淫羊藿總黃酮提取物樹脂純化工藝條件的優(yōu)化

周國保 張文清

(1.江西省化學工業(yè)學校，江西 南昌 330012;2.華東理工大學化學與分子工程學院，上海 200237)

1 引言

淫羊藿是一種全草類藥材，其有效成分為淫羊藿總黃酮。淫羊藿總黃酮的提取主要有水提法和水醇提取法，可配合高壓、超聲波、微波等輔助手段。根據(jù)文獻[1]，在微波輔助下醇提淫羊藿總黃酮，所得淫羊藿干浸膏對淫羊藿原料的平均收率為10.7%，其中淫羊藿總黃酮含量29.7% 。為了開發(fā)新藥，淫羊藿提取物需要進一步純化，使淫羊藿總黃酮含量55%以上[2]或55%～65%[3]。為達到這一純化要求，淫羊藿提取物需經(jīng)初步純化(不是必須的)和中度純化步驟實現(xiàn)。在初步純化中，有水提醇沉法——除去蛋白質(zhì)、多糖等水溶性雜質(zhì)，醇提水沉法——除去樹脂、蠟質(zhì)、葉綠素等醇溶性雜質(zhì)，絮凝法——除去蛋白質(zhì)、多糖、樹脂、蠟質(zhì)等雜質(zhì)；根據(jù)文獻[4]，用殼聚糖作絮凝劑在丹參口服液制備中獲得較好純化效果。在中度純化中，通常采用大孔吸附樹脂或聚酰胺樹脂層析法。針對中度純化步驟，以D1400、HZ841兩種大孔樹脂和聚酰胺吸附樹脂為層析劑，闡述其對淫羊藿總黃酮提取物的純化效果及取得最佳純化效果的工藝條件。

2 實驗方法

2.1 樹脂處理

D1400大孔樹脂、PA03060聚酰胺樹脂和HZ-841大孔樹脂各2g，倒入錐形瓶，各加10ml的80%乙醇浸泡，靜止存放過夜。浸泡液用水檢測(1:1)，不渾濁表明乙醇洗滌充分。倒出浸泡液，倒入去離子水浸泡樹脂，中途換一到兩次水，直到無醇味為止。用水保存處理過的樹脂(該樹脂用于無醇吸附研究),或用20%的乙醇溶液保存處理過的樹脂(該樹脂用于含醇吸附研究)。

2.2 三種樹脂靜態(tài)吸附研究

藥液為微波輔助下醇提液經(jīng)絮凝初步純化后加水或醇稀釋的調(diào)整液，其中總黃酮含量為1400μg/ml，含乙醇10% 。

各取2g處理過的樹脂于錐形瓶中，分別加入藥液各43mL，恒溫于10℃進行靜態(tài)吸附。吸附初對吸附體系中液相取樣0.5mL分析總黃酮的含量；每隔2h對吸附體系中液相取樣0.5mL分析總黃酮的含量，共取樣分析7次；5日后再取樣0.5mL分析總黃酮的含量，繼續(xù)加入10mL藥液。120h后取樣0.5mL測定[1]總黃酮的含量，再加入10mL藥液，同上操作，重復2次。

2.3 樹脂純化效果研究

2.3.1 樹脂層析裝置

采用內(nèi)徑φ16×200mm的普通層析柱，柱中每次填充2g處理過的純化用樹脂，樹脂層靠上、下塞入的用乙醇浸泡過的棉團固定，柱中多余空間用φ15的尼龍棒充填。通過蠕動式恒流泵以恒定流速進行上樣或洗脫。上樣或洗脫的流向均為自上而下。上樣前用水平衡。

2.3.2 樹脂層析操作

(1)上樣藥液：上樣藥液A由絮凝純化液配制，總黃酮含量在1350.3ug/mL，含醇10%；另一種上樣藥液B由提取液直接配制，總黃酮含量在1350.3ug/mL，含醇10% 。

(2)上樣方法：取30mL藥液動態(tài)上樣，流速0.5mL/min，過柱液每5mL收集一次，共收集6次，分別各取0.5mL進行總黃酮測定，測定方法參考相關(guān)文獻[1]。

(3)洗脫方法：先用60mL水洗脫，再用40mL 20%乙醇洗脫、40mL 70%乙醇(但PA03060聚酰胺樹脂采用95%乙醇[5])洗脫、10mL 95%乙醇洗脫，洗脫流速恒定在1.5mL/min 。每梯度洗脫液單獨收集，分別各取0.5mL進行總黃酮的測定，測定方法參考相關(guān)文獻[1]。

2.3.3 干浸膏制備方法

收集到的第三梯度洗液、第四梯度洗液，分別制備干浸膏。方法：將第三梯度洗液或第四梯度洗液蒸餾濃縮，至5～10mL后倒入表面皿，用少許(5～10mL)無水乙醇洗瓶壁，將該清洗液倒入表面皿，置表面皿于真空干燥器中80℃干燥，對得到的純化后干浸膏產(chǎn)品稱重。測定干浸膏產(chǎn)品中總黃酮含量[1]。

2.4 HZ-841樹脂純化工藝研究

2.4.1 HZ-841樹脂層析裝置

采用內(nèi)徑φ16×200mm的普通層析柱，每次試驗裝2g HZ-841大孔樹脂。

2.4.2 樹脂層析操作方法

(1)上樣藥液：上樣藥液由提取液直接配制，總黃酮含量在1773.3ug/mL，含醇10% 。

(2)上樣方法：取30mL藥液動態(tài)上樣，上樣流速由正交設(shè)計決定，過柱液每5mL收集一次，共收集6次，分別各取0.5ml進行總黃酮測定。

(3)洗脫方法：依次用80mL水、20%乙醇(用量由正交設(shè)計決定)、第三梯度洗脫液(濃度、用量由正交設(shè)計決定)、20mL 95%乙醇洗脫，洗脫流速1.5mL/min 。

2.4.3 干浸膏制備方法

對第三梯度洗脫液和第四梯度洗脫液(第四梯度洗脫液是否作為干浸膏制備收集對象，依純化效果步驟研究的結(jié)論)進行蒸餾濃縮，至5～10mL將殘液倒入表面皿，用少許(5～10mL)無水乙醇洗瓶壁，將該洗液倒入表面皿，置表面皿于真空干燥器中80℃干燥，將得到的純化后干浸膏產(chǎn)品，稱重。測定[1]干浸膏產(chǎn)品中總黃酮含量。

2.4.4 正交試驗設(shè)計

本研究為4因素3級水平的試驗，各因素的水平，如表1所示。

表1 樹脂純化研究中L9(34)正交試驗各因素的水平

3 樹脂靜態(tài)吸附與純化效果的結(jié)果與討論

3.1 三種樹脂對淫羊藿總黃酮的靜態(tài)吸附研究結(jié)果

3.1.1 三種樹脂對淫羊藿總黃酮的靜態(tài)吸附結(jié)果與討論

D1400、PA03060聚酰胺樹脂、HZ-841大孔樹脂等3種吸附樹脂于常溫(實驗溫度10℃)分別在藥液中靜態(tài)吸附，繪制成比吸附量與時間的關(guān)系曲線，如圖1所示。在較短的時間內(nèi)，三種樹脂對淫羊藿總黃酮的比吸附量沒有明顯差距。在2h時，三種樹脂的靜態(tài)比吸附量在6～8.5 mg/g之間。隨著吸附時間的延長，吸附量逐漸增加，靜態(tài)吸附4h以后，對淫羊藿總黃酮的比吸附量，最大的是D1400大孔樹脂。

3.1.2 三種樹脂對淫羊藿總黃酮的靜態(tài)吸附結(jié)論

對D1400大孔樹脂，PA03060聚酰胺樹脂，HZ-841大孔樹脂進行(靜態(tài)吸附)比吸附量的研究，D1400大孔樹脂靜態(tài)吸附能力強。

3.2 吸附平衡研究結(jié)果與討論

3.2.1 三種樹脂對藥液吸附平衡數(shù)據(jù)匯總

D1400大孔樹脂、PA03060聚氨酯樹脂、HZ-841大孔樹脂對藥液中淫羊藿總黃酮吸附平衡數(shù)據(jù)，匯總于表2中。

表2 三種樹脂對淫羊藿總黃酮的吸附平衡數(shù)據(jù)

3.2.2 三種樹脂對藥液吸附平衡模擬曲線繪制

不管吸附原料的初始濃度多少、吸附原料體積多少，只要體系達到吸附平衡，平衡時樹脂對淫羊藿總黃酮的比吸附量Qe和平衡時吸附余液中總黃酮的含量Ce組成的坐標點都會落于吸附平衡曲線上，因而可以將表2中平衡數(shù)據(jù)模擬出三條吸附平衡曲線，根據(jù)模擬出三條吸附平衡曲線可以找到相應的模擬平衡數(shù)據(jù)，利用EXCEL繪圖得到計算機繪制的吸附平衡模擬曲線，如圖2所示。吸附平衡模擬曲線可用于確定靜態(tài)吸附下需要的樹脂量。若一定范圍內(nèi)(圖2中模擬曲線的范圍)原料初始濃度、原料所用體積已知，則應用模擬平衡曲線可以找到平衡時樹脂的比吸附量和吸附余液的平衡濃度。

3.2.3 三種樹脂對藥液吸附平衡研究結(jié)果應用

對三種樹脂進行吸附平衡研究，繪制了三種樹脂吸附平衡曲線，可用于確定靜態(tài)吸附下需要的樹脂量。

3.3 樹脂純化效果研究結(jié)果與結(jié)論

3.3.1 樹脂純化效果研究結(jié)果

分別用D1400大孔樹脂、PA03060聚酰胺樹脂、用HZ-841大孔樹脂等三種樹脂純化絮凝初步純化液配制的上樣藥液，記錄動態(tài)吸附數(shù)據(jù)，計算動態(tài)吸附的比吸附量(累計)數(shù)據(jù)，可繪制成系列曲線，反映D1400大孔樹脂、PA03060聚酰胺樹脂、用HZ-841大孔樹脂等三種樹脂“對不含醇原料”樣、“含醇原料”樣、“提取液”樣的動態(tài)比吸附量的情況，如圖3所示。

根據(jù)動態(tài)吸附數(shù)據(jù)，可對動態(tài)吸附轉(zhuǎn)移率、40mL 70%乙醇洗脫液中總黃酮含量、洗脫率、干浸膏量、干浸膏總黃酮含量等處理數(shù)據(jù)進行匯總并排序，列于表3中。

表3 三種樹脂對總黃酮的動態(tài)吸附和洗脫的匯總數(shù)據(jù)

3.3.2 樹脂純化效果研究結(jié)論

(1)動態(tài)吸附速率明顯比靜態(tài)吸附速率快

根據(jù)圖1，在2h時三種樹脂的靜態(tài)比吸附量在6～8.5 mg/g之間。而根據(jù)圖3，在1h(6×10min)時三種樹脂的動態(tài)比吸附量在13～16 mg/g之間。動態(tài)吸附明顯比靜態(tài)吸附快。

(2)三種樹脂的動態(tài)吸附效果相差不大，以PA03060聚酰胺樹脂最優(yōu)

根據(jù)圖3，對淫羊藿藥液(含醇)動態(tài)吸附能力由大到小順序：

PA03060聚酰胺樹脂>HZ-841大孔樹脂>D1400大孔樹脂。

(3)三種樹脂的洗脫效果以HZ-841大孔樹脂最佳

根據(jù)表3，從洗脫效果看：

HZ-841大孔樹脂>D1400大孔樹脂>PA03060聚酰胺樹脂，即說明PA03060聚酰胺樹脂能更容易吸附總黃酮，但不容易被脫附下來。

4 HZ-841樹脂純化工藝條件的研究結(jié)論

4.1 HZ-841樹脂純化工藝研究數(shù)據(jù)

樹脂純化工藝研究正交試驗數(shù)據(jù)，如表4所示。

表4 樹脂純化研究中正交試驗的原始數(shù)據(jù)

4.2 HZ-841樹脂純化研究結(jié)論

4.2.1 工藝條件優(yōu)化組合

綜合干浸膏中總黃酮產(chǎn)量的方差分析和干浸膏中總黃酮含量的方差分析，考慮到因素C(第三梯度洗液乙醇濃度)在干浸膏中總黃酮含量的方差分析中為作用顯著以選C2(70%乙醇)好，而在干浸膏中總黃酮產(chǎn)量的方差分析中也作用顯著以選C3(95%乙醇)好，存在矛盾，但從利用回收的純度偏低的乙醇和提高干浸膏中總黃酮含量考慮，因而第三梯度洗液乙醇濃度可取前兩者折中，即選擇85%乙醇。這樣正交試驗研究的工藝條件優(yōu)化組合為：上樣液過柱流速0.3mL/min，20%的醇洗液用量40mL，第三梯度乙醇洗脫液濃度85%(v%)，第三梯度乙醇洗脫液的用量40mL 。

4.2.2 HZ-841樹脂純化的完整工藝條件

2g HZ-841大孔樹脂，總黃酮含量2000ug/mL的總黃酮提取液30mL，流速0.3mL/min動態(tài)上樣(30mL上樣液動態(tài)吸附1h)后，分別以80mL水和40mL 20%乙醇、40mL85%乙醇、20mL 95%乙醇進行梯度洗脫、流速1.5mL/min 。

最優(yōu)條件下，利用HZ-841樹脂純化提取液，得到干浸膏收率3.25%，其中總黃酮含量71.8%，淫羊藿苷含量9.44% 。若原料提取液先由絮凝法初步純化，再用HZ-841大孔吸附樹脂純化，得干浸膏收率2.30%，其中總黃酮含量76.2%，淫羊藿苷含量10.30% 。產(chǎn)品純度能滿足，用于制備預防和治療抑郁癥的藥物[2]和抗骨質(zhì)疏松新藥[3]的需要。

[1]周國保.張文清.淫羊藿總黃酮微波提取工藝研究[J].江西化工,2013(3).

[2]南京大學.淫羊藿提取物在制備預防和治療抑郁癥藥物中的應用:中國,2004.10041720.9[P].2005-06-22.

[3]中國藥科大學.具有抗骨質(zhì)疏松作用的淫羊藿總黃酮的制備方法:中國,02138339.1[P].2003-03-19.

[4]張文清.絮凝法在丹參口服液制備中的應用[J].華東理工大學學報,1996,22(1):108-113.

[5]趙大洲.淫羊藿總黃酮的提取工藝、質(zhì)量標準研究及分離鑒定[D].中國海洋大學,2005.