溫陽通脈方對大鼠心肌缺血再灌注RISK通路機制研究※

石月萍

（遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院中醫(yī)科，錦州 121001）

急性心肌梗死經(jīng)溶栓、冠脈介入治療可以迅速重建血流，但卻伴隨著心肌缺血再灌注損傷 （MIRI）的負面影響。缺血預適應減輕心肌缺血再灌注損傷成為研究熱點[1]。再灌注損傷補救激酶（reperfusiong injury salvage kinase，RISK）信號通路是細胞存活的關鍵機制之一。已經(jīng)有系列研究表明PI3K-Akt通路途徑參與缺血及藥物預處理及后處理對再灌注損傷的保護作用[2]。本實驗研究中醫(yī)經(jīng)典方的加減方 （加減枳實薤白桂枝湯）溫陽通脈方對大鼠缺血再灌注損傷模型心肌壞死標記物cTnT含量及心肌akt、bax、bcl-2蛋白表達的影響，探討其心肌保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1 .1 實驗動物 健康雄性SD大鼠40只，體重250g～300g，隨機分為4組，每組10只 （購于遼寧醫(yī)學院實驗動物中心）。分別為假手術組、心肌缺血再灌注損傷組 （IR組）、心肌缺血預適應組 （IP組）、溫陽通脈方組 （WY組）。

1.1 .2 藥品與試劑 溫陽通脈方采用全成分 （枳實、薤白、桂枝等）配方顆粒，購自北京康仁堂藥業(yè)有限公司 (批號130301)。Bax、Bcl-2單克隆抗體 （北京博奧森生物技術有限公司）；DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒 （碧云天生物技術研究所）；蛋白激酶b試劑盒（北京中杉金橋試劑有限公司）；山羊抗兔IgG抗體（北京博奧森生物技術有限公司）。

1.1 .3 實驗儀器 DH-150動物人工呼吸機：浙江大學醫(yī)學儀器廠。BSM-7105床邊監(jiān)護儀：光電醫(yī)用電子公司。KB超薄切片機 (EMC6型)：LEICA公司。全自動免疫組化染色儀：美國DAKOCYTOMSTION。光學顯微鏡：日本奧林帕斯。TWY-16G低溫冷凍離心機：日本日立公司。全自動生化分析儀HITACHI7080，日本HITACHI7080公司。

1.2 實驗方法

1.2 .1 實驗分組及給藥 WY組，每日灌胃1.5ml溫陽通脈方免煎中藥配方顆粒 （4.68g/kg，劑量按人體表面積的0.018計算）2周。其余各組每日灌胃生理鹽水1.5ml連續(xù)2周。假手術組在大鼠末次灌胃1小時后開胸，冠狀動脈前降支下置線不結扎。IR組于末次灌胃1小時建立IR模型。IP組于末次灌胃1小時后建立IP模型。WY組于末次灌胃1小時后建立IR模型。

1.2 .2 模型制備 各組大鼠，以烏拉坦 (1g／kg)腹腔注射麻醉。四肢插入針形電極，連接心電監(jiān)護儀，描記Ⅱ導聯(lián)心電圖。氣管插管，連接動物呼吸機行人工呼吸 （正壓呼吸）。自左側第一、二、三肋開胸，充分暴露心臟及其表面的血管，剪開心包膜，于左心耳根部下方2mm處進針，穿過心肌表層在肺動脈圓錐旁出針，將直徑為1.5mm的凹型硅膠管置于結扎線與血管之間，當拉緊結扎線時，硅膠管壓迫冠狀動脈左前降支而致閉塞。IR組、WY組：結扎30min后，松解結扎線，再灌注120min。IP組：缺血5min，再灌注 5min，反復三次后，拉緊結扎線30min，然后再灌注120min。假手術組：只穿線不結扎。

冠脈結扎后左室發(fā)紺，心電圖S-T段抬高和 （或）R波高聳；松開結扎線后，心肌顏色由發(fā)紺轉紅，抬高的S-T段和 (或)R波回落，表明心肌再灌注成功。

1.2 .3 指標檢測

1.2 .3 .1免疫組織化學法檢測bax、bcl-2心肌組織切片梯度乙醇脫蠟，微波熱修復抗原，3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化酶活性，血清封閉，滴加稀釋的一抗，4℃過夜，滴加二抗，DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，中性樹脂封片，顯微鏡觀察照相。每只標本隨機取1張切片，每張切片高倍鏡 (×400)下隨機選擇5個視野，采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析計算該區(qū)域陽性細胞百分率。

1.2 .3 .2 Western-Blot檢測p-akt置凍存心肌組織100mg于勻漿器中，加入1ml裂解液，勻漿后，4℃15000r/min離心30min，取上清液，用考馬斯亮藍法測定蛋白定量，制成含蛋白相等的樣品。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉膜，于5%脫脂奶粉的TBS中37℃封閉120min，加入一抗，4℃封閉過夜，洗滌3次，加入二抗，37℃孵育120min，洗滌3次，濾干，按Western blot發(fā)光試劑盒說明書顯影，掃描，測定各組蛋白的相對光密度值。

1.2 .4 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差 （x±s）表示，統(tǒng)計學處理用SPSS12.0軟件包。計量資料采用組間正態(tài)檢驗，單因素方差分析，組間多重比較采用SNK檢驗，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清心肌壞死標記cTnT含量 見表1。

表1 大鼠血清cTnT （n=10）

表1 大鼠血清cTnT （n=10）

注：與假手術組比較，△P＜0.05；與IR組比較，☆P＜0.05；與IP組比較，■P＞0.05

組別 cTnT （μg/L）假手術組 1.37±0.20 IR組 8.85±2.50△IP組 5.25±1.65△☆WY組 5.15±1.58△☆■

2.2 各組大鼠心肌組織akt表達 見表2及圖1。

表2 各組大鼠心肌組織akt的表達 （n=10）

表2 各組大鼠心肌組織akt的表達 （n=10）

注：與假手術組比較，△P＜0.01，αP＞0.05；與 IR 組比較，☆P＜0.01，βP＞0.05；與 IP 組比較，■P＞0.05

組別 p-akt（×104） akt（RD） p-akt（RD）假手術組 0.80±0.12 0.42±0.07 0.20±0.03 IR組 1.53±0.22△ 0.41±0.08α 0.38±0.06△IP組 1.88±0.30△☆ 0.41±0.09αβ 0.49±0.09△☆WY組 1.83±0.38△☆■ 0.40±0.07αβ■ 0.47 ±0.09△☆■

圖1 各組大鼠心肌組織p-akt表達

2.3 大鼠心肌組織bax、bcl-2表達 見表3及圖2、3。

表3 各組大鼠心肌組織bax、 bcl-2表達 （n=10）

表3 各組大鼠心肌組織bax、 bcl-2表達 （n=10）

注：與假手術組比較，△P＜0.01；與IR組比較，☆P＜0.01；與IP組比較，■P＞0.05

組別 bax bcl-2假手術組 0.21±0.08 0.25±0.07 IR組 0.79±0.13△ 0.41±0.09△IP組 0.35±0.09△☆ 0.65±0.11△☆WY組 0.36±0.10△☆■ 0.66±0.14△☆■

圖2 各組大鼠心肌組織bax表達

圖3 各組大鼠心肌組織bcl-2表達

3 討論

溫陽通脈方由 《金匱要略》枳實薤白桂枝湯化裁而來。該方已經(jīng)被歷代醫(yī)家及近現(xiàn)代中醫(yī)藥工作者臨床實踐所證實為治療冠心病心絞痛的經(jīng)典方劑。冠心病心絞痛屬于中醫(yī) “胸痹”、 “心痛”等范疇。心肌梗死應為 “胸痹”重癥，屬于 “真心痛”范疇。心肌缺血再灌注損傷應發(fā)生于心肌梗死之后，因此其證候類似于真心痛。真心痛的病機特點是本虛標實，病位在心，本虛以心陽氣虛為主，標實以痰濁、血瘀為主[3]。枳實薤白桂枝湯具有行氣化痰，宣痹通陽作用，在此基礎上加入補氣之人參、活血化瘀之三七，則為溫陽通脈方，全方具有針對真心痛病機的補氣溫陽化痰活血作用。

前期研究表明，溫陽通脈方能夠縮小心肌梗死面積，抑制細胞凋亡、改善心肌缺血再灌注損傷的作用[4]，但其具體信號通路機制尚不明確。

再灌注損傷補救激酶 （reperfusion injury salvage kinase，RISK）信號通路[5]主要包括磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K-蛋白激酶B（又稱Akt）以及細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶 （ERK1/2）。已有研究表明，PI3K-Akt通路參與缺血及藥物預處理及后處理對再灌注損傷的保護作用[6-8]。

PI3K定位于細胞膜上，Akt通過PI3K的產(chǎn)物3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇的作用使自身轉移到細胞膜上磷酸化后被激活，稱為依賴PI3K途徑；不被轉移到細胞膜上活化，稱為非依賴PI3K途徑。當Akt在細胞膜上被激活以后，能夠向細胞質或細胞核轉運，并與相應部位的底物蛋白發(fā)生作用，使底物蛋白特定部位的絲、蘇氨酸發(fā)生磷酸化。激活的Akt可同時磷酸化胞質或胞核內(nèi)的多種底物[9]，因此，Akt被認為是復雜網(wǎng)絡信號通路的中心調(diào)節(jié)器[10]。

Bcl-2是AKT底物之一，能夠通過不同的分子機制對線粒體介導的細胞凋亡發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，前者主要有Bcl-2、Bcl-X、Bcl-1、Bcl-W等，后者包括Bax、Bcl-X、Bad、Bak、Bid等，各蛋白之間可相互作用形成同源或異二聚體，構成一個復雜的調(diào)控網(wǎng)絡。Bcl-2能和線粒體上的特異位點相結合，抑制線粒體細胞色素C的外溢，細胞色素C的釋放受阻，Caspase-3活性下降進而抑制細胞凋亡[11]。

本實驗觀察了溫陽通脈方預處理對心肌缺血再灌注損傷大鼠心肌壞死標記物cTnT含量及PI3k/Akt及其下游分子Bcl-2、bax的表達影響。通過免疫組化方法檢測大鼠心肌缺血再灌注后心肌組織中Bcl-2、bax蛋白表達，采用免疫印跡方法檢測各組Akt和p-akt的表達，觀察到模型組大鼠心肌組織中Bcl-2、bax蛋白表達水平均明顯增加，表明心肌缺血再灌注后促凋亡蛋白表達增加，而抑制凋亡蛋白表達也增加。各組Akt表達量相當，而P-akt表達增加，說明再灌注損傷激活了RISK途徑，使Akt磷酸化，從而上調(diào)抑制凋亡蛋白bcl-2的表達。而溫陽通脈方與預處理組的p-akt表達量明顯高于IR組，使bcl-2蛋白表達增加，bax蛋白表達降低，發(fā)揮了內(nèi)源性保護機制。藥物干預組溫陽通脈方的p-akt、bcl-2、bax的表達量與預適應組的表達量相當，說明其可能具有類似預適應樣的作用。

本研究結果表明：溫陽通脈方能夠降低心肌壞死標記物的含量，能夠上調(diào)心肌缺血再灌注大鼠心肌細胞表達p-akt、bcl-2，降低bax蛋白表達，說明溫陽通脈方對大鼠急性心肌缺血引起的心肌損傷具有保護作用，其機制可能通過預適應樣作用，上調(diào)內(nèi)源性保護因子p-akt，從而上調(diào)bcl-2，抑制bax蛋白表達有關。

[1]趙亞玲，敖虎山.心肌缺血再灌注損傷的研究進展.中國循環(huán)雜志，2011，26（5）：396-398.

[2]Wu QL，Shen T，Ma H，etal.Sufentanil postconditioning projects themyocardium from ischemia-reperfusion via PI3K/Akt-GSK-3beta pathway[J].JSurg Res.2012;178(2)：563-70.

[3]高鑄燁，徐浩，史大卓，等.急性心肌梗死中醫(yī)辨證分型的聚類研究[J].中國中醫(yī)急癥，2007，16(4)：432-434.

[4]石月萍，馬駿，趙建宇.溫陽通脈方預處理對再灌注大鼠心肌細胞凋亡的影響[J].中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志， 2009，15(12)：944-958.

[5]Hausenloy DJ,Yellon DM.New directions for protecting the heart againstischaemia-reperfusion injury：targeting the Reperfusion Injury Salvage Kinase(RISK)-pathway[J].Cardiovasc Res.2004,61(3)：448-60.

[6]Feng J，F(xiàn)ischer G，Lucchinetti E，etal.Infarct-remodeled myocardium is receptive to protection by isoflurane postconditioning：role of protein kinase B/Akt signaling[J].Anesthesiology.2006,104(5)：1004-14.

[7]Wu QL，Shen T，Ma H，etal.Sufentanil postconditioning protects themyocardium from ischemia-reperfusion via PI3K/Akt-GSK-3beta pathway[J].JSurg Res.2012,178(2)：563-70.

[8]唐莉，劉小鶯，王林.氧化應激誘導內(nèi)皮細胞凋亡與PI3k/Akt-Bc-l2通路的關系[J].細胞與分子免疫學雜志，2011，27(8)：859：861.

[9]馬亞飛，劉新偉，文婷婷，等.葛根素預處理減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷及 PI3K/AKT信號通路的作用 [J].重慶醫(yī)科大學學報，2009，34(12)：1673-1676.

[10]Kim AH，Khursigara G，Sun X，F(xiàn)ranke TF，Chao MV.Akt phosphorylates and negatively regulates apoptosis signal-regulating kinase[J].Mol Cell Biol，2001,(21)：893-901.

[11]Youfeng Chen，fengWang，etal.Effectof Qiguiyimailing on Apoptosis of Cardiac Myocyte and Apoptosis-RelatedGene Fas and Bal-2 Expression in Rats with Acute Myocardial Infarction[J].Chinese Journal of Integrative Medicine on Caidio-cerebrovascular Disease， 2009，7(l)：48-49.