糞菌移植的研究進展

楊云生 王子愷

中國人民解放軍總醫(yī)院消化內(nèi)科(100853)

近年來，隨著全球范圍內(nèi)難辨梭狀芽孢桿菌感染(C.difficileinfection, CDI)發(fā)病率/復(fù)發(fā)率、抗菌藥物耐藥性的不斷升高，以及腸道微生物宏基因組學研究的不斷深入，糞菌移植(fecal microbiota transplantation, FMT)這一古老的話題又重新成為新的關(guān)注熱點。

一、FMT的發(fā)展歷史

FMT不同文獻中名稱略有不同，如糞便移植(stool/fecal transplantation, ST/FT)、糞便細菌療法(fecal bacteriotherapy, FB)、腸道微生物群落移植(intestinal microbiota transplantation, IMT)和糞便微生物群重建(fecal microbiota reconstitution, FMR)等。我國FMT的歷史最早可追溯到1700多年前(公元4世紀)的東晉時期，葛洪所編著《肘后方》就有關(guān)于FMT的記載。明朝時期(公元16世紀)由李時珍編著的《本草綱目》中也有人糞(黃龍湯)治療嚴重腹瀉和食物中毒的內(nèi)容[1]。西方國家最早的FMT臨床應(yīng)用為Eiseman等[2]在1958年報道的糞便灌腸治療偽膜性腸炎具有較好療效?，F(xiàn)階段，F(xiàn)MT研究大部分是關(guān)于FMT治療復(fù)發(fā)性CDI和炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)的個案或系列病例報道[3-4]，尚缺乏質(zhì)量較高的臨床隨機對照試驗。

二、FMT適應(yīng)證以及應(yīng)用現(xiàn)狀

1. CDI：近年來，全球范圍內(nèi)CDI發(fā)病率及其嚴重程度呈顯著增高趨勢。C.difficile過度生長導(dǎo)致腸道微生態(tài)失衡，臨床上常表現(xiàn)為CDI相關(guān)性腹瀉和偽膜性腸炎。傳統(tǒng)上，CDI主要采用萬古霉素、甲硝唑、利福昔明和非達米星等抗菌藥物治療，但因C.difficile耐藥性和CDI復(fù)發(fā)率較高而療效不佳，CDI總體復(fù)發(fā)率在15%～26%[5]。對于超過3次的復(fù)發(fā)性和難治性CDI，可以謹慎考慮應(yīng)用FMT代替抗菌藥物治療[6]。van Nood等[7]開展的目前僅有的一項隨機對照試驗(RCT)提示，F(xiàn)MT治療可使81%的復(fù)發(fā)性CDI患者癥狀得到緩解，而只接受萬古霉素治療的患者僅有31%出現(xiàn)緩解。Brandt等[5]開展的一項多中心經(jīng)結(jié)腸鏡FMT治療CDI的長期隨訪觀察報道，F(xiàn)MT治療癥狀緩解率可達91%。

臨床醫(yī)師需全面了解CDI臨床特點，并有效把握FMT的時機。對于復(fù)發(fā)性CDI相關(guān)性腹瀉，需基于3條標準[8]：①糞便C.difficile毒素檢測陽性；②腹瀉標準要符合每天至少3次水樣便，持續(xù)2 d，或在2 d內(nèi)超過8次的水樣便；③在早期抗菌藥物治療后出現(xiàn)持續(xù)反復(fù)。

醫(yī)師和患者對FMT的認識和接受程度對于FMT的臨床應(yīng)用有重要影響，有研究[5]顯示，97%接受FMT治療的CDI患者將來仍愿意接受FMT治療，53%的患者聲稱抗菌藥物治療前會選擇FMT作為一線治療方案。

2. 炎癥性腸病(IBD)：越來越多的證據(jù)表明微生物在IBD發(fā)病中具有重要作用，雖尚未證實某種特定的微生物與IBD相關(guān)，但腸黏膜針對腸道共棲共生微生物群落的免疫應(yīng)答異常，結(jié)合宿主遺傳因素，有可能導(dǎo)致IBD。IBD患者腸道微生物群落生物多樣性降低，以硬壁菌門中的雙歧桿菌、乳酸菌和普拉梭菌降低，以及放線菌門和蛋白菌門等增多為主要表現(xiàn)。1988年首例潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)患者接受FMT治療后出現(xiàn)持續(xù)性的臨床和組織病理學治愈[9]。Borody等[10]報道了6例嚴重、復(fù)發(fā)型UC患者接受FMT治療后出現(xiàn)臨床、內(nèi)鏡和組織學逆轉(zhuǎn)。最近，Anderson等[4]開展了一項納入17篇病例報道共41例IBD患者的系統(tǒng)評價，該研究報道FMT可使63%的IBD患者出現(xiàn)臨床緩解，76%的患者可停用IBD相關(guān)藥物且消化系統(tǒng)癥狀減少。值得指出的是，雖然IBD和CDI共存并不常見，一般UC患者中CDI發(fā)生率約3.7%，克羅恩病患者中約1.1%。IBD患者一旦合并CDI，可加重IBD的疾病嚴重程度，增加復(fù)發(fā)率和死亡率[11-13]。Borody等[10]對6例接受免疫抑制劑和(或)美沙拉秦治療的嚴重和難治性UC患者進行FMT治療，所有患者在FMT治療后均出現(xiàn)臨床和內(nèi)鏡下的緩解；此外，其他病例報道也證實FMT對接受免疫抑制劑治療的UC患者效果明顯；上述研究提示，F(xiàn)MT可能對于接受免疫抑制劑治療的UC患者療效更好。

3. 其他：FMT可用于治療腹瀉型和便秘型腸易激綜合征(irritable bowel syndrome, IBS)。Andrews等[14]采用含擬桿菌屬、大腸桿菌和乳桿菌屬等20種非致病性腸道微生物的培養(yǎng)液，治療了45例便秘型IBS，在9～19個月的隨訪觀察中，60%的患者可每日排便而無需輕瀉藥的輔助。另有報道，F(xiàn)MT治療疲勞綜合征、胰島素抵抗/2型糖尿病、特發(fā)性血小板減少性紫癜和多發(fā)性硬化癥等具有一定療效。FMT還可能用于治療腸道免疫缺陷和過敏、肥胖、非酒精性脂肪肝、帕金森病和兒童自閉癥等與腸道微生態(tài)失衡相關(guān)的疾病[15]。

三、FMT供體篩查和移植前準備

1. FMT供體篩查：FMT需取得糞便供體和受體的知情同意。目前供體主要從夫妻、父母、子女和親密朋友等與受體關(guān)系密切的個體中選擇，這與受體意愿有關(guān)；此外，這部分人群與受體具有相似的微生態(tài)環(huán)境，理論上可能對FMT產(chǎn)生更為積極的效果。Gough等[3]認為采用受體親屬或朋友的糞便較不相關(guān)供體的糞便療效更好，并指出供體和受體間性別差異對疾病緩解的影響不大，但該結(jié)論尚缺乏循證醫(yī)學證據(jù)。當然，不相關(guān)的健康捐贈者也是潛在供體，而健康糞菌移植庫等有待研究建立。

糞便供體篩查需提供詳細的醫(yī)療證明，如疾病史、相關(guān)檢查、糞便和血清學檢驗等。與獻血相比，糞便捐獻在某種程度上對供體的要求更高。目前糞便供體納入和排除標準主要來源于各項研究自定的標準，總體上較一致。供體納入標準包括：①無任何已知的傳染??；②最近3個月內(nèi)未使用抗菌藥物以及其他導(dǎo)致腸道微生態(tài)紊亂的藥物；③無胃腸道腫瘤、息肉等消化系疾病；④無免疫系統(tǒng)疾病史；⑤未使用任何免疫抑制劑；⑥無IBD、慢性便秘和IBS病史；⑦無惡性腫瘤病史；⑧最近6個月內(nèi)未到地方流行性腹瀉地區(qū)旅行；⑨當前未進行任何抗腫瘤相關(guān)的藥物和其他治療；⑩當前無消化系統(tǒng)癥狀；無其他相關(guān)危險因素，如靜脈內(nèi)藥物濫用(吸毒)、高危性行為和犯罪史等。糞便供體排除標準包括：①糖尿病和代謝綜合征等代謝性疾病[16]；②消化系統(tǒng)手術(shù)史；③慢性疲勞綜合征；④自身免疫病；⑤特異反應(yīng)性疾病，如濕疹、哮喘和胃腸道嗜酸性細胞相關(guān)疾病等[17]；⑥神經(jīng)精神性疾病。

供體血清學篩查項目包括：①血常規(guī)；②血生化；③肝炎病毒A/B/C，人類免疫缺陷病毒，人類T淋巴細胞病毒，巨細胞病毒、EB病毒和梅毒等病毒學檢測；④蒼白密螺旋體和幽門螺桿菌等致病微生物檢測。供體糞便樣本通過各種分子生物學、培養(yǎng)和顯微鏡檢等方法檢測各類致病微生物，包括C. difficile 毒素A/B、沙門菌屬、志賀菌屬、彎曲桿菌屬、金黃色葡萄球菌屬、耶爾森菌屬、副溶血性弧菌、霍亂弧菌、白色念珠菌、賈第蟲屬、輪狀病毒屬、隱孢子蟲屬、大腸桿菌 O157、環(huán)孢子蟲、卵子、包囊和寄生蟲等。

2. FMT移植前準備：受體準備：①移植前3 d停用抗菌類藥物；②無論接受何種移植途徑，均需進行腸道清潔準備；③給予抗運動功能藥物便于糞菌液的腸道保留；④如通過鼻胃管或鼻空腸管途徑，F(xiàn)MT前一晚和清晨需給予質(zhì)子泵抑制劑[18]。供體準備：①避免進食對患者可能造成過敏的食物；②報告任何感染的癥狀和體征；③移植前一晚口服滲透性緩瀉劑[18]。

四、糞菌液制備流程

新鮮糞菌液制備流程：①將約50 g供體新鮮糞便樣本置于攪拌器中，加入250 mL無菌0.9% NaCl溶液進行初步均質(zhì)加工；②將糞便漿體經(jīng)不銹鋼濾網(wǎng)過濾去除其中的大顆粒物質(zhì)；③冰上轉(zhuǎn)運至實驗室并在采集后2 h內(nèi)進行處理；④將樣本在氮氣生物工程廚內(nèi)進行稱重并在勻漿器中進一步勻質(zhì)處理；⑤漿體逐級經(jīng)過直徑2.0 mm、1.0 mm、0.5 mm和0.25 mm的不銹鋼濾網(wǎng)過濾以去除未吸收的食物殘渣和小顆粒物質(zhì)；⑥將再次過濾的樣本以6000轉(zhuǎn)/ min的速率離心15 min，并將沉淀再懸浮于0.9% NaCl溶液中，得幾乎無色無味的糞菌液。

糞菌液制備過程中幾個問題需注意：首先是關(guān)于新鮮和冰凍糞菌液的療效問題。獲得的新鮮糞菌液可立即進行移植，也可加入無菌甘油后置于-80 ℃作為冰凍樣本保存1～8周。有研究[7]強調(diào)需采用6 h內(nèi)的新鮮糞便樣本移植效果較好，但也有研究[19]采用標準化的冰凍糞便樣本，臨床療效并無明顯差異。其次是關(guān)于糞菌液移植量對療效的影響。有研究報道糞菌液容積>500 mL時，97%的CDI患者得到緩解，<200 mL時僅有80%得到緩解。當然，糞便稀釋濃度不同而不好統(tǒng)一，有研究[3]指出，移植糞便質(zhì)量<50 g，可使CDI復(fù)發(fā)的風險增加4倍。第三是關(guān)于糞便稀釋材料對移植效果的影響，如無菌水、0.9% NaCl溶液、奶類和含有蚤草的鹽水等曾均報道用于糞便稀釋；有研究指出無菌水較0.9% NaCl溶液更易使疾病消退，但CDI的復(fù)發(fā)率增加2倍[3]。第四是如何保持糞菌液制備和移植過程中的絕對厭氧狀態(tài)，以稀釋材料為基礎(chǔ)的均質(zhì)方法和電子均質(zhì)器法可能對糞便中絕對厭氧菌構(gòu)成產(chǎn)生影響。

五、FMT實現(xiàn)途徑

FMT可通過鼻胃管、鼻空腸管、胃鏡、結(jié)腸鏡和保留灌腸等途徑實現(xiàn)，根據(jù)患者的臨床實際病情選擇移植方式和次數(shù)。經(jīng)上消化道途徑操作簡單，風險性低，但糞菌液是否能夠遍布全結(jié)直腸，以及是否增加小腸細菌過度生長的風險，目前仍不清楚。經(jīng)下消化道途徑，特別是經(jīng)結(jié)腸鏡途徑是FMT的一線方法。以經(jīng)結(jié)腸鏡途徑為例，采用注射器將糞菌液從結(jié)腸鏡活檢孔道注入，盡量從回腸末端和盲腸開始噴灑，邊噴灑邊緩慢退鏡，直至糞菌液遍布全結(jié)直腸；糞菌液灌注總量需500 mL左右，患者在糞菌移植后0.5 h內(nèi)盡量避免排便。Gough等[3]認為經(jīng)結(jié)腸鏡途徑較經(jīng)鼻胃管等其他途徑對于CDI的緩解率最高，平均達91%。但近期一項RCT[7]證實，對于CDI患者，經(jīng)十二指腸灌注途徑與經(jīng)結(jié)腸鏡途徑FMT的臨床療效相當。當然，目前關(guān)于移植途徑的比較研究較少，最佳途徑可能與疾病相關(guān)的解剖學部位有關(guān)，如經(jīng)鼻十二指腸途徑的FMT對于代謝綜合征來說可能更安全和有效[16]。

六、FMT相關(guān)不良反應(yīng)

總體上看，F(xiàn)MT治療復(fù)發(fā)性CDI是安全有效的，未見嚴重不良事件。部分CDI患者在FMT當天可出現(xiàn)腹瀉，小部分患者可出現(xiàn)噯氣、腹脹、腹部絞痛和便秘等癥狀，上述癥狀在移植后2 d內(nèi)大部分消失。其他諸如消化道出血、腹膜炎等極少見并發(fā)癥主要與移植過程中的內(nèi)鏡操作相關(guān)。FMT治療IBD的相關(guān)不良反應(yīng)報道較多。Vermeire等[20]對4例克羅恩病患者進行了FMT，其中3例出現(xiàn)短暫的不良反應(yīng)，包括發(fā)熱和腹部壓痛等，但上述不適在移植術(shù)后2 d均消失。De Leon等[21]報道了1例老年男性UC患者在FMT前處于長期緩解期達20余年，未接受免疫抑制劑或美沙拉秦治療，因出現(xiàn)CDI后給予FMT，結(jié)果導(dǎo)致UC相關(guān)的腸道炎癥活動；提示IBD合并CDI時需謹慎實施FMT。Angelberger等[22]對5例僅接受抗菌藥物和益生菌制劑治療的中-重度UC患者實施了FMT，結(jié)果2例接受FMT后癥狀加重。關(guān)于FMT的長期安全性，如是否可導(dǎo)致機體遠期出現(xiàn)感染、炎癥和消化道腫瘤等，目前缺乏長期隨訪資料。

七、FMT的腸道微生物群落重建機制

理論上健康供體的糞菌液可使腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能失衡狀態(tài)得到恢復(fù)，進而改善相關(guān)臨床癥狀，但FMT導(dǎo)致患者腸道菌群具體發(fā)生何種有益變化及其潛在的機制仍不完全清楚。近年來，微生物群落高通量測序和生物信息分析技術(shù)不斷應(yīng)用到消化道微生物群落結(jié)構(gòu)和功能研究上來，使我們可以對FMT引起的腸道微生物群落重塑作用進行深入研究。目前為止，僅有少量研究對FMT前后受體腸道微生物群落變化情況進行了分析。Chang等[23]對復(fù)發(fā)性CDI患者腸道菌群構(gòu)成進行了分析，證實C.difficile腸道內(nèi)大量定植可引起腸道菌群構(gòu)成多樣性的顯著降低。Khoruts等[24]對CDI患者FMT前后的腸道菌群進行了基于細菌16S rDNA的測序分析，證實CDI患者腸道擬桿菌門和硬壁菌門含量顯著下降，而C.difficile豐度占優(yōu)勢；而FMT治療后14 d時腸道菌群結(jié)構(gòu)與健康供體較為一致，體現(xiàn)為擬桿菌屬某些種為優(yōu)勢菌種；證實FMT改善腸道菌群結(jié)構(gòu)和臨床癥狀的作用較為持久。Grehan等[25]進行的研究也證實FMT對腸道菌群紊亂的重建作用持久，并可持續(xù)至術(shù)后24周。

根據(jù)現(xiàn)有研究提示，F(xiàn)MT可重建受損的腸道微生物群落，恢復(fù)腸道的定植抗力，抵御C.difficile等致病微生物的定植和感染。最近有研究采用宏基因組學高通量測序方法將人類腸道微生物群落分為以擬桿菌屬、普里沃菌屬和瘤胃球菌屬為代表的三種腸型[26]，可結(jié)合受體和供體的腸型特征進行FMT。當然，隨著腸道微生物群落宏基因組學研究的不斷深入，未來可根據(jù)患者腸道微生態(tài)失衡的具體情況，實施個體化的FMT。

八、FMT臨床應(yīng)用面臨的問題和展望

現(xiàn)階段，F(xiàn)MT臨床適應(yīng)證主要體現(xiàn)在復(fù)發(fā)性CDI和IBD的治療上，與腸道微生態(tài)相關(guān)的其他消化道和消化道外疾病是否均可嘗試FMT治療仍不明確；隨著基礎(chǔ)和臨床研究的不斷深入，未來有望擴大FMT的適應(yīng)證。FMT相關(guān)供體的選擇和篩查、糞菌液制備以及移植流程等方面目前未形成統(tǒng)一的標準。FMT臨床應(yīng)用和技術(shù)革新主要受臨床醫(yī)師和相關(guān)患者強烈意愿的直接驅(qū)動，而科研機構(gòu)和企業(yè)對FMT樣本制備流程相關(guān)技術(shù)革新還未引起重視。關(guān)于FMT療效及其長期安全性的循證醫(yī)學證據(jù)不足，有待于開展高質(zhì)量的臨床隨機對照或隊列研究進一步驗證。此外，F(xiàn)MT對腸道微生物群落的重建機制需要開展FMT前后基于宏基因組學策略的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的研究，為FMT的臨床應(yīng)用提供有效的基礎(chǔ)理論支撐。我國目前需要確立FMT相關(guān)法律法規(guī)，選擇合適病例進行臨床試驗，并制定初步的臨床實踐指南；FMT在國內(nèi)臨床應(yīng)用和研究需受到重視。

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