fā)，篩選高?；颊撸蛴糜谀承┬滤幓蛐轮委煼绞降闹衅诏熜гu估，但在采用這些證據(jù)指導臨床治療的時候必須注意使用方法的局限性。不同方法在何時檢測更具有臨床意義尚有爭論。尤其需要強調(diào)的是，目前多數(shù)報道為國外研究，而我國AML治療方案與國外是有一定差別的，主要體現(xiàn)在誘導治療時柔紅霉素(DNR)的用量(國外多為60～90 mg/m2，我國多為45～60 mg/m2)和強化時阿糖胞苷(Ara-C)的用量(國外為大劑量，我國可選大劑量或中劑量)，治療的差別必然在一定程度上影響MRD的檢測結(jié)果及結(jié)果的臨床意義，所以對于國外的數(shù)據(jù)應進行理性分析，同時也應盡快開展我國AML MRD的相關(guān)研究。結(jié)合我國實際情況，對于一些目前已被廣泛接受的融合基因檢測，如RUNX1-RUNX1T1和CBFβ-MYH11等，應在推出規(guī)范治療的基礎上開展多中心的前瞻性研究［22］，篩選出在我國標準治療方案下可用于判斷預后的MRD指標，并在將來條件成熟后進一步根據(jù)這些指標開展分層治療。對于一些較新的檢測項目，可先由較大的血液腫瘤治療中心進行前期的探索性研究。另外，不同方法結(jié)論也可能會相互矛盾，此時需進行具體的綜合分析，不應盲目下結(jié)論，必要時應咨詢更專業(yè)的血液專科醫(yī)生。盡管MRD檢測用于判斷患者預后已獲肯定，但截至目前，尚無指南提出可根據(jù)這些檢測結(jié)果改變患者的治療方案。綜合各種MRD方法決定患者的治療，使某些復發(fā)率低的患者避免接受毒性較大的治療，同時復發(fā)率高的患者及時進行移植或其他治療從而提高AML的OS將是今后的發(fā)展方向。

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10.11877/j.issn.1672-1535.2014.12.01.06

#通信作者(Corresponding author)，e-mail:coacoq@sina.com

2013-05-06)