MDM2與抑制劑PDIQ 作用機(jī)制的結(jié)合自由能計(jì)算研究

時術(shù)華，張少龍，張慶剛

（1.山東建筑大學(xué)理學(xué)院，濟(jì)南250101；2.山東師范大學(xué)物理與電子科學(xué)學(xué)院，濟(jì)南250014）

1 引 言

近期的醫(yī)學(xué)臨床研究表明全世界眾多癌癥患者的體內(nèi)基本上都發(fā)現(xiàn)抑癌蛋白p53野生型功能的丟失.p53抑癌功能的丟失有兩種公認(rèn)的機(jī)制：（1）p53 蛋白內(nèi)部的定點(diǎn)突變；（2）腫瘤蛋白MDM2通過副反饋的方式與p53相互作用，抑制了p53的功能.研究發(fā)現(xiàn)50%的癌癥患者體內(nèi)存在MDM2 的 過 度 表 達(dá)［1，2］.因 此 干 擾p53 與MDM2的結(jié)合成為癌癥治療的新途徑.

MDM2與p53復(fù)合物的結(jié)晶結(jié)構(gòu)表明p53的三個疏水性殘基Phe19，Trp23 和Leu26 插入MDM2疏水性裂縫，從而與MDM2 形成疏水性相互作用.用于治療癌癥的藥物基本上都模仿了這個作用模式.幾個課題組設(shè)計(jì)的肽類抑制劑能與MDM2產(chǎn)生較強(qiáng)的相互作用，擁有納摩爾數(shù)量級的抑制效果［3，4］.Phan等人設(shè)計(jì)合成的肽類抑制劑PDIQ 展現(xiàn)了不錯的抑制效果，其IC50值達(dá)到8nM［5］.該結(jié)果表明抑制劑PDIQ 對MDM2有很強(qiáng)的抑制效果.故闡明該抑制劑與MDM2的作用機(jī)制有助于新型高效抑制劑的研發(fā).

分子動力學(xué)模擬和結(jié)合自由能計(jì)算已經(jīng)成為研究抑制劑與蛋白質(zhì)相互作用的重要工具［6-8］.盡管Phan等人從結(jié)構(gòu)上解釋了抑制劑PDIQ 的抑制能力，但未從原子層次上闡明抑制劑PDIQ 與MDM2的作用機(jī)制.因此本工作將蛋白質(zhì)庫的晶格結(jié)構(gòu) （3JZS）用作動力學(xué)模擬的初始結(jié)構(gòu)，且采用已成功用于研究生物體系的MM-PBSA 方法計(jì)算抑制劑PDIQ 與MDM2的結(jié)合自由能，解釋二者的結(jié)合模式［9-12］，從原子層次上研究了PDIQ與MDM2 的作用機(jī)制和MDM2 內(nèi)部殘基運(yùn)動.同時采用基于殘基的自由能分解方法計(jì)算抑制劑-殘基相互作用以便闡明PDIQ-MDM2復(fù)合物的結(jié)構(gòu)-親和能關(guān)系.我們期望該研究能為以p53-MDM2相互作用為靶標(biāo)的抗癌藥物設(shè)計(jì)提供理論上的指導(dǎo).

2 模型與計(jì)算

2.1 分子動力學(xué)模擬

用于動力學(xué)模擬的初始構(gòu)象取自蛋白質(zhì)庫的晶體結(jié)構(gòu) （3JZS）.圖1 給出PDIQ-MDM2 復(fù)合體的結(jié)構(gòu).復(fù)合物X-射線結(jié)構(gòu)中的水分子保留在初始化模型中，采用Amber 12 中的leap模塊添加晶體結(jié)構(gòu)中缺失的氫原子［13］；復(fù)合物的力場參數(shù)由Amber 12 中 的ff03 力 場 產(chǎn) 生［14］；PDIQMDM2復(fù)合體溶解在由5535個水分子組成的顯性水合子中，水分子的模為TIP3P；兩個氯離子添加到由水和復(fù)合體組成的系統(tǒng)中以確保整個系統(tǒng)維持電中性.

為消除系統(tǒng)中原子的不合理接觸，采用Amber12中的sander模塊對復(fù)合體體系執(zhí)行兩步的系統(tǒng)優(yōu)化：（1）采用150kcal／ （mol·?2）的力常數(shù)約束溶質(zhì)，以便優(yōu)化溶劑和中和離子；（2）無約束地優(yōu)化整個系統(tǒng)：每一步優(yōu)化均先執(zhí)行2000步的最陡下降優(yōu)化，接著執(zhí)行4000步的共軛梯度優(yōu)化.然后在200ps內(nèi)把系統(tǒng)從0K 加熱到300 K，隨后進(jìn)行100ps的常溫300K，常壓1標(biāo)準(zhǔn)大氣壓的動力學(xué)平衡；最后是10ns的無約束分子動力學(xué)模擬.模擬期間采用SHAKE方法限制所有含氫原子化學(xué)鍵的伸縮［15］，模擬積分步長為2fs，PME方法用來計(jì)算長程的靜電相互作用，應(yīng)用周期性邊界條件以消除溶劑盒子的邊緣效應(yīng)，非成鍵相互作用的截?cái)嘀禐?0.0?.

圖1 PDIQ-MDM2 復(fù)合體的結(jié)構(gòu).MDM2 和PDIQ 分別用桔色和青色表示，殘基Phe3′，Trp7′和Leu26′用棍棒方式顯示Fig.1 Structure of PDIQ-MDM2 complex.MDM2and PDIQ are showed in orange and green，respectively，the residues Phe3′，Trp7′and Leu10′are displayed in stick mode

2.2 MM-PBSA方法計(jì)算結(jié)合自由能

采用MM-PBSA 方法計(jì)算PDIQ 與腫瘤蛋白MDM2的結(jié)合自由能.從動力學(xué)最后2ns的軌跡中每隔20ps抽取的100個構(gòu)象用于結(jié)合自由能計(jì)算，結(jié)合自由能計(jì)算的公式可表示為：

式中ΔEMM是氣相中的分子力學(xué)能，ΔGsol表示溶解自由能對分子結(jié)合的貢獻(xiàn)，TΔS表示熵變對結(jié)合自由能的貢獻(xiàn).ΔEMM進(jìn)一步分成兩部分：

方程中的ΔEele和ΔEvdw分別表示靜電相互作用和范德瓦爾斯相互作用.溶解自由能ΔGsol也分解為兩個組成部分：

上式中ΔGpb和ΔGsurf分別是極性溶解自由能和非極性溶解自由能.前者可使用Amber中的pbsa方法求解泊松-玻爾茲曼方程獲得，溶質(zhì)和溶劑的電介常數(shù)分別設(shè)為1.0和80.0.后者由如下經(jīng)驗(yàn)方程計(jì)算：

式中γ和β值分別取為0.00542kcal／ （mol·?2）和0.92kcal／mol.TΔS是由于平動、轉(zhuǎn)動和振動自由度變化引起的熵變對結(jié)合自由能的貢獻(xiàn)，主要采用簡振模和傳統(tǒng)的熱力學(xué)計(jì)算TΔS.

表1 MM-PBSA 計(jì)算所得到的能量 （kcal／mol）aTable 1 Energies（in kcal／mol）calculated by MM-PBSA method a

2.3 相關(guān)矩陣計(jì)算

為了研究抑制劑結(jié)合誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)內(nèi)部運(yùn)動的相關(guān)聯(lián)程度，計(jì)算了相關(guān)矩陣 （Cij）.這一矩陣第i行j 列的元素Cij反映了第i，j殘基上Cα相對于其平均位置的漲落相關(guān)系數(shù)，通常由下列的方程確定：

式中尖括號表示對取樣的系綜平均，Δri表示第i個原子相對于其平均位置的偏差，Cij的變化范圍為-1到+1，正的Cij反映了殘基間的相關(guān)運(yùn)動，而負(fù)的Cij表述了殘基間的反相關(guān)運(yùn)動.

3 結(jié)果與討論

3.1 動力學(xué)平衡的穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)的柔性

為評估分子動力學(xué)平衡的穩(wěn)定性，采用Amber中的Ptraj程序計(jì)算了MDM2 主鏈原子相對于初始優(yōu)化結(jié)構(gòu)的均方根偏差 （RMSD）隨時間的函數(shù) （見圖2）.圖2表明動力學(xué)模擬4ns后，系統(tǒng)達(dá)到平衡.RMSD 的平均值為1.31?，漲落范圍低于0.50?.這表明動力學(xué)模擬平衡穩(wěn)定性是可靠的.

3.2 相關(guān)運(yùn)動分析

為了研究MDM2內(nèi)部殘基的相關(guān)運(yùn)動，我們基于分子動力學(xué)模擬軌跡中原子位置，構(gòu)建描述原子位置漲落的相關(guān)矩陣 （見圖3）.依據(jù)圖3，整體而言抑制劑PDIQ 的結(jié)合并沒有誘導(dǎo)MDM2構(gòu)象的明顯變化.

圖2 MD 模擬中主鏈原子的均方根偏差Fig.2 Root-Mean-Square Deviation of the backbone atoms on PDIQ-MDM2 complex

從圖3 可以觀察到，子單元S1 和S2 內(nèi)部（對角方塊）發(fā)生強(qiáng)烈的相關(guān)運(yùn)動，同時子單元S1內(nèi)部也有明顯的反相關(guān)運(yùn)動.子單元S3 相對于S4以相關(guān)運(yùn)動的趨勢運(yùn)動.圖3表明子單元S2相對與S1和S3產(chǎn)生強(qiáng)烈的反相關(guān)運(yùn)動，說明此處可能發(fā)生較大的構(gòu)象變化.此外，子單元S3也與S1發(fā)生較弱的反相關(guān)運(yùn)動.

圖3 系統(tǒng)平衡后主鏈Cα原子相對于其平均位置漲落的相關(guān)矩陣Fig.3 Cross-correlation matrices of the fluctuations of the coordination for Cαatoms around their mean positions after the equilibrium of system

3.3 結(jié)合自由能計(jì)算

采用MM-PBSA 方法計(jì)算了抑制劑PDIQ 與MDM2的結(jié)合自由能，其各項(xiàng)作用成分的貢獻(xiàn)列在表1中.依據(jù)表1，PDIQ 與MDM2的結(jié)合自由能為-19.8kcal／mol，這表明PDIQ 與MDM2 產(chǎn)生較強(qiáng)的相互作用.

表1表明范德瓦爾斯作用能 （ΔEvdw）和非極性的溶解自由能 （ΔGsurf）分別是-67.76 和-7.80 kcal／mol.盡管氣相中的靜電相互作用 （ΔEele）也提供了-135.2kcal／mol的有利貢獻(xiàn)，但是完全被不利于抑制劑結(jié)合的153.20kcal／mol的極性溶解自由能所抵消，產(chǎn)生了不利于抑制劑結(jié)合的極性作用 （17.99kcal／mol）.由表1看到熵變對結(jié)合自由能的貢獻(xiàn) （-TΔS=36.78）也不利于抑制劑結(jié)合，由熵變的計(jì)算得到有利的信息，抑制劑結(jié)合前后熵明顯減少，這說明抑制劑結(jié)合后結(jié)合位點(diǎn)原子的運(yùn)動受到了很大約束.總之有利于抑制劑結(jié)合的成分中范德瓦爾斯作用占了89.7%，因此范德瓦爾斯作用驅(qū)動了PDIQ 與MDM2的結(jié)合.這個結(jié)果基本上吻合了幾個課題組先前的研究［16-19］.

3.4 結(jié)構(gòu)-親和能關(guān)系

為了定量地從原子層次上研究抑制劑PDIQ與MDM2的結(jié)合模式，采用基于殘基的自由能分解方法計(jì)算了抑制劑-殘基相互作用，相互作用譜如圖4所示.依據(jù)圖4，PDIQ 能與MDM2的8個殘 基 Leu54，Ile61， Met62， Tyr67， Gln72，His73，Val93和His96產(chǎn)生強(qiáng)于1.4kcal／mol的相互作用，其結(jié)構(gòu)親和能關(guān)系分析如下.

圖4 抑制劑PDIQ 中關(guān)鍵殘基與MDM2各個分離殘基的相互作用譜Fig.4 Residue-residue interaction spectrum between the inhibitorp DIQ and MDM2

圖4表明8個殘基中Leu54與MDM2產(chǎn)生了最強(qiáng)的相互作用，其相互作用能為-3.81kcal／mol.從結(jié)構(gòu)圖5來看，這個較強(qiáng)的相互作用主要源自兩個因素的貢獻(xiàn)：（1）Trp7′疏水性環(huán)上的氮原子與殘基Leu54 的羰基氧原子形成氫鍵 （表2）；（2）Trp7′的疏水性環(huán)與Leu54 的烷基形成CH-π 相互作用.抑制劑PDIQ 與Val93的相互作用也非常強(qiáng)，作用能是-3.05kcal／mol.從結(jié)構(gòu)上看，這個作用主要由Trp7′吲哚環(huán)與Val93的烷基間CH-π 相互作用和Leu10′的烷基與Val93烷基間的CH-CH 相互作用提供.依據(jù)圖5，Met62和Ile61的烷基與殘基Phe3′的苯環(huán)臨近形成的CHπ相互作用分別為PDIQ 與MDM2的作用分別提供了-2.57和-2.25kcal／mol的能量貢獻(xiàn) （圖4）.基于軌跡的氫鍵動力學(xué)分析表明，殘基Gln72與殘基Phe3′形成一個氫鍵 （表2），這個氫鍵為PDIQ 與MDM2 的 相 互 作 用 提 供 了-1.99kcal／mol的貢獻(xiàn).殘基His73與抑制劑PDIQ 的作用是-1.71kcal／mol，這與His73的5元環(huán)和Phe3′的苯環(huán)間的π-π相互作用吻合.殘基Tyr67的苯環(huán)在結(jié)構(gòu)上與Phe3′的苯環(huán)臨近且平行，故能形成平行的π-π相互作用 （圖5），該作用提供了大約-1.47kcal／mol的能量貢獻(xiàn).殘基His96與PDIQ的作用是-1.5kcal／mol，該作用主要來自His96的疏水性5元環(huán)與Leu10′烷基間的CH-π 相互作用.上述分析結(jié)果基本上吻合幾個課題組先前的工作［17-21］.

表2 主要?dú)埢臍滏I分析Table 2 The hydrogen bonds of the key residues

圖5 pDIQ-MDM2復(fù)合體中主要?dú)埢南鄬ξ恢靡约靶纬傻臍滏IFig.5 Relative geometries of the key residues in PDIQ-MDM2complex and hydrogen bonds

綜合以上的結(jié)構(gòu)親和能關(guān)系可以發(fā)現(xiàn)，殘基Ile61，Met62，Tyr67，Gln72 和His73 形成抑制劑殘基Phe3′的疏水性結(jié)合口袋；殘基Leu54，His73和Val93形成抑制劑殘基Tyr7′的疏水性結(jié)合口袋；PDIQ 殘基Leu10′的疏水性結(jié)合裂縫由殘基Leu54，Val93和His96構(gòu)成.在這些結(jié)合口袋中主要的結(jié)合方式為CH-CH，CH-π和π-π相互作用.因此這些作用驅(qū)動了抑制劑與MDM2的結(jié)合.

4 結(jié) 語

基于動力學(xué)軌跡的相關(guān)矩陣分析表明抑制劑結(jié)合誘導(dǎo)了反相關(guān)運(yùn)動的主體形式.結(jié)合自由能的計(jì)算結(jié)果表明范德瓦爾斯作用主導(dǎo)了抑制劑與MDM2的結(jié)合.基于殘基的自由能分解揭示了MDM2疏水性結(jié)合口袋內(nèi)的主要作用形式，CHCH，CH-π 和π-π 相 互 作 用 驅(qū) 動 了 抑 制 劑 與MDM2的結(jié)合.這個研究結(jié)果能為抗癌藥物的設(shè)計(jì)提供一定的理論啟示.

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