納米金光度法測定維生素B1

王瑞勇， 范淑敏， 康小慧， 王 瑞， 葛寶玉， 賈雪雷

(鄭州大學化學與分子工程學院 河南鄭州450001)

0 引言

納米金以其獨特的物理和化學性質(zhì)成為研究熱點［1－3］，近年來主要用作光學探針及電化學傳感器．納米金具有很好的生物相容性，能夠和生物分子發(fā)生相互作用產(chǎn)生聚集，吸收峰紅移至600～700 nm之間，溶液的顏色由原來的酒紅色變?yōu)樽仙蛩{色．納米金比色法已用于多種物質(zhì)的檢測，包括DNA、蛋白質(zhì)、農(nóng)藥和金屬離子等［4－9］，在生物分析、環(huán)境檢測等方面具有很大的應用前景．

維生素B1能夠構(gòu)成輔酶維持體內(nèi)的正常生理代謝，在臨床上主要用于防治腳氣病，輔助治療神經(jīng)炎、消化不良、全身感染、高熱、糖尿病、甲狀腺功能亢進等各種疾?。壳皣鴥?nèi)外報導的測定維生素B1的方法主要有高效液相色譜法［10］、光度法［11］、熒光法［12］、化學發(fā)光法［13］、電化學法［14－15］等，還沒有用納米金作探針應用于分子光譜法測定維生素B1的報道，本實驗用納米金測定維生素B1，靈敏度較高，而且操作簡單，拓寬了納米金在藥物分析中的應用．

1 實驗部分

1．1 實驗藥品與儀器

氯金酸(阿拉丁試劑有限公司)，維生素標準品(中國藥品生物制品檢定所)，檸檬酸鈉、鹽酸、乙酸鈉(天津市科密歐化學試劑有限公司)，維生素B1片劑(10 mg，國藥準字H12020592)和注射液(100 mg，國藥準字H14022171)，二次蒸餾水、亞沸水(本實驗室提供)，實驗用玻璃容器均用新配制的王水(HCl/HNO3=3∶1)浸泡，洗滌后使用．

UV-1800PC紫外－可見分光光度計(中國上海美譜達)，F(xiàn)-4500熒光分光光度計(日本日立)，PHS-3C酸度計(上海雷磁儀器廠)，STP FA1004電子分析天平(上海上平儀器有限公司)，Tecnai G220s-twin高分辨型透射電子顯微鏡．

1．2 實驗方法

采用檸檬酸鈉法制備納米金．取250 mL三口燒瓶，加入100 mL 0．01%氯金酸溶液，在磁力攪拌加熱器上加熱至沸，加入2．75 mL 1%檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)煮沸12 min，停止加熱，自然冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，4℃保存．

取2 mL制備的納米金于5 mL容量瓶中，加入800 μL pH 2．3的鹽酸－檸檬酸鈉緩沖溶液，定容至刻度線．取2 mL加入緩沖的納米金于比色皿中，依次加入1～13 μL維生素B1標準溶液，混合均勻，以水為參比測定各自的吸光度．根據(jù)納米金溶液與維生素B1作用前后吸光度的變化值Δ(A625/A518)繪制標準曲線．Δ(A625/A518)=納米金與維生素B1作用后的吸光度比值A(chǔ)625/A518－納米金與維生素B1作用前的吸光度比值A(chǔ)625/A518．

2 結(jié)果與討論

2．1 納米金的表征

制備的納米金為酒紅色，其粒徑及表觀顏色都符合文獻報道．納米金的吸收曲線如圖1所示，最大吸收波長在518 nm處，這是球形的納米金粒子特有的表面等離子吸收峰，從而估算出納米金粒子的粒徑約為13 nm，濃度約為3．72 nM［16］．利用透射電鏡(TEM)對制備的納米金進行表征，從圖中可以看出制備的納米金為球形，粒徑均勻，分散很好．

圖1 納米金的紫外－可見吸收光譜及透射電鏡圖Fig．1 The absorption spectra and photograph of TEM of gold nanoparticles

2．2 納米金測定維生素B1

實驗制備的納米金粒子表面被大量的檸檬酸根離子包裹，由于靜電排斥力納米金能夠穩(wěn)定存在而不發(fā)生凝聚．維生素B1分子上帶有氨基(—NH2)，在弱酸溶液中，維生素B1帶正電(—NH+3)，由于靜電作用力，維生素B1能夠和納米金發(fā)生相互作用，使納米金粒子之間的距離變小，發(fā)生凝聚，利用透射電鏡觀察到作用后的納米金，如圖2所示，納米金發(fā)生凝聚．凝聚后納米金的紫外－可見吸收光譜發(fā)生紅移和展寬，納米金和維生素B1本身的共振散射峰很弱，凝聚后共振散射光譜增強，在此過程中，顏色由酒紅色變?yōu)樽仙罱K變?yōu)樗{色．納米金的凝聚程度用Δ(A625/A518)來表示，在一定范圍內(nèi)與維生素B1的濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，據(jù)此建立了一種簡單、快速測定維生素B1的比色分析新方法．

圖2 納米金與55 ng/mL維生素B1相互作用的透射電鏡圖，紫外－可見吸收光譜圖及共振散射光譜圖Fig．2 The photograph of TEM，absorption spectra and RRS spectra of gold nanoparticles with 55 ng/mL VB1

2．3 實驗條件優(yōu)化

在pH 2．0～7．0范圍內(nèi)，對比加入等體積等濃度的鹽酸－檸檬酸鈉緩沖溶液、鹽酸－乙酸鈉緩沖溶液和BR緩沖溶液對體系測定的影響(圖3)，其中鹽酸－檸檬酸鈉緩沖溶液對納米金的聚集及變色效果最好，在此基礎(chǔ)上，考察了不同緩沖溶液加入量對體系測定的影響(圖4)，最終選定800 μL pH為2．3的鹽酸－檸檬酸鈉緩沖溶液時，Δ(A625/A518)最大．這主要是因為pH過低，納米金表面吸附的負電荷減少，不利于它與維生素B1的結(jié)合，pH過高時，維生素B1中質(zhì)子化的氫解離，正電荷減少，也不利于與納米金結(jié)合．

圖3 不同緩沖溶液對體系的影響Fig．3 Effect of pH on the absorption ratio

考察納米金的用量對體系測定的影響．改變納米金的用量(1～3 mL)，實驗結(jié)果表明，納米金的濃度增大時，其最大吸收峰值增大，而Δ(A625/A518)降低，考慮到納米金容易染色，因此實驗選擇2 mL納米金．

考察反應時間對體系測定的影響．分別對加入不同濃度的維生素B1前后的納米金體系連續(xù)測定1 h，結(jié)果表明，加入維生素B1前，其吸收光譜基本不變，加入維生素B1后，在20 min時凝聚程度都達到最大，20 min后吸收光譜基本不再變化，反應時間定為20 min．

2．4 標準工作曲線

在最優(yōu)條件下，按照實驗方法測定維生素B1，由Δ(A625/A518)對維生素 B1的濃度 c作圖(如圖5所示)，線性范圍為5～55 ng/mL，線性回歸方程為 Δ(A625/A518)= －0．073 4+0．019 7c(維生素 B1，ng/mL)，相關(guān)系數(shù)為 0．998，檢出限(3σ)為 0．74 ng/mL．

圖4 不同鹽酸－檸檬酸鈉加入量對維生素B1測定的影響Fig．4 Effect of buffer solution amount on the absorption ratio

圖5 不同濃度維生素B1存在下納米金的紫外－可見吸收光譜圖Fig．5 UV-vis absorption spectra of GNPs in the presence of different concentrations of VB1

2．5 常見物質(zhì)的干擾

按照試驗方法，考察了常見的金屬離子、氨基酸和結(jié)構(gòu)類似的藥物分子的干擾情況(表1)．結(jié)果表明，對于55 ng/mL維生素B1，常見的陰離子、金屬離子、氨基酸和糖類對體系基本不干擾，表明該體系具有較好的選擇性．

表1 常見物質(zhì)的干擾(55 ng/mL維生素B1)Tab．1 Effects of coexistent substances(containing［VB1］=55 ng/mL)

2．6 樣品分析

2．6．1 回收率試驗

取維生素B1片劑20片，研細，精密稱取適量(約相當于維生素B110 mg)，加少量鹽酸溶解，濾紙過濾后，轉(zhuǎn)移至棕色容量瓶中．按實驗方法進行標準加入回收實驗，精密量取適量樣品溶液，分別加入標準溶液10 ng/mL、30 ng/mL，測定吸光度值，計算回收率，并重復測定3次．精密量取1 mL維生素B1注射液于100 mL棕色容量瓶中，同樣按實驗方法進行標準加入回收實驗，精密量取適量樣品溶液，分別加入標準溶液15 ng/mL、30 ng/mL，測定吸光度值，計算回收率，并重復測定3次，回收率均在95% ～105%之間，說明該方法可以用于實際樣品的分析．

2．6．2 含量測定

精密量取適量維生素B1片劑及注射液樣品溶液，按試驗方法測定吸光度，并計算ΔA，根據(jù)標準工作曲線計算樣品中維生素B1的含量．結(jié)果見表2．由以上測定結(jié)果可知，購買的維生素B1片劑及注射液含量均在標示范圍90．0% ～110%之內(nèi)，RSD較小，符合藥品質(zhì)量管理規(guī)定．

表2 維生素B1片劑及注射液中維生素B1的測定Tab．2 Results for the determination of VB1in tablet and injection

3 結(jié)論

本文采用檸檬酸鈉還原氯金酸的方法制得粒徑約為13 nm的納米金．在酸性環(huán)境中納米金與維生素B1發(fā)生相互作用，納米金產(chǎn)生凝聚，使其最大吸收峰發(fā)生紅移，由此建立維生素B1的比色測定方法．優(yōu)化了溶液pH、納米金的濃度以及反應時間．在最佳條件下，方法的線性范圍為5～55 ng/mL，結(jié)果令人滿意．用此方法分析了維生素B1片劑和注射液，所測結(jié)果和按藥典方法測定結(jié)果相一致．實現(xiàn)了維生素B1的測定，方法簡單，測定速度快，而且不需要昂貴的儀器及大量的分析試劑，在食品分析及環(huán)境監(jiān)測方面有很好的應用前景．

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